2.1  骨髓间充质干细胞的形态  全换液后继续培养5 d，镜下观察可见细胞开始呈现梭形或者圆形，视野下散在分布，见图1A；7 d时镜下可见原代细胞快速增殖，已经表现出长梭形的形态，形成细胞集落，见图1B；10 d时镜下观察细胞呈漩涡状生长，几乎全部融合，大小形态均匀一致，见图1C。

2.2  流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物  第3代骨髓间充质干细胞表面标志物CD29、CD90阳性表达、CD45阴性表达，纯度为99.14%，表明培养的细胞为骨髓间充质干细胞，见图2。

2.3  成骨诱导后的细胞形态  成骨诱导7 d，实验组细胞围绕在多孔羟基磷灰石支架周围，已有长梭形细胞铺满皿壁，支架上的微渠表面可见细胞铺展，见图3A；空白对照组细胞呈集簇状生长，螺旋状或漩涡状分布，呈典型的长梭形，类似成纤维细胞样形态，大小均匀一致，见图3B。

2.4  RNA质检结果  提取的RNA纯度较好，见表3；条带清晰锐利，吸光度比值处于正确范围，见图4，由此认为提取的RNA可进行后续的测序建库。

2.5  两组细胞在成骨诱导7 d时成骨基因的表达  成骨诱导7 d后，实验组BMP2、ALP和Runx2 mRNA表达上调，与空白对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5，可以看出空白对照组和实验组皆出现了骨髓间充质干细胞的骨向分化，其中多孔羟基磷灰石支架材料介导的实验组多项成骨指标比空白对照组表达增强。

2.6  miRNA差异性表达结果  miRNA测序分析发现两组有30个差异表达的miRNAs(13个上调，17个下调)，且至少有2倍的变化，见表4，图6。

2.7  差异表达miRNA功能分析  GO是一种根据注释信息结合的基因选择性算法，作为辅助生物信息分析的一种功能分类体系，其在国际上得到公认，为差异表达基因提供一套标准的词汇表，以全面地囊括个体中基因和基因产物的属性。GO总共有3个本体，分别为分子功能(Molecular Function)、生物过程(Biological Process)和细胞组分(Cellular Component)。使用topGO进行top10差异miRNAs的靶基因GO分析以推断它们参与的分子功能，进而推断miRNA的功能，见图7。

对31个差异表达的miRNA的目标基因行GO分析得到623条Go terms，其中包括了387个生物学过程，上调的14个miRNA靶基因主要参与的生物学过程有生物学调节、细胞基因表达、基因表达调节等，主要包括NF-κB、Toll样受体9、细胞间黏附、白细胞介素1调节、血管生成、Hippo等信号通路。

2.8  qRT-PCR验证测序结果  为了进一步验证测序结果的真实精确，在实验组最终分析数据中选取miRNA上调最明显的2个miRNA分子进行实时荧光定量qPCR，纳入实验的是miR-210-3p、miR-146a-5p。空白对照组和实验组培养7 d的总RNA样本，重复测量3次，利用qRT-PCR检测miR-210-3p、miR-146a-5p的相对表达量，结果显示miRNA-210-3p在实验组上调15倍，miR-146a-5p在实验组上调10倍，且差异有显著性意义(P < 0.05)，见图8。由此可见qRT-PCR与miRNA测序结果一致，表明上述高通量测序的结果是可信的。

大面积骨缺损、骨量不足是目前口腔种植亟待解决的热点问题，如何实现缺损骨组织的快速修复与功能重建是目前临床医学迫切需要解决的重大课题。临床上治疗骨缺损的最佳方式是对患者进行自体骨移植，但需开辟第二术区，患者接受度低，故而限制了其广泛应用；而采用同种异体骨移植存在传播疾病的风险，且骨诱导能力和生物力学性能欠佳；异种骨来源广泛、制造成本低、易于获取和加工、具有良好的生物学性能和骨传导性，但是存在免疫排斥反应的风险。用于组织再生的生物材料支架为骨缺损修复带来了新的希望。临床上常常使用各种生物材料支架，并且致力于改善其成骨作用，包括增强支架材料的生物相容性^[1]，利用干细胞或诱导性多能干细胞以及调控各种生长因素因子等^[2]。上述组织工程方法有利于骨组织再生，并有助于在再生过程中与宿主组织整合，恢复缺失功能^[3]。因此研究生物材料诱导成骨的具体调控机制，为支架材料的改性提供理论基础。

骨诱导是一个精细调控的过程，涉及转录和转录后基因表达调控^[4-8]。研究显示，miRNAs是转录后水平基因表达的关键调节因子，可调控mRNA快速改变靶蛋白水平。MiRNAs是长度约为22个核苷酸双链非编码微小内源性RNA，其通过与mRNA的3'-UTR上的特定序列碱基配对靶向结合，使下游基因上调或者沉默多种基因的表达，在组织分化过程起到必不可少的作用^[9-12]。

课题组前期研发了已获得自主知识产权的新型微沟槽多孔羟基磷灰石支架，其可在体外细胞培养中提高成骨基因的表达，在比格犬颌骨、背部肌袋及腹腔中无任何种子细胞和生长因子的情况下实现原位成骨和异位成骨^[13-15]。羟基磷灰石的诱导骨再生能力取决于材料本身的表面形貌、结构、成分、孔径和孔隙率。课题组前期采用不同粒径的糖球颗粒作为造孔剂制备不同宏孔孔径和不同贯通孔径尺寸的微沟槽羟基磷灰石支架，结果发现孔径为750-900 μm的多孔羟基磷灰石支架最有利于诱导血管生长和新骨形成，初步探索了宏孔孔径对骨形成和血管生长的影响^[13]。此外，材料表面的沟渠结构可以通过接触导向引导细胞在沟渠内定向排列，并且控制细胞在材料沟渠表面定向沉积生长，从而促进骨形成^[16-17]。这一系列证据表明羟基磷灰石支架孔隙利于富集各种内源性骨生长因子，诱导骨髓间充质干细胞趋化、归巢以及向骨前体细胞转化，但羟基磷灰石本身诱导成骨效果有待提高，解决这一难题最根本的是准确揭示材料介导成骨的深层次机制，但迄今对羟基磷灰石材料本身在miRNA水平介导成骨的机制仍鲜少被报道。基于前期的研究基础，作者拟探讨新型微沟槽羟基磷灰石体外诱导间充质干细胞成骨分化的miRNA分子差异表达，并利用生物信息学和qRT-PCR证明新型微渠多孔羟基磷灰石支架可通过调控miRNA促进骨髓间充质干细胞的分化。

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1.1  设计  运用miRNA高通量测序技术分析多孔羟基磷灰石支架材料介导大鼠骨髓间充质干细胞成骨矿化过程中相关miRNA表达谱的变化差异并进行GO分析，筛选出两组表达差异明显的miRNA分子进行qRT-PCR验证。

1.2  时间及地点  实验于2018年6月至2019年6月在四川大学生物治疗国家重点实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  SPF级雄性SD大鼠18只，4周龄，体质量(60±10) g，由四川省人民医院实验动物中心提供，许可证号：SYXK(川)2018-110。

1.3.2  实验试剂与耗材  胎牛血清、DMEM培养基、青霉素/链霉素(Sigma，美国)；成骨诱导液(含体积分数为5%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、10 mol/L β-磷酸甘油钠、   50 mg/L L-抗坏血酸的DMEM培养基)(Gibco，美国)；   2.5 mmol/L dNTP混合液(dATP、dGTP、dCTP和dTTP各2.5 mmol/L)(HyTest Ltd)；BCA蛋白试剂盒(碧云天，中国)；RNA酶抑制(Epicentre)；Trizol Reagent(Invitrogen，美国)；PrimeScript^® RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂(Takara，大连)；SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ试剂盒(Takara，大连)；PE anti-mouse CD45 Antibody、PE anti-mouse CD29 Antibody、PE anti-mouse CD90 Antibody(BioLegend，美国)。

1.4  实验方法

1.4.1  生物陶瓷支架的制备  由西南交通大学材料科学与工程学院采用具有自主知识产权的甲壳素高分子溶胶-凝胶体系及W/O乳化法制备出三维多孔羟基磷灰石陶瓷支架。支架材料规格：直径6 mm，高3 mm；孔隙率80%；孔径750-900 μm；渠径25-30 μm。高温高压灭菌处理后用于后续实验。

1.4.2  原代骨髓间充质干细胞的培养及传代  SD大鼠麻醉后处死，分离双侧股骨和胫骨，剪开骨骺端，纵向反复冲洗骨髓腔至发白，获得细胞悬液，离心弃掉上清液，细胞接种于含有青、链霉素的DMEM培养基的90 mm培养皿，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂恒温培养箱中，记为原代，3 d后换液，7 d传代。取第3代细胞用于后续实验。

1.4.3  流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞  胰酶消化第3代处于对数生长期骨髓间充质干细胞，1 200 r/min离心   5 min，弃掉上清液，PBS洗涤细胞2次。取5×10⁵个细胞于流式管中，用100 µL PBS重悬成单细胞悬液，加入抗- CD90-APC、抗-CD29-APC、抗-CD45-PE抗体反复吸打混匀，4 ℃条件下避光孵育30 min，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，PBS洗涤细胞1次，用300 µL PBS重悬成单细胞悬液，流式细胞仪检测CD45、CD90、CD29抗原的表达，同时设立PE同型阴性对照，数据使用FlowJo流式细胞软件进行结果分析。

1.4.4  骨髓间充质干细胞的体外诱导分化  将第3代骨髓间充质干细胞悬液100 μL(细胞浓度为2×10⁶ L^-1)接种至多孔羟基磷灰石支架表面，接种完毕之后向每个培养皿中加入4 mL含体积分数10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基，设为实验组。空白对照组仅加入等体积的骨髓间充质干细胞悬液以及含体积分数10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基。每组3个样本，均放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂恒温培养箱中培养。每天在倒置相差显微镜下观察支架周围细胞的生长情况，每3 d换1次培养液，24 h后待细胞基本黏附时加入适量的成骨诱导液(含体积分数为5%胎牛血清，10 nmol/L地塞米松，10 mol/L β-磷酸甘油钠、50 mg/L L-抗坏血酸的DMEM培养液)于恒温培养箱中培养，此时记为0 d，成骨诱导7 d时采用qRT-PCR检测成骨相关基因的表达。

1.4.5  RNA分离和qRT-PCR

(1)细胞总RNA的提取：按照Trizol Reagent说明书收集7 d支架/细胞共培养体系中的细胞总RNA，紫外分光光度计检测A₂₆₀/A₂₈₀比值介于1.8-2.0之间，琼脂糖凝胶电泳初步确定RNA的纯度、完整度及是否降解。

(2)RNA反转录为cDNA：参照TaKaRa反转录试剂盒说明书，在PCR仪上进行扩增，按10 μL体系，取500 ng RNA 进行反转录，设置反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；合成的cDNA于-20 ℃下长期保存。

(3)引物设计：根据NCBI Genebank中大鼠的ALP、OCN、BMP2、COL-1、Runx2以及GAPDH碱基序列，构建相应的引物序列并交由上海吉玛公司合成，见表1。

(4)RT-PCR反应体系配制方案：参照TaKaRa两步法RT-PCR试剂盒说明书进行。20 μL反应体系配比如下：SYBR^® Premix Ex Taq II(2×)10 μL，PCR Forward Primer (10 µmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer(10 µmol/L)  0.8 μL，cDNA 2 μL，ROX Reverse DYE Ⅱ 0.4 μL，dH₂O 6 μL。预变性95 ℃，15 s，变性温度为95 ℃/步，5 s，退火温度为60 ℃，30 s，重复变性和退火步骤40个循环。

1.4.6  miRNA高通量测序

(1)构建miRNA文库：根据标准样品准备流程，利用Oligo磁珠富集小RNA，配制15%PAGE胶，并以小RNA为模板在PAGE胶上进行电泳后按18-30个核苷酸的长度收集。利用T₄ RNA连接酶连接3'RNA配体，继续放于15%琼脂糖胶上进行电泳，分离出63-74个核苷酸长度片段，接下来将RNA反转录为cDNA，进行PCR扩增，然后进行产物末端修复，增加测序接头，纯化最后产物，构建文库完成。

(2)数据分析：标准化计算所有miRNA异构体的tag数和两组样品(有重复)间的P值和差异倍数(Fold Change)，并根据P值和差异倍数筛选差异miRNAs，绘制miRNA聚类图。利用miRNA生物信息学预测软件分析前10个差异miRNA的目标基因，并初步探索目标基因的GO和Pathway。

(3)miR-210和miR-146a的实时定量PCR：根据NCBI Genebank中人的miR-210和miR-146a以及U6的基因序列，设计相应的引物序列并交由上海吉玛基因公司合成，见表2。

(4)RT-PCR反应体系配制方案：参照TaKaRa两步法RT-PCR试剂盒说明书进行。20 μL反应体系配比如下：2×All-in-One^TM qPCR Mix 10 μL，miRNA qPCR Primer  (2 μmol/L) 2 μL，First-strand cDNA(dilute 1∶5) 2 μL，Universal Adaptor PCR Primer 2 μL，无RNA酶水4 μL，PCR扩增步骤同上，待反应停止后，将其放在冰上待用或-20 ℃存放备用。

1.5  主要观察指标  ①骨髓间充质干细胞的形态及表面标志物CD29、CD90、CD45的表达；②成骨诱导后的细胞形态及成骨相关基因表达。

1.6  统计学分析  独立重复实验3次，采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理分析，两样本中差异miRNA的表达水平采用2^-ΔΔCT法计算，采用两独立样本t 检验对两组数据进行统计分析，定量数据采用x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

国内外报道miRNA在调控成骨的信号通路中扮演着十分重要的角色，其通过靶向作用成骨负调节因子而促进成骨分化，或者靶向结合成骨通路上正向促进上调的因子而抑制成骨下游基因的转录。大量研究表明miRNA参与到错综复杂的成骨信号调控网络，与多条成骨相关通路存在密切的联系，miRNA的差异表达调控着成骨信号网络中上游基因及下游标志物的表达^[18-20]。多孔羟基磷灰石支架内部具有微米级的孔壁，孔壁表面设计的条纹样微渠结构可以为细胞黏附、生长提供微环境，改建细胞骨架，向成骨方向分化，促进成骨基因的转录^[13]。

ALP是成骨分化早/中期的标志物，培养第7天时可见两组的ALP皆出现了上调，表明成骨诱导液使得骨髓间充质干细胞进入到成骨分化阶段。在此次实验中，实验组与对照组BMP2和Runx2的表达出现明显差异。Runx2是成骨信号通路中关键的核心转录因子，启动下游的转录信号^[21]。BMP2是转化生长因子超家族中的一员，据报道其可以促进细胞外基质的分泌和矿化，从而促进干细胞分化为成骨细胞^[22]，促进异位骨组织的形成和软骨的形成^[23]。多孔羟基磷灰石支架特殊的微渠结构可能在骨分化早期通过上游miRNA分子调控激活Runx2，继而启动了骨髓间充质干细胞的成骨分化过程，在早期时促进ALP的表达。

研究发现多个miRNA作为成骨相关基因表达的转录后调节因子参与成骨信号通路^[24-26]。在该研究中，miR-210-3P和miR-146a均过表达。miR-210-3P过表达可诱导表达多种成骨细胞标记基因，包括BMP2、Runx2、ALP。这与HU     等^[27]的研究结果保持一致，发现miR-210-3P可以使骨髓间充质干细胞中HIF-1的表达增加，促进骨组织再生。miR-210-3P通过抑制AcvR1b来抑制转化生长因子β活性信号通路，从而成为成骨细胞分化的正调节剂^[28]，并在骨髓间充质干细胞存活中发挥关键作用^[29]。这些结果表明miR-210-3P可以作为一种新型的药物用于生物活性材料的表面修饰，增强并促进成骨作用。miR-146a可以促进骨髓间充质干细胞的迁移和分化，促进ALP和OCN的mRNA表达^[30]，这在miRNA水平上解释了微渠羟基磷灰石支架利于细胞的增殖和成骨分化^[13]。越来越多的证据表明，miR-146a作为先天免疫应答的负反馈调节剂，可抑制炎症因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素1β的产生^[31]。MATYSIAK等^[32]研究发现miR-146a通过靶向前列腺素E2负调节骨髓干细胞的免疫调节活性。课题组前期研究发现新型微渠多孔羟基磷灰石支架可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，并通过添加白细胞介素6逆转。白细胞介素6的减少有助于miR-214的下调，并随后上调p38/JNK通路，这可能有助于微渠多孔羟基磷灰石支架促进成骨^[33]。因此，作者猜想微渠多孔羟基磷灰石支架在基因水平、miRNA水平、免疫水平促进骨髓间充质干细胞成骨分化，并且3者之间存在密切联系。

综上所述，新型微渠多孔羟基磷灰石支架可以通过上调miR-210-3P和miR-146a表达，促进骨髓间充质干细胞的迁移、增殖和分化，但其具体的信号通路有待进一步研究。

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文题释义：

羟基磷灰石：是目前最为理想的生物活性材料，具有生物相容性、骨传导性和骨诱导性，植入人体后对组织无刺激和排斥作用，能与骨形成很强的化学结合，用作骨缺损的充填材料，能为新骨的形成提供支架，发挥骨传导作用，是理想的硬组织替代材料。

MicroRNA(miRNA)：是一类内生的、长度为20-24个核苷酸的单链小分子RNA，由具有发夹结构的70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，其可以通过几个miRNAs的组合在转录后水平精细调控基因的表达。

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大面积骨缺损、骨量不足是目前口腔种植亟待解决的热点问题，如何实现缺损骨组织的快速修复与功能重建是目前临床医学迫切需要解决的重大课题。近年来，大量的研究发现microRNAs(miRNAs)和anti-microRNAs(anti-miRNAs)在成骨信号通路中具有重要作用。据文献报道miRNA-26a、抗miRNA-31、抗miRNA-34a、miRNA-135、抗miRNA-138、抗miRNA-146a、miRNA-148b、抗miRNA-221和抗miRNA-335与骨组织工程的生物材料相整合，并应用于体内临界骨缺损的修复。这种通过miRNA/anti-miRNAs局部转染细胞，高效快速提高生物材料的成骨性能，为大面积骨缺损的修复和重建带来新的希望。因此，成骨过程中相关miRNAs的筛选和其具体分子作用机制的研究显得尤为重要，为生物活性材料的表面修饰提供实验基础。

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