2.1  骨髓间充质干细胞的形态变化及表型鉴定结果  原代细胞生长缓慢，形态多样；传代后细胞进入快速生长期，第3代细胞形态均一，为长梭形，排列有一定方向性，且呈漩涡状生长，见图1A-C。选取第3代细胞做流式表型鉴定，结果显示CD44、CD90为阳性表达，双阳性表达率为96.9%；CD34与CD44双染结果显示CD44阳性表达率为90.6%，CD34的阳性表达率为0.34%；CD34与CD90双染结果显示CD90阳性表达率为95.4%，CD34的阳性表达率为3.98%，见图1D-F。依据国际细胞治疗协会间充质干细胞分会提出的用于人来源间充质干细胞的鉴定标准^[9]，第3代细胞为纯度较高的骨髓间充质干细胞，可用于后续实验。

2.2  归肾丸水提物干预后骨髓间充质干细胞的形态变化  以80 mg/L组为例，将第3代细胞以60%密度种板，见图2A；干预后第1天，细胞密度未见明显改变，见图2B；第2天，细胞呈现缓慢增殖，并且发现质量浓度为80 mg/L干预组细胞生长旺盛，见图2C；干预后第3天细胞长满瓶底，见图2D；第4天极少部分细胞开始死亡，见图2E；第5天死亡细胞数增加，细胞密度降低，且逐渐由长梭形变成了多触角、多边形的细胞，见图2F。

2.3  不同质量浓度归肾丸水提物对骨髓间充质干细胞增殖的影响  以归肾丸水提物的质量浓度为横坐标，各组所测得的吸光度平均值为纵坐标，绘制细胞吸光度趋势图，当药物质量浓度<80 mg/L时，随着质量浓度的增加，测得的吸光度逐渐增加；当药物质量浓度>80 mg/L时，吸光度开始下降，最佳促增殖质量浓度为80 mg/L，见图3。归肾丸水提物干预骨髓间充质干细胞第1天时的吸光度值普遍较低，组间差异无显著性意义(P=0.38)，第3天时的吸光度值普遍较高，归肾丸水提物组与对照组间差异有显著性意义(P=0.000 2)，且同一浓度的吸光度值在前3 d呈现上升趋势，第4天开始下降，故最佳干预时间为3 d，见表1。

2.4  不同质量浓度归肾丸水提物对骨髓间充质干细胞PI3K、AKT蛋白表达的影响  PI3K/AKT信号通路参与调控骨髓间充质干细胞的生长、增殖、分化和凋亡等，采用Western blot方法检测PI3K、AKT的蛋白表达水平，归肾丸水提物各组细胞PI3K、AKT蛋白表达明显优于空白对照组，80 mg/L归肾丸水提物组PI3K、AKT蛋白表达量最高，各干预组与空白对照组间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4，表2。

骨髓间充质干细胞是骨髓中存在的一类多能干细胞, 具有多向分化潜能和较强的增殖能力^[1]，已经证明其能够在特定条件下定向分化为脂肪细胞^[2]、软骨细胞^[3]、成骨细胞^[4]、尿路上皮细胞^[5]、神经细胞等^[6]。肾精是构成人体最基本的物质，也是维持人体生命活动的根本。“肾精”的作用与骨髓间充质干细胞增殖、分化特性的相关性被越来越多的研究者所认同，两者有着密切的联系。从来源上看，骨髓间充质干细胞来源于精卵结合的受精卵，而肾精是先天孕育之精，二者均来自生命之源；从功能上看，肾精能促进机体的生长发育和维持各脏腑的功能，骨髓间充质干细胞作为多能干细胞，能增殖分化为多种组织和器官的细胞，二者均对维持机体正常活动起着重要作用；从生物特性上看，肾精与生俱来，在后天之精的协助下逐渐充盈至隆盛再到衰败，最后枯竭，而骨髓间充质干细胞从机体幼时至成年期逐渐增长，达到高峰后处于相对平稳状态，迈入老年时数量又逐渐减少，其分化能力及生物学功能均下降，二者均随着生命体的初始、生长、盛壮、衰老和死亡这一生长规律呈现出相似的转变。补肾中药对骨髓间充质干细胞的促增殖、诱导分化等方面的积极作用被更多的研究证实^[7-8]，但是补肾中药促进骨髓间充质干细胞增殖、分化的相关作用机制尚不明确。

因此，深入探讨“肾藏精，生髓”理论与干细胞学说的内在联系，研究补肾益精法对干细胞增殖、分化的影响，并从细胞分子水平验证其可能的作用机制，不仅可为相关方药的临床作用机制提供实验依据，为众多难治性疾病探寻有效的治疗方法，而且可为祖国医学“先天之精”与“肾藏精”的学说提供现代科学的理解及理论支持，具有重要的学术价值和临床实用价值。归肾丸原方出自《景岳全书》，全方由熟地、杜仲、山药、枸杞子、菟丝子、茯苓、当归、酒萸肉8味药组成，共奏滋补肾阴之效，书中记载“归肾丸治肾水真阴不足……”。该实验以“归肾丸-肾精-骨髓间充质干细胞”为主线，设想归肾丸水提物可能通过“滋补肾精”来促进骨髓间充质干细胞的增殖，探究归肾丸对骨髓间充质干细胞增殖的调控机制，寻找中医学与现代医学相融合的契合点，为再生医学疗法提供新的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  体外细胞实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年1月至2019年1月在广州中医药大学岭南医学研究中心中医妇科学实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  药材  归肾丸处方药材组成：熟地黄、盐杜仲、山药、枸杞子、盐菟丝子、茯苓、当归、酒萸肉均购自于广州中医药大学第一附属医院。

1.3.2  实验试剂及仪器  胎牛血清、DMEM/F12培养基、0.25%胰蛋白酶、双抗、PBS(Hyclone公司)；PI3K抗体(CST公司)；蛋白提取试剂盒(KEYGEN公司)；CCK-8(日本同仁化学研究所)；AKT抗体、山羊抗兔IgG、CD34-APC、CD44-FITC、CD90-PE(Abcam公司)；CO₂恒温培养箱(New Brunswick公司，型号Galaxy 170R)；真空冷冻干燥机(赛飞(中国)有限公司)；酶标仪(Thermo公司，型号1510)；流式细胞仪(BD公司)；离心机(Centrifuge公司)；电泳、电转系统(Bio-Rad公司)；荧光倒置显微镜(OLYMPUS公司)；细胞计数仪(Nexcelom公司，型号Mini)；培养瓶、6孔板、96孔板(Corning公司)。

1.3.3  实验动物  3周龄雄性SD大鼠2只，体质量50-  100 g，SPF级，由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.4  实验方法 

1.4.1  全骨髓贴壁法分离、培养骨髓间充质干细胞  将SD大鼠用颈椎脱臼法处死，于体积分数为75%乙醇中浸泡   5 min，消毒剪剪开皮肤，无菌条件下取双侧股骨，剔除肌肉和筋膜，置于预先配置好的含双抗的无菌PBS中清洗3遍，转移至不含血清的培养基中，将两端干骺端切除，显露出骨髓腔，用5 mL无菌注射器彻底冲洗骨髓腔直至骨头发白，200目筛网过滤，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用5 mL含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM/F12完全培养基重悬，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，转移至培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，48 h后全量换液1次，之后每隔3 d全量换液，并以倒置显微镜观察细胞形态(此即为原代)。待细胞融合至70%-80%，弃培养液，PBS清洗2次，0.25%胰酶消化进行传代扩增(即为第1代)。按照以上操作传代至第3代。

1.4.2  流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞的表型  取第3代细胞，用胰酶消化2 min，离心弃上清，用含体积分数2%胎牛血清的PBS清洗2遍，细胞重悬后加入流式管中，共4管，每管细胞数约1×10⁶个，分别标记为对照、双染1、双染2和双染3，对照用于设置方案，双染1加入APC标记的CD34，FITC标记的CD44；双染2加入PE标记的CD90，FITC标记的CD44；双染3加入APC标记的CD34，PE标记的CD90，置于冰上孵育30 min，用含体积分数2%胎牛血清的PBS清洗2遍后上机检测。

1.4.3  归肾丸冻干粉的制备  药材按原方比例混合，加入纯水浸泡30 min，水平面没过所有药材即可。煎煮2次：第1次以生药质量8倍的纯水煎煮，武火煎至沸腾后文火煎煮1 h，8层纱布过滤3遍，取滤液；第2次以生药质量5倍的纯水煎煮，武火煎至沸腾后文火煎煮30 min，8层纱布过滤3遍，取滤液即为归肾丸水提物。将2次滤液合并，蒸馏浓缩至100 mL，15 000 r/min高速离心15 min，操作重复2次，取上清，经0.22 μm滤膜过滤后，置真空冷冻干燥机制成冻干粉，所制得的1 g冻干粉含生药量为5.2 g。

1.4.4  实验分组  空白对照组(0 mg/L归肾丸水提物)以及10，20，40，80，100 mg/L归肾丸水提物组。

1.4.5  CCK-8法筛选药物干预的最佳质量浓度和时间  将制备好的冻干粉用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液溶解，并按比例稀释至10，20，40，80，100 mg/L放入-20 ℃冰箱备用。取第3代骨髓间充质细胞，消化后离心，弃上清，以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基重悬并计数，并以每孔5×10⁷ L^-1细胞浓度接种于96孔板中，每孔0.1 mL，设置4个复孔。待细胞完全贴壁后，更换新鲜不含血清的DMEM/F12培养基饥饿处理12 h，加不同质量浓度的归肾丸水提物干预，分别于1，2，3，4，5 d时用酶标仪测量450 nm的吸光度值。

1.4.6  Western blot检测各组细胞PI3K、AKT蛋白的表达  取第3代骨髓间充质细胞，以每孔2.5×10⁸ L^-1细胞浓度接种于6孔板中，每孔1 mL，置于培养箱中培养，待细胞生长至密度为50%-60%时，每孔加入10，20，40，80，100 mg/L归肾丸水提物2 mL，3 d后收集细胞，消化洗涤并800×g离心，每5×10⁶个细胞加入0.5 mL裂解液，振荡重悬，4 ℃净置2 min；按比例每0.5 mL裂解液加入1 mL抽提试剂，振荡混匀，4 ℃静置10 min；10 000×g 4 ℃离心10 min，溶液分为两相，两相中间为蛋白膜；小心吸除上层相和大部分下层相，保留两相中间的蛋白絮状物，加入1 mL纯乙醇洗涤沉淀，10 000×g 4 ℃离心3 min，蛋白沉淀在管底；去除管中所有液体，敞开管口，室温空气干燥蛋白沉淀。以上述步骤提取各组细胞中的蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，上样进行电泳，电泳结束后切下含有目的蛋白的胶条，开始转膜，所用电转条件为300 mA 90 min；转膜结束后用5%的脱脂奶粉于4 ℃条件下封闭过夜；倒掉封闭液，于4 ℃孵育一抗(Anti-PI3K、Anti-AKT)过夜；次日室温孵育二抗(山羊抗兔IgG)2 h；最后用ECL显色试剂盒显色。以GAPDH为内参，蛋白相对表达量为目的蛋白吸光度值与GAPDH吸光度值的比值。

1.5  主要观察指标  ①SD大鼠骨髓间充质干细胞的形态及表型鉴定结果；②归肾丸水提物干预后的细胞形态变化；③CCK-8法筛选归肾丸水提物的最佳药物质量浓度和作用时间；④Western blot检测不同质量浓度归肾丸水提物干预后骨髓间充质干细胞的PI3K、AKT蛋白表达量。

1.6  统计学分析  采用Stata 13.0软件进行统计学分析，所有数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，两两比较采用Scheffe法检验。P < 0.05为差异有显著性意义，各实验组均重复3次。重复测量数据吸光度值进行球形对称性检验，若球形不对称，需对方差分析结果进行校正，该实验结果符合球对称，故无需校正。

结论：归肾丸具有益精填髓之功效，能显著提高骨髓间充质干细胞中PI3K、AKT蛋白的表达，同时其水提物又能有效促进骨髓间充质干细胞的增殖，说明归肾丸水提物的促增殖作用与PI3K/AKT信号通路有关，故推测归肾丸是通过“滋补肾精”来提高PI3K/AKT信号通路的表达，从而促进骨髓间充质干细胞的增殖。该研究以“归肾丸-肾精-骨髓间充质干细胞”三者之间的联系为切入点，探讨中医药补肾可能的作用机制，为中医药在干细胞领域的研究提供新思路，同时在一定程度上展现了补肾药及补肾方在调控干细胞增殖方面所具有的独特优势和广阔的应用前景，为后续中医药研究提供理论上的支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

归肾丸：归肾丸原方出自《景岳全书》，全方由熟地、杜仲、山药、枸杞子、菟丝子、茯苓、当归、酒萸肉8味药组成，有补肾填精、调理冲任的功效，常用于治疗妇科疾病。作者采用纯水煎煮的方法获取归肾丸，所制得的归肾丸冻干粉1 g含生药量约为5.2 g。

原代骨髓间充质干细胞：原代细胞是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养，传代前保持原有细胞的基本性质，通常把第1代至第10代以内的细胞统称为原代细胞。该实验从3周龄雄性SD大鼠的双侧股骨骨髓获取原代骨髓间充质干细胞，经200目筛网过滤后，用全骨髓贴壁法纯化，经鉴定后选取纯度和增殖能力均较高的第3代细胞进行后续实验。

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归肾丸全方治肾而兼疗肝脾，共奏补肾填精，调理冲任之功。临床上常用来治疗肾阴虚型卵巢早衰、多囊卵巢综合症、肾虚型月经过少、闭经等，疗效显著，但其作用机制尚不明确。该研究以“归肾丸-肾精-骨髓间充质干细胞”三者之间的联系为切入点，探讨中医药补肾可能的作用机制，为中医药在干细胞领域的研究提供新思路，同时在一定程度上展现了补肾药及补肾方在调控干细胞增殖方面所具有的独特的优势和广阔的应用前景，为后续中医药研究提供理论上的支持。

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