骨髓炎状态下成骨诱导大鼠骨髓间充质干细胞转录组的测序分析

doi:10.12307/2023.387

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (15): 2333-2338.doi: 10.12307/2023.387

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骨髓炎状态下成骨诱导大鼠骨髓间充质干细胞转录组的测序分析

文虹杰1，陈仲1，杨华刚1，徐永清2

1云南大学附属医院骨科，云南省第二人民医院骨科，云南省昆明市 650021；2中国人民解放军联勤保障部队第920医院骨科，云南省昆明市 650021

收稿日期:2022-04-27 接受日期:2022-07-14 出版日期:2023-05-28 发布日期:2022-10-17
通讯作者: 徐永清，博士，主任医师，中国人民解放军联勤保障部队第920医院骨科，云南省昆明市 650021
作者简介:文虹杰，男，1984 年生，湖南省永州市人，汉族，2021年昆明医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨创伤临床与基础研究。
基金资助:
云南省基础研究计划昆医联合专项－面上项目(202201AY070001-274)，项目负责人：文虹杰；云南省教育厅科学研究基金项目(2022J0016)，项目负责人：文虹杰；国家自然科学基金面上项目(82072392)，项目负责人：徐永清

Transcriptome sequencing analysis of osteogenic rat bone marrow mesenchymal stem cells induced by osteomyelitis

Wen Hongjie1, Chen Zhong1, Yang Huagang1, Xu Yongqing2

1Department of Orthopedic and Trauma Surgery, Affiliated Hospital of Yunnan University, Second People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650021, Yunnan Province, China; 2Department of Orthopedic Surgery, 920 Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650021, Yunnan Province, China

Received:2022-04-27 Accepted:2022-07-14 Online:2023-05-28 Published:2022-10-17
Contact: Xu Yongqing, MD, Chief physician, Department of Orthopedic Surgery, 920 Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650021, Yunnan Province, China
About author:Wen Hongjie, MD, Attending physician, Department of Orthopedic and Trauma Surgery, Affiliated Hospital of Yunnan University, Second People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650021, Yunnan Province, China
Supported by:
Kunming Medical Joint Special Project of Basic Research Program of Yunnan Province, No. 202201AY070001-274 (to WHJ); Scientific Research Foundation of Yunnan Education Department, No. 2022J0016 (to WHJ); National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82072392 (to XYQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
葡萄球菌A蛋白：是存在于葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白。它可与人类和多种哺乳动物IgG的Fc段结合，具有抗吞噬、促细胞分裂、引起超敏反应、损伤血小板等多种生物学活性，是葡萄球菌的毒力因子之一。
转录组测序：是通过各种测序平台快速全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，可以用于研究基因表达量、基因功能、结构、可变剪接和新转录本预测等。目前，转录组测序已经被广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。

背景：近来发现骨髓炎环境会显著抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，进而对骨形成和骨代谢造成影响，但其具体的作用机制尚不十分清楚。
目的：通过对葡萄球菌A蛋白作用下诱导成骨分化的大鼠骨髓间充质干细胞进行转录组分析，寻找潜在差异表达长链非编码RNA(lncRNA)及相关调控网络。
方法：将大鼠骨髓间充质干细胞分为实验组和对照组，前者在葡萄球菌A蛋白(1 μg/mL)模拟的骨髓炎环境下成骨诱导分化7，14 d，后者正常成骨诱导分化7，14 d；通过茜素红染色以及碱性磷酸酶活性检测观察两组细胞成骨诱导分化情况；收集两组细胞进行转录组测序，进行GO、KEGG生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR进一步验证差异表达lncRNA。
结果与结论：①成骨诱导分化7，14 d，对照组茜素红着色面积均高于实验组，对照组碱性磷酸酶活性明显高于实验组(P < 0.01)；②转录组测序结果显示328个lncRNAs表达差异，其中显著上调的184个，显著下调的144个；③基因本体富集分析发现差异表达基因功能主要涉及生物过程、细胞组分以及分子功能，KEGG富集分析发现主要参与的信号转导途径有肿瘤坏死因子信号通路、MAPK信号通路、肠道炎症疾病通路等，与骨形成、骨代谢相关；④选取与成骨分化相关的差异表达明显的6个lncRNAs，qPCR验证后发现ENSRNOT00000092811、TCONS_00023877、XR_001836916.1与高通量测序中的表达趋势一致；⑤结果表明，多个lncRNA参与骨髓炎状态的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力调节，且可能通过信号转导途径肿瘤坏死因子信号通路、MAPK信号通路等发挥作用。
https://orcid.org/0000-0003-2381-3939 (文虹杰)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓炎, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, 转录组测序, lncRNA

Abstract: BACKGROUND: Recently, osteomyelitis environment has been found to significantly inhibit the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, thereby affecting bone formation and bone metabolism, but the specific mechanism remains unclear.
OBJECTIVE: Transcriptome analysis was conducted on rat bone marrow mesenchymal stem cells with osteogenic differentiation induced by staphylococcal protein A to search for potential differentially expressed lncRNAs and related regulatory networks.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells of rats were divided into experimental group and control group. The former group was induced osteogenic differentiation for 7 and 14 days in staphylococcal protein A (1 μg/mL) (to simulate osteomyelitis environment), while the control group was induced osteogenic differentiation for 7 and 14 days without any treatment. The content detection of alkaline phosphatase and alizarin red staining were used to observe the osteogenic induction of the cells. Two groups of cells were collected for transcriptome sequencing, gene ontology and KEGG bioinformatics analysis. Differential expression levels of lncRNAs were further verified by real-time fluorescence quantitative PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 7 and 14 days of osteogenic differentiation, the staining area of alizarin red in the control group was larger than that in the experimental group, and the alkaline phosphatase activity in the control group was significantly higher than that in the experimental group (P < 0.01). (2) Transcriptome sequencing results found 328 lncRNAs with significant differential expression level, with 184 significantly up-regulated and 144 significantly down-regulated. (3) Gene enrichment analysis showed that the function of differentially expressed genes mainly involved biological process, cell classification and molecular function. KEGG enrichment analysis found that the main signal pathways included tumor necrosis factor, MAPK and intestinal inflammatory disease signaling pathways, which were related to bone formation and bone metabolism. (4) Six differentially expressed lncRNAs related to osteogenesis differentiation were selected, and the expression trends of ENSRNOT00000092811, TCONS_00023877, and XR_001836916.1 were consistent with high-throughput sequencing after qPCR validation. (5) The results showed that multiple lncRNAs were involved in the regulation of osteogenic differentiation ability of rat bone marrow mesenchymal stem cells in osteomyelitis, and they may play a role through signal pathway, such as tumor necrosis factor and MAPK signaling pathways.

Key words: osteomyelitis, bone marrow mesenchymal stem cell, osteogenic differentiation, transcriptome sequencing, lncRNA

中图分类号:

文虹杰, 陈仲, 杨华刚, 徐永清. 骨髓炎状态下成骨诱导大鼠骨髓间充质干细胞转录组的测序分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2333-2338.

Wen Hongjie, Chen Zhong, Yang Huagang, Xu Yongqing. Transcriptome sequencing analysis of osteogenic rat bone marrow mesenchymal stem cells induced by osteomyelitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(15): 2333-2338.

图/表（结果） 7

2.1 茜素红染色及碱性磷酸酶活性成骨分化诱导7，14 d后行茜素红染色，两组细胞茜素红着色面积存在差异，对照组在各时间点茜素红着色面积均高于实验组，见图1A；成骨分化诱导7，14 d，对照组碱性磷酸酶活性明显高于实验组，差异有显著性意义(7 d：t=18.26，P < 0.01；14 d：t=21.81，P < 0.01)，见图1B。

2.2 葡萄球菌A蛋白作用下的骨髓间充质干细胞鉴定及炎症指标水平通过流式细胞仪对培养7，14 d的细胞表面抗原进行检测，结果显示低表达CD45，CD34， CD19，表达率≤2%，高表达CD105，CD90，CD73，表达率≥95%，符合骨髓间充质干细胞的特征。ELISA检测细胞炎症因子白细胞介素1、白细胞介素6、干扰素γ的分泌情况，结果显示实验组在7，14 d各项炎症指标均高于对照组(P < 0.05)，见图2。

2.3 差异表达基因统计及基因本体、KEGG富集分析根据阈值(Foldchange > 1.5，t检验 P≤0.05)进行筛选，共发现328个差异lncRNA，其中上调的有184个，下调的有144个，部分见表1。然后进一步根据基因功能特点筛选获得与成骨分化、骨形成、骨代谢相关的lncRNA，其中与成骨分化相关的ENSRNOT 00000092811、XR_001838005.1、XR_001838223.1、TCONS_00026762、XR_001838342.1下调，而XR_001836916.1上调；与骨代谢密切相关的TCONS_00023877上调，见图3。

对差异表达基因进行基因本体富集分析，以探究这些差异表达基因的生物学功能。在前30项显著富集中，有10项属于生物过程类(前10项分别是：白细胞分化、DNA损伤相关内在凋亡信号通路、轴突再生、钙离子跨膜转运的正调控作用、负调控蛋白定位到细胞核、RNA聚合酶的转录负调控、肌肉拉伸反应、细胞对渗透压的反应、中枢神经系统投射神经元轴突形成、RNA聚合酶Ⅱ对pri-miRNA转录的正向调控)，10项属于细胞组分类(网格蛋白、转录因子AP-1复合物、轴突的初始部分、核常染色质、细胞核、郎飞氏结、L型电压门控钙通道复合物、组蛋白甲基转移酶、肌节与细胞膜连接成分、核染色质)，10项属于分子功能类(激活转录因子结合的RNA聚合酶Ⅱ、核糖体小亚基结合、miRNA的绑定、参与房室结细胞的电压门控钙通道活性、单链RNA绑定、蛋白质绑定桥接、RNA聚合酶Ⅱ转录共激活因子活性、R-SMAD绑定、HMG区域结合、高电压门控钙通道活性)，见图4A。结果显示，差异表达基因与细胞发育和代谢过程密切相关。
KEGG 富集分析发现，这些差异表达基因分布在139条通路中。主要参与的信号转导途径分别是肿瘤坏死因子信号通路、MAPK信号通路、肠道炎症疾病、白细胞介素17信号通路、破骨细胞分化、B细胞受体、T细胞受体、线粒体自噬、甘油磷脂代谢通路，见图4B。这些结果表明，葡萄球菌A蛋白模拟的骨髓炎环境影响了骨形成与骨代谢的多个信号通路。

2.4 qPCR验证将选出的与成骨分化及骨代谢密切相关的6个lncRNAs(ENSRNOT00000092811、TCONS_00023877、TCONS_00026762、XR_001836916.1、XR_001838005.1、XR_001838223.1)，通过qPCR测定其相对表达水平。结果显示，与对照组相比，实验组中ENSRNOT00000092811相对表达水平下调，TCONS_00023877、XR_001836916.1相对表达水平上调(P < 0.05)，TCONS_00026762、XR_001838005.1、XR_001838223.1的表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5和表2。

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引言

慢性骨髓炎的诊治一直是临床骨科最棘手的难题之一。它是一种波及骨与髓腔的感染性疾病，可由创伤、手术等多种原因导致，因其预后往往较差而给个人和社会带来严重的负面影响[1-5]。尽管目前在慢性骨髓炎临床诊断和治疗方面取得了一定的进展，但其具体发生发展的机制尚在研究阶段，尤其是各种细菌对骨形成和骨代谢的影响还不清楚[6]。目前认为金黄色葡萄球菌是引起骨髓炎的最常见致病菌[7]，其表面的葡萄球菌A蛋白是最强毒力因子[8-9]。体外细胞实验研究表明，葡萄球菌A蛋白会显著抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，从而对骨形成和骨代谢产生影响，但其具体的作用机制尚不十分清楚[10-13]。同时，有大量研究表明非编码RNA通过多种信号通路及调控因子影响着骨髓间充质干细胞的成骨分化[14-17]。然而，有关非编码RNA对骨髓炎状态下骨髓间充质干细胞成骨分化能力影响的研究并不多见。
既往有关骨髓炎发病机制的研究均致力于分析成骨、破骨细胞的影响，且未对致病菌的毒力因子进行单独研究。作者在前期研究中最早将葡萄球菌A蛋白作为单一的毒力因子进行研究，分析其对成骨、破骨细胞以及骨髓间充质干细胞的影响，进而分析骨髓炎微环境中致病菌对骨形成与骨代谢的影响。通过体外细胞实验发现lncNON HSAT009968对葡萄球菌A蛋白作用下人骨髓间充质干细胞的成骨分化能力有明显抑制作用[8]，但由于伦理学因素限制以及跨物种排异反应等原因，无法有效验证该长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在真实骨髓炎环境中发挥的作用，而通过大鼠骨髓间充质干细胞进行该方面的研究具有细胞来源广泛、可真实模拟骨髓炎环境等优势。该研究通过对葡萄球菌A蛋白作用下成骨诱导的大鼠骨髓间充质干细胞中的lncRNA进行转录组测序以及生物信息学分析，期望在骨髓间充质干细胞中发现新的调控成骨分化的目标靶点，从而为炎症状态下非编码RNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化的机制以及骨髓炎的发生发展机制研究提供一些思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计生物信息学及转录组分析。
1.2 时间及地点实验于2020年5月至2021年8月在云南大学附属医院医学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞培养及鉴定从中科院上海细胞库购买大鼠骨髓间充质干细胞株，流式细胞仪检测CD45、CD34、CD19表达率≤2%，CD105、CD90、CD73表达率≥ 95%，原代培养7-10 d，传至3代用于实验。该研究经过云南大学附属医院医学伦理委员会批准(2020124)。
1.3.2 实验主要试剂和仪器间充质干细胞无血清完全培养基(广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司)；胰蛋白酶(广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司)；二甲基亚砜(Sigma-Aldrich，德国)；PBS(Biological Industries，以色列)；嘌呤霉素(MCE，美国)；间充质干细胞成骨诱导分化培养试剂盒(广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司)；葡萄球菌A蛋白(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；茜素红染色液(0.2%，pH8.3)(北京索来宝生物科技有限公司)；碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；细胞培养皿(耐思生物科技有限公司)；细胞培养板(Corning，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养及实验分组将大鼠骨髓间充质干细胞样本分为2组：实验组在间充质干细胞成骨诱导分化培养基中加入葡萄球菌A蛋白(1 μg/mL)模拟炎症环境[18]，培养7，14 d；对照组间充质干细胞成骨诱导分化培养基中不加入葡萄球菌A蛋白，培养7，14 d。
1.4.2 指标检测
(1) 碱性磷酸酶活性检测：成骨诱导分化7，14 d，吸弃培养液，PBS洗涤两三遍，吸弃液体，每孔加入100 μL 0.2% TritonX-100，37 ℃孵育 30 min，显微镜下可观察到细胞破碎，每孔加入缓冲液和基质液各100 μL，37 ℃放置30 min，加入150 μL显色液，酶联免疫检测仪520 nm波长处检测吸光度值。实验组和对照组各设5个复孔。
(2)茜素红染色：以PBS或Tris-HCl配制0.1%茜素红溶液，其pH值均调为8.3。成骨诱导分化7，14 d，吸弃培养液，以体积分数70%乙醇固定细胞1 h，双蒸水洗3次，茜素红溶液染色30 min，双蒸水洗3遍，置于显微镜下观察钙结节形成情况。
(3) 葡萄球菌A蛋白作用下的骨髓间充质干细胞鉴定及炎症指标检测：收集成骨诱导分化7，14 d的细胞进行细胞表面抗原检测。收集成骨诱导分化7，14 d的细胞，采用ELISA检测细胞炎症因子白细胞介素1、白细胞介素6、干扰素γ的分泌情况。
1.4.3 高通量测序技术成骨诱导分化14 d，对3个实验组和3个对照组样本使用TRIzol分离总RNA。然后进行RNA质量检测，去除rRNA，RNA片段化，反转录生成cDNA，末端补平，加A尾，加接头PCR扩增，最后Illumina平台上机测序。
1.4.4 差异表达 lncRNA 分析利用参考转录本做库，用序列相似性比对的方法求各转录本在各样本中的表达丰度。使用软件bowtie2和eXpress进行lncRNA表达水平分析，具体内容包括差异lncRNA筛选、lncRNA特征分析、lncRNA家族分析、靶标miRNA预测、关系网络构建。然后通过clusterProfilerR
软件进行差异lncRNA分析[19]，步骤包括：差异lncRNA筛选、火山图绘制、差异表达聚类、差异lncRNA临近基因GO富集分析、差异lncRNA临近基因KEGG富集分析。进行差异lncRNA筛选时，利用DESeq软件对各个样本lncRNA的数目进行标准化处理(采用BaseMean值来估算表达量)，计算差异倍数，并采用NB(负二项分布检验的方式)对reads数进行差异显著性检验，最终根据差异倍数及差异显著性检验结果(Fold change > 1.5，t检验，P≤0.05)来筛选差异lncRNA。
GO富集分析方法：将全部 lncRNA 临近基因作为背景列表，差异 lncRNA 临近基因列表作为从背景列表中筛选出来的候选列表，利用超几何分布检验计算代表 GO 功能集在差异 lncRNA 临近基因列表中是否显著富集的 P 值，再对P 值经Benjamini & Hochberg 多重检验纠正后得到 q值。
KEGG富集分析方法：利用 KEGG 数据库对差异 lncRNA 临近基因进行通路分析(结合 KEGG 注释结果)，并用超几何分布检验的方法计算每个通路条目中差异 lncRNA 临近基因富集的显著性。使用R语言绘制差异表达lncRNA火山图和热图。
1.4.5 实时荧光定量PCR 根据基因功能特点分析，从差异表达的lncRNA中选出直接或间接与成骨分化、骨代谢密切相关的基因进行qPCR验证。两组细胞培养14 d后，用Trizol regent (Invitrogen Life Technologies，美国)分别从实验组与对照组细胞中提取总RNA，并使用反转录试剂盒从RNA中转录cDNA。使用Roche(德国) Light Cycler 480 II实时荧光定量PCR仪进行实时PCR。反应条件如下：在95 ℃下孵育2 min，然后在45个循环中于95 ℃进行10 s，60 ℃进行34 s和72 ℃进行30 s。以GAPDH为管家基因，采用标准曲线法计算目的lncRNA基因的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①两组细胞中碱性磷酸酶活性以及钙结节形成情况；②两组细胞转录组测序分析结果；③两组细胞差异表达lncRNA进一步采用qPCR验证的结果。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 8对所有数据进行统计分析。两组之间比较采用Student-t检验，所有实验数据均重复3次以上，P < 0.05 为差异有显著性意义。采用Fisher精确检验法进行GO分析及KEGG 富集分析，多重检验校正后P < 0.05，说明存在显著富集。文章统计学方法已经通过云南大学附属医院生物统计学专家审核。

讨论

慢性骨髓炎严重增加了医疗负担，降低患者生活质量。长期以来慢性骨髓炎发生发展的机制尚不明确，迄今为止仍缺乏有效的治疗手段。有越来越多的研究提示炎性环境能够影响骨髓间充质干细胞的成骨分化能力[12-13，20-22]。由于骨髓炎致病菌的毒力情况非常复杂，通常针对致病菌某个毒力因子来进行研究[23-27]。此次研究通过建立葡萄球菌A蛋白模拟的骨髓炎细胞模型，基于转录组测序数据的生物信息学分析能够从整体基因转录水平上探究实验组与对照组差异表达的基因在骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用。
此次研究结果显示，在葡萄球菌A蛋白作用下骨髓间充质干细胞成骨分化过程中确实引起了许多非编码RNA 的差异性表达。测序结果显示差异表达的lncRNA有328个，通过qPCR进一步验证发现ENSRNOT00000092811、TCONS_00023877、XR_001836916.1确实存在差异性表达。测序结果与验证结果存在差异的原因可能如下：①该研究采取3V3的样本测序模式，样本数量偏少，可能会影响测序结果的准确性；②qPCR的引物设计存在一定的不确定性，可能会影响检测结果；③用于测序和验证的细胞代数、状态以及操作流程的细小差异也会对结果造成影响。另外，功能富集分析发现lncRNA ENSRNOT00000092811参与成骨分化有关的MAPK信号通路；而且根据lncRNA-miRNA靶标互作网络分析，ENSRNOT00000092811与miR-1199-3p存在互作关系，推测炎症环境中miR-1199-3p与ENSRNOT00000092811结合，进而影响MAPK信号通路中关键分子的表达，从而对骨髓间充质干细胞成骨分化产生一定影响。另外，TCONS_ 00023877与破骨细胞分化以及骨代谢有关，且与miR-1306-5p存在互作关系；XR_001836916.1则与成骨分化密切相关的信号通路MAPK、Wnt有关，并且与炎症反应相关通路NF-kappaB也有关系，且miR-532-3p与XR_001836916.1存在互作关系。有研究表明，miR-532-3p可以通过下调ETS1表达来抑制成骨分化[28]，作者推测miR-532-3p与XR_001836916.1结合，并通过影响成骨分化信号通路中关键分子的表达，进而影响成骨分化。以上均提示，该研究发现的lncRNA可能与炎症环境中骨髓间充质干细胞的成骨分化存在一定联系，为进一步寻找分子调控网络及后期研究提供了基础。
随着高通量测序技术与表观遗传学的快速发展，有关非编码RNA影响骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究也越来越多。CUI等[18]发现lncRNANONHSAT009968通过Wnt3a/Wnt/β-catenin轴抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化。另一项研究发现，Lnc-RNA BLACAT1在炎性骨髓间充质干细胞中表达增加，而敲低BLACAT1则促进了针对miR-142-5p的骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化[29]。BEHERA等[30]发现骨髓间充质干细胞外泌体lnc-H19作为海绵吸收miR-106并调节血管生成因子Angpt1的表达，进而通过lnc-H19/Tie2-NO信号影响成骨和血管生成。BAI等[31]研究证明lncRNA (HCAR)通过上调肥大软骨细胞中基质金属肽酶13和血管内皮生长因子A的表达来促进软骨内骨修复。但是，目前有关lncRNA在炎症环境中对骨髓间充质干细胞成骨分化影响的研究还比较少，尚缺乏从非编码RNA角度去研究骨髓炎的发生、发展机制。在前期研究的基础上，该研究首次通过大鼠骨髓间充质干细胞测序分析试图寻找影响炎症环境中成骨破骨过程的lncRNA，以期为研究骨髓炎的发病机制提供思路。
同时，该研究存在以下局限性：首先，为了方便后期进行体内实验，选取大鼠而不是人的骨髓间充质干细胞进行研究，并且是通过葡萄球菌A蛋白模拟骨髓炎环境，与临床的骨髓炎环境存在一定差异；另外，该研究是在有限样本测序的基础上结合生物信息学分析，筛选出特定差异表达的lncRNA 进行实验验证，可能存在某些数据的不足。
综上所述，该研究结果表明，炎症环境中的lncRNA可能通过调控MAPK信号通路、破骨细胞分化信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等与骨代谢、骨形成相关的信号通路来影响骨髓间充质干细胞成骨分化，进而影响骨代谢与骨形成。将在后续研究中对差异表达的lncRNAs展开进一步的通路验证，并试图阐明其互作机制，为探索骨髓间充质干细胞成骨分化能力影响骨髓炎发生发展的病理生理机制提供思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓炎状态下成骨诱导大鼠骨髓间充质干细胞转录组的测序分析

Transcriptome sequencing analysis of osteogenic rat bone marrow mesenchymal stem cells induced by osteomyelitis

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