聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料与小鼠前成骨细胞的成骨分化

doi:10.12307/2022.247

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (16): 2498-2503.doi: 10.12307/2022.247

• 组织工程骨材料Tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料与小鼠前成骨细胞的成骨分化

张红梅1，2，孙溪饶1，王程越1

1锦州医科大学附属第二医院，辽宁省锦州市 121000；2赤峰学院附属医院，内蒙古自治区赤峰市 024000

收稿日期:2021-03-23 修回日期:2021-03-25 接受日期:2021-05-08 出版日期:2022-06-08 发布日期:2021-12-22
通讯作者: 王程越，教授/主任医师，锦州医科大学附属第二医院，辽宁省锦州市 121000
作者简介:张红梅，女，1991年生，内蒙古自治区赤峰市人，汉族，锦州医科大学在读硕士，主治医师，主要从事组织工程修复颌骨缺损研究。
基金资助:
辽宁省教育厅重点攻关项目(JYTZD2020004)，项目负责人：王程越；辽宁省自然基金资助计划(2019-MS-141)，项目负责人：孙溪饶

Effect of polymethyl methacrylate/mineralized collagen/Mg-Ca composite material on osteogenic differentiation of mouse preosteoblasts

Zhang Hongmei1, 2, Sun Xirao1, Wang Chengyue1

1Second Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China; 2Affiliated Hospital of Chifeng College, Chifeng 024000, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2021-03-23 Revised:2021-03-25 Accepted:2021-05-08 Online:2022-06-08 Published:2021-12-22
Contact: Wang Chengyue, Professor, Chief physician, Second Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China
About author:Zhang Hongmei, Master candidate, Attending physician, Second Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China; Affiliated Hospital of Chifeng College, Chifeng 024000, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
Liaoning Provincial Department of Education Key Research Project, No. JYTZD2020004 (to WCY); Natural Science Foundation Grant Program of Liaoning Province, No. 2019-MS-141 (to SXR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料：向聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉中加入15%的矿化胶原，混合均匀，按比例调拌后浸涂于体积构成比为1∶1的矿化胶原/镁钙合金复合体表面，待其自凝，制备出的聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料。这种新型复合材料不仅具备镁基金属的机械性能，同时具备矿化胶原的成骨能力，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥作为外层加强剂还可以保证复合材料整体的结构稳定。
RUNX2：属于runt域基因家族，是骨髓间充质干细胞、骨发育的必要因子。遗传学研究表明，RUNX2的缺失将会导致骨发育不良或终止。

背景：课题组前期通过冷冻干燥方法制备的矿化胶原/Mg-Ca合金复合体结构松散，使用聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥作为外层加强层对其进行改良可增强复合材料的结构稳定性。
目的：探讨聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。
方法：分别制备聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金、聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料。将MC3T3-E1细胞分别接种于聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金(A组)、聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料(B组)及Mg-Ca合金材料(C组)上，以单独培养的细胞为空白对照(D组)，扫描电镜下观察材料表面的细胞黏附形态，通过CCK-8、碱性磷酸酶活性、酶联免疫吸附实验、RT-PCR与Western blot检测分析3种材料对MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化的影响。
结果与结论：①扫描电镜下可见，MC3T3-E1细胞在A组复合材料表面黏附数量最多，生长状态良好，细胞拉伸明显，伪足伸出较多，细胞相互连接成网状结构；②CCK-8实验显示，与D组相比，3种材料均可促进MC3T3-E1细胞的增殖(P < 0.05)，其中以A组复合材料促增殖效果最显著(P < 0.05)；③与D组相比，3种材料均可提升MC3T3-E1细胞中的碱性磷酸酶活性(P < 0.05)，其中以A组提升最显著(P < 0.05)；④酶联免疫吸附实验显示，3种材料均可促进MC3T3-E1细胞分泌骨钙素与I型胶原，其中以A组促进作用最显著(P < 0.05)；⑤RT-PCR检测显示，3种材料均可提高MC3T3-E1细胞内RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素的mRNA表达，其中以A组提高最显著(P < 0.05)；⑥Western blot检测显示，3种材料均可提高MC3T3-E1细胞内RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素的蛋白表达，其中以A组提高最显著(P < 0.05)；⑦结果表明，聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料可促进MC3T3-E1细胞成骨分化相关蛋白与基因的表达，对其成骨分化起积极作用。

https://orcid.org/0000-0001-9126-9977 (张红梅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥, 矿化胶原, 成骨分化, 镁钙合金, 小鼠前成骨细胞, 转录因子, 骨钙素, 碱性磷酸酶

Abstract: BACKGROUND: The structure of mineralized collagen/Mg-Ca composite prepared by freeze-drying method is loose, and the structural stability of the composite can be enhanced by using polymethyl methacrylate bone cement as the outer strengthening layer.
OBJECTIVE: To investigate the effects of polymethyl methacrylate/mineralized collagen/Mg-Ca composite on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells.
METHODS: The polymethyl methacrylate/mineralized collagen/Mg-Ca and polymethyl methacrylate/mineralized collagen composites were prepared respectively. The MC3T3-E1 cells were directly inoculated on the surface of polymethyl methacrylate/mineralized collagen/Mg-Ca composite (group A), polymethyl methacrylate/mineralized collagen composite (group B) and Mg-Ca alloy (group C). Cells cultured alone were blank controls (group D). The cell adhesion morphology on the material surface was observed under the scanning electron microscope. CCK-8, alkaline phosphatase activity, enzyme linked immunosorbent assay, RT-PCR, and western blot assay were used to analyze the effects of three materials on MC3T3-E1 cell proliferation and osteogenic differentiation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscope showed that the largest adhesion number of MC3T3-E1 cells on the surface of polymethyl methacrylate/mineralized collagen/Mg-Ca composite, grew well, stretched obviously, pseudopodia extended more, and connected with each other to form a network structure. (2) CCK-8 assay showed that compared with the group D, the three materials could promote the proliferation of MC3T3-E1 cells (P < 0.05), and the composite had the most significant effect in group A (P < 0.05). (3) Compared with the group D, the three materials could promote the alkaline phosphatase activity in MC3T3-E1 cells (P < 0.05), and the group A was the most significant (P < 0.05). (4) Enzyme linked immunosorbent assay showed that the three materials could promote the secretion of osteocalcin and type I collagen in MC3T3-E1 cells, and the promotion effect of group A was the most significant (P < 0.05). (5) RT-PCR showed that the three materials could increase the mRNA expression of RUNX2, OSX, alkaline phosphatase and osteocalcin, especially in group A (P < 0.05). (6) Western blot assay showed that the three materials could increase the protein expression of RUNX2, OSX, alkaline phosphatase and osteocalcin, and the group A had the most significant increase (P < 0.05). (7) The results showed that polymethyl methacrylate/mineralized collagen/Mg-Ca composite could promote the expression of osteogenic differentiation related proteins and genes in MC3T3-E1 cells, and had a positive effect on the osteogenic differentiation.

Key words: polymethyl methacrylate bone cement, mineralized collagen, osteogenic differentiation, magnesium calcium alloy, mouse preosteoblasts, transcription factor, osteocalcin, alkaline phosphatase

中图分类号:

张红梅, 孙溪饶, 王程越. 聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料与小鼠前成骨细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(16): 2498-2503.

Zhang Hongmei, Sun Xirao, Wang Chengyue. Effect of polymethyl methacrylate/mineralized collagen/Mg-Ca composite material on osteogenic differentiation of mouse preosteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(16): 2498-2503.

图/表（结果） 6

2.1 各组材料表面细胞黏附和形态学观察结果 MC3T3-E1细胞在3组样品表面黏附形态如图1所示。细胞在A、B组材料表面黏附，生长状态良好，细胞拉伸明显，伪足伸出较多，细胞相互连接成网状结构；C组材料表面的细胞生长似乎受到抑制，细胞呈圆形，伪足伸出并不明显，且黏附细胞数量明显少于A、B两组。

2.2 各组材料表面细胞活力检测结果 CCK-8实验结果如图2所示，随着培养时间的延长，各组细胞增殖活力呈上升趋势；B组与C组培养1，3，5 d 后的细胞增殖活力差异较小(P > 0.05)，均高于D组(P < 0.05)；A组培养后各个时间段的细胞增殖活力均高于B、C、D组(P < 0.05)。这一结果说明A、B、C组材料均可促进细胞的黏附增殖，尤以A组的聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料最佳。

2.3 各组材料表面细胞碱性磷酸酶活性检测结果随培养时间的延长，4组的细胞碱性磷酸酶水平均呈上升趋势，B组与C组培养3，5，7 d后的碱性磷酸酶水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但均高于D组(P < 0.05)；A组培养3，5，7 d 后的碱性磷酸酶水平均高于B、C和D组(P < 0.05)，见图3。结果表明，3组材料均可促进MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶表达，其中以聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料作用效果最为明显。

2.4 各组材料表面细胞骨钙素及Ⅰ型胶原分泌水平随着培养时间的延长，4组细胞的骨钙素及Ⅰ型胶原分泌水平均呈上升趋势；B组与C组第8，10，14天的骨钙素及Ⅰ型胶原分泌水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)，均高于D组(P < 0.05)；A组第8，10，14天的骨钙素及I型胶原分泌水平均高于其余3组(P < 0.05)，见图4。结果表明，聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料较其他各组可更好地促进MC3T3-E1细胞分泌骨钙素及Ⅰ型胶原。

2.5 各组材料表面细胞成骨相关基因表达 RT-PCR测定结果表明，B组与C组细胞的成骨分化相关基因RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素的mRNA表达水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)，均高于D组(P < 0.05)；A组各成骨分化相关基因mRNA表达水平明显高于其余3组(P < 0.05)，见图5。结果显示，聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金相比其他各组可明显促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。

2.6 各组材料表面细胞成骨相关蛋白的表达 B组与C组细胞的成骨分化RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素蛋白表达水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)，均高于D组(P < 0.05)；A组的RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素蛋白表达水平最高，见图6。结果显示，聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料较其他各组明显促进成骨相关蛋白的表达。

参考文献

[1] 董航,黄嘉华,麦喆钘,等.载骨碎补总黄酮磷酸钙骨水泥对骨缺损模型大鼠诱导膜中成骨细胞分化的影响及其机制研究[J].中国药房,2019,30(10):30-36.
[2] ZHOU Z, ZANG H, WANG S, et al. Filtration Behaviour of Cement-Based Grout in Porous Media. Transport Porous Med. 2020;125(3):435-463.
[3] JU J, ZHANG L, SHI H, et al. Three-dimensional porous carbon nanofiber loading MoS_2 nanoflake- flowerballs as a high-performance anode material for Li-ion capacitor. Appl Surf Sci. 2019;484(1):392-402.
[4] TRUDEL G, UHTHOFF HK, SOLANKI S, et al. The effects of knee immobilization on marrow adipocyte hyperplasia and hypertrophy at the proximal rat tibia epiphysis. Acta Histochem. 2017;119(7):759-765.
[5] 方栋,孙良业,谢肇.载万古霉素骨水泥间隔器治疗跟骨创伤后骨感染的疗效[J].中华创伤杂志,2019,35(2):109-114.
[6] ANDRULEWICZ-BOTULIŃSKA E, WIŚNIEWSKA R, BRZÓSKA MM, et al. Beneficial impact of zinc supplementation on the collagen in the bone tissue of cadmium‐exposed rats. J Appl Toxicol. 2021;38(7):996-1007.
[7] DONG S, GAO X, MA Z, et al. Ice-templated porous silicate cement with hierarchical porosity. Mater Lett. 2020;217(15):292-295.
[8] 李树源,周琦石,陈超,等.负载抗生素聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥间隔器和链珠治疗胫骨创伤性骨髓炎并Ⅰ度骨缺损效果比较[J].临床误诊误治,2019,32(8):39-44.
[9] SHEAFI EM, TANNER KE. Relationship between fatigue parameters and fatigue crack growth in PMMA bone cement. Int J Fatigue. 2020;120(3): 319-328.
[10] 于晴,郭昌武,杨静馨,等.矿化胶原与镁钙合金的复合材料应用于犬拔牙位点保存的实验研究[J]. 中国临床解剖学杂志,2017,35(5): 532-542.
[11] NIE X, SUN X, WANG C, et al. Effect of magnesium ions/Type I collagen promote the biological behavior of osteoblasts and its mechanism. Regen Biomater. 2020;7(1):53-61.
[12] 高山,周方,吕扬,等.新型多孔聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的制备及性能分析[J].中国组织工程研究,2019,23(2):46-52.
[13] PAHLEVANZADEH F, BAKHSHESHI-RAD HR, ISMAIL AF, et al. Development of PMMA-Mon-CNT bone cement with superior mechanical properties and favorable biological properties for use in bone-defect treatment. Mater Lett. 2020;240(1):9-12.
[14] LU L, BI S, XU X, et al. Coordination polymer derived Ni based composite material with N-doped mesoporous carbon as matrix for pollutants removal. J Porous Mat. 2020;26(1):205-215.
[15] 张佰开,王玮,姜帅,等.新型PMMA抗紫外复合材料的制备及表征[J].塑料工业,2018,46(12):153-157.
[16] 李浩亮,王西彬,左瑞庭.负载重组人骨形态发生蛋白2磷酸钙骨水泥与纤维蛋白胶复合材料促进骨质疏松性骨折的愈合[J].中国组织工程研究,2019,23(14):2156-2161.
[17] 孟冰,刘趁心,杨照,等.新型骨水泥椎弓根螺钉在治疗腰椎滑脱合并骨质疏松症的应用研究[J].现代生物医学进展,2019,19(8):86-91.
[18] 沈浩.具有部分降解功能的Mg-PMMA复合骨水泥的制备及表征研究[D].苏州:苏州大学,2017.
[19] SHEN Y, SUN X, BAO J, et al. Study on Degradation Behavior and Biocompatibility of Polymethyl Methacrylate Nano-Hydroxyapatite Collagen Magnesium-Calcium Alloy Composite Material. J Biomater Tiss Eng. 2020;(10):139-150.
[20] BELLUCCI D, SOLA A, GAZZARRI M, et al. A new hydroxyapatite-based biocomposite for bone replacement. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2021;33(3):1091-1101.
[21] YANG Y, ZHU X, ZHANG B, et al. Electrocatalytic properties of porous Ni-Co-WC composite electrode toward hydrogen evolution reaction in acid medium. Int J Hydrogen Energ. 2020;44(36):19771-19781.
[22] 盛珺,刘达,郑伟,等.唑来膦酸联合骨水泥钉道强化椎弓根螺钉用于骨质疏松腰椎融合术的疗效[J]. 解放军医学杂志,2018,43(12): 62-66.
[23] SHENG W, XU Q, CHEN J, et al. Electrochemical sensing of hydrogen peroxide using nitrogen-doped graphene/porous iron oxide nanorod composite. Mater Lett. 2021;235(15):137-140.
[24] 杨勇,林新源,曾婷,等.针麻复合局麻应用于经皮椎体成形术的临床效果及安全性[J].广东医学,2018,39(19):2976-2980.
[25] 陈枭,徐涛,雷华,等.多功能nanoZnO/PMMA复合材料的制备与性能[J].复合材料学报,2018,35(2):245-252.
[26] BAIGALIEV BE, TEMNIKOVA SV, CHERENKOV AV, et al. Unit-Cell Simulation of the Thermal Conductivity Processes in Porous Composite Materials. High Temp. 2021;56(4):538-545.
[27] REZNICHENKO AN, LUGOVAYA MA, PETROVA EI, et al. Lead-free porous and composite materials for ultrasonic transducers applications. Ferroelectrics. 2020;539(1):93-100.
[28] 毛璐,张伯松,姜璐,等.载万古霉素骨水泥的人体局部释放及全身药物浓度监测[J].中国医院药学杂志,2019,39(3):31-33.
[29] WANG X, KOU JM, YUE Y, et al. Clinical observations of osteoporotic vertebral compression fractures by using mineralized collagen modified polymethylmethacrylate bone cement. Medicine. 2020;97(37):e12204.
[30] WU J, XU S, QIU Z, et al. Comparison of human mesenchymal stem cells proliferation and differentiation on poly(methyl methacrylate) bone cements with and without mineralized collagen incorporation. J Biomater Appl. 2021;30(6):722-731.
[31] YU Q, WANG C, YANG J, et al. Mineralized collagen/Mg-Ca alloy combined scaffolds with improved biocompatibility for enhanced bone response following tooth extraction. Biomed Mater. 2020;13(6): 065008.
[32] GUO C, YU Q, SUN B, et al. Evaluation of Alveolar Bone Repair with Mineralized Collagen Block Reinforced with Mg–Ca Alloy Rods. J Biomater Tiss Eng. 2020;8(1):1-10.
[33] WANG CY, SUN Y, CHEN Z, et al. Application of the Magnesium Rod and Porous Mineralized Collagen Plug in Site Preservation in Dogs. J Biomater Tiss Eng. 2020;6(3):171-179.
[34] TAO C, QIU Z, MENG Q, et al. Mineralized Collagen Incorporated Polymethyl Methacrylate Bone Cement for Percutaneous Vertebroplasty and Percutaneous Kyphoplasty. J Biomater Tiss Eng. 2019;4(12):1100-1106.
[35] BALASUNDARAM G, STOREY DM, WEBSTER TJ. Novel nano-rough polymers for cartilage tissue engineering. Int J Nanomed. 2019;9: 1845-1853.

引言

近年来随着中国医疗技术的不断发展，临床对于骨替代材料的需求日益增加。理想的骨替代材料应具有如下特性：良好的生物相容性[1]；可生物降解性；三维多孔结构[2-4]；骨传导及骨诱导性。
矿化胶原的主要成分为纳米羟基磷灰石和胶原，其成分与天然骨基质组织类似[5-6]。DONG等[7]研究表明，具有多孔结构的矿化胶原在组织结构上与天然骨相似，有助于细胞的生长和形成新生骨，提供连贯的通道，营造最佳的骨生长环境。镁合金因其优异的力学性能、生物相容性、可生物降解性等被应用于生物医学领域[8]。SHEAFI等[9]实验表明，镁合金因其综合力学性能良好且能与人体组织有效结合，故而近年来被广泛推荐使用于临床中。但镁合金植入体内后降解速度较快，且降解过程中持续释放氢气、氢氧根离子等，会影响植入部位周围微环境，导致临床使用受到限制。
课题组在前期实验中将矿化胶原与镁钙合金联合应用于犬拔牙位点保存术中，实验结果表明该材料可促进小鼠前成骨细胞的增殖及迁移，并且两种材料在体内亦具有优异的成骨活性，可协同促进新骨生成[10]。随后，对镁合金及矿化胶原协同促进成骨机制进行了探究，发现镁离子与矿化胶原中的Ⅰ型胶原可通过整合素α2β1-FAK-ERK1/2信号通路促进成骨[11]。
聚甲基丙烯酸甲酯亦是医学领域中常见的一类材料，具有优异的有效性及安全性[12]。LU等[13-14]利用聚甲基丙烯酸甲酯与矿化胶原制备复合材料，实验结果表明该复合材料具备良好的力学性能，显示出较好的骨整合能力。据报道，将具有仿生微结构、良好成骨活性的矿化胶原复合到聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥中，可改进聚甲基丙烯酸甲酯的生物相容性及力学性能，并可下调聚甲基丙烯酸甲酯过高的抗压弹性模量[15-17]。同时，矿化胶原修饰后的骨水泥可促进成骨细胞黏附于材料表面，并提高细胞增殖能力。高山等[12]将可降解的磷酸三钙加入聚甲基丙烯酸甲酯中制备复合骨水泥材料，该材料具有良好的细胞、组织安全性，表面可形成多孔结构，将骨水泥植入动物体内3个月后可见大量新生骨长入骨水泥内，骨-骨水泥界面明显增强。沈浩[18]制备了新型镁-聚甲基丙烯酸甲酯复合骨水泥，提高了材料的生物安全性、组织相容性及促成骨性能，随着镁的逐渐降解，骨水泥内部形成互相连通的多孔结构，有利于骨组织的长入，从而与骨组织之间形成交联界面。在前期研究中，课题组通过体外实验已证实聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料可有效提高镁钙合金的耐腐蚀性，并且复合材料浸提液可促进小鼠前成骨细胞的增殖、黏附、分化及矿化等生物学行为[19]，但并未从蛋白基因水平探讨聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料的促成骨作用。
因此，基于以上研究背景及前期工作，实验将小鼠前成骨细胞与聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料共培养，从蛋白基因水平进一步阐述聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料的促成骨能力，为未来新型矿化胶原与镁合金复合材料的设计与研发提供思路策略及基础理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料与细胞共培养，数据采用χ2检验、t检验和方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年6月至2020年12月在锦州医科大学生命科学院完成。
1.3 材料 Mg-Ca合金(北京联合大学)；矿化胶原骨粉(北京奥精医学)；聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥(OPTIBONE)；α-MEM培养基(Hyclone)；胰蛋白酶(Gibco)；胎牛血清(四季青)；DMSO(索莱宝)；CCK-8、BCA试剂盒(碧云天)；碱性磷酸酶试剂盒(南京建成)；ELISA试剂盒(活乐)；反转录试剂盒仪(Takara)；扫描电镜(Hitachi)；酶标仪(Tecan)；RT-PCR仪、Western blot自动显影(Thermo Fisher)。
1.4 实验方法
1.4.1 MC3T3-E1细胞的培养无菌条件下复苏MC3T3-E1细胞(锦州医科大学生命科学院提供)，添加含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养液，放入37 ℃、体积分数5%CO2及95%湿度孵箱中进行培养，每2 d换液一次，待细胞培养至80%-90%进行传代。
1.4.2 材料制备镁钙合金片直径10 mm，厚2mm，孔径0.7 mm，孔数5个。人工骨替代材料矿化胶原骨粉的主要组成成分为Ⅰ型胶原与纳米羟基磷灰石，纳米羟基磷灰石在材料中的占比约为45%。镁钙合金片表面用砂纸进行打磨并抛光，置于清洗槽中清洗，将2 g/L Ca(OH)2和15 g/L Na3PO4·12H2O溶于去离子水中配制电解液，以镁钙合金片试件作为阳极，不锈钢片作为阴极，在320 V电压、100 Hz频率、20%占比率的条件下处理2 min，将氧化后的镁钙合金片试样置于清洗槽中清洗3 min以洗去残留液体，在80 ℃热风烘干槽中烘干10 min后备用。
将矿化胶原与去离子水按照1.5 g/mL的比例搅拌2 h混合均匀，在模具中铺平0.5 mm厚的矿化胶原，用细线悬吊微弧氧化后的 Mg-Ca合金片于模具中间位置，加入矿化胶原填满模具，通过冷冻干燥的方式成型后脱模，完成矿化胶原与 Mg-Ca合金体积构成比1∶1的直径11 mm、厚3 mm的复合材料。将质量占比15%的矿化胶原加入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉中，按粉与液2 g/mL的比例充分混合，浸涂机以 2 m/s的速度将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥浸涂于制备好的矿化胶原/Mg-Ca合金片表面，待其自凝，制备聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料。同理制备聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料。
1.4.3 细胞与材料共培养将聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金(A组)、聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料(B组)及Mg-Ca合金材料(C组)分别放入24孔板中，并将MC3T3-E1细胞制备成细胞浓度为1×107 L-1的悬液，直接接种到材料上，每孔1 mL。以单纯培养的细胞为空白对照(D组)。
1.4.4 细胞黏附和形态学观察共培养24 h后取出材料，PBS去除漂浮细胞，40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，用不同浓度梯度乙醇依次脱水，10 min/次[20]，冷冻干燥后进行喷金，镜下观察不同的材料表面细胞的黏附情况及形态变化。
1.4.5 细胞活力分析共培养1，3，5 d后，向每孔中加入CCK-8溶液 50 μL，转移至37 ℃条件下继续孵育4 h，将孔内液体吸出注入96孔板中，各孔中所含液体相同均为100 μL，置于450 nm波长酶标仪下检测吸光度值[21]。
1.4.6 细胞成骨能力检测
碱性磷酸酶活性检测：共培养3，5，7 d时，用PBS冲洗细胞，经胰酶消化，4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min，去除上清液；加入PBS轻轻吹打，完成细胞的收集；加入裂解液，提取总蛋白，进行碱性磷酸酶活力检测、BCA蛋白检测，完成吸光度值、蛋白质含量测定，根据公式完成细胞中碱性磷酸酶活力测定，结果以U/g表示[22]。
酶联免疫吸附实验检测骨钙素及Ⅰ型胶原含量：共培养至第8，10，14天时，收集孔板内的细胞培养液，4 ℃下12 000 r/min离心5 min，离心后收集上清液。根据ELISA试剂盒说明书测定各组小鼠骨钙素及Ⅰ型胶原含量，酶标板自动读数仪测定各孔吸光度值(λ=450 nm)[23]。

RT-PCR实验检测成骨分化相关基因：共培养7 d时，用PBS冲洗细胞，经胰酶消化，4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，去除上清液；加入PBS轻轻吹打，完成细胞的收集；分别提取各组总RNA并反转录为cDNA，利用实时定量Real-time PCR 法检测RUNX2、OSX、碱性磷酸酶和骨钙素的mRNA 表达水平，引物序列见表1[24]。

PCR参数设置：30 ℃下10 min；42 ℃下30 min；99 ℃下5 min；5 ℃下5 min，连续进行35个循环，72 ℃下10 min延长，获得最终产物并放入1.5%琼脂凝胶电泳，GAPDH为内参。
Western blot分析成骨分化相关蛋白表达：共培养7 d时，用PBS冲洗细胞，经胰酶消化，4 ℃下12 000 r/min离心5 min，去除上清液；加入PBS轻轻吹打，完成细胞的收集，加入裂解液充分裂解，BCA标准曲线法测定蛋白浓度。配胶、点样、电泳、切胶、切膜、转膜，将剪好的硝酸纤维素膜与滤纸从负极到正极按顺序放好，封闭1 h，分别以1∶1 000稀释比GAPDH、RUNX2、OSX、碱性磷酸酶及骨钙素一抗4 ℃孵育过夜，以1∶10 000稀释比二抗室温孵育2 h，洗膜，用TBST液洗3次，10 min/次。在清洗后的样品中加入ECL孵育 1 min，显影。扫描胶片，分析条带精吸光度值和分子质量[25]。
1.5 主要观察指标各组MC3T3-E1细胞的黏附、细胞活力及成骨分化情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件处理，计数资料行χ2检验表示，所有数据均符合正态分布，重复数据测量应用方差分析。对实验中所得出的各项计量资料行t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

矿化胶原是一种有机-无机复合材料，基于其结构上的特殊性，使得材料在诸多方面都展示出优越的性能，但是矿化胶原机械强度较差，在其与人体组织相结合的期间难以维持足够的成骨空间，使得成骨效果并不十分理想，这限制了其进一步推广。BAIGALIEV等[26]的研究表明，镁合金综合性能优良，其力学性能、生物相容性及可降解性等特性较强。聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥在临床上应用广泛，经固化后具有良好的生物学特性，同时能够在极短的时间内成型[27-28]。聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的透明性好、硬度较低、耐磨性差，通过共聚方法引入金属元素可改变其结构，加强机械性能及耐磨性[29]。实验将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥作为外层加强剂，主要用于加强矿化胶原与镁钙合金的复合，并且该加强层掺入了15%的矿化胶原，可避免骨水泥导致的应力屏蔽，改善骨整合能力，可获得更好的机械性能。WU等[30]将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥与矿化胶原混合来观察其对骨髓间充质干细胞的成骨行为，结果表明该材料生物相容性良好。课题组在前期实验中将镁钙合金棒插入矿化胶原块中，两者之间存在较大间隙，且镁钙合金棒未做微弧氧化，在植入犬下颌骨后期就已降解完成，无法保护镁基体的腐蚀，因此在前期实验的基础上将矿化胶原和微弧氧化后的镁钙合金通过冷冻干燥的方式复合，使用聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥作为外层加强层对镁钙合金与矿化胶原的复合十分必要[31-33]。
细胞黏附是生物材料植入体内后发生生物反应的首要阶段，黏附主要依赖于植入物表面的理化特征，细胞在植入物表面的附着和扩散可调节细胞的行为和功能[34]。实验通过扫描电镜观察材料表面的细胞形态，细胞在A组材料表面黏附数最多，生长状态良好，细胞拉伸明显，伪足伸出较多，细胞相互连接成网状结构。有文献表明，材料粗糙的表面有助于促进基质与细胞之间的相互作用，促进细胞的黏附和生长[35]。因此，聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料促进细胞附着的原因可能是聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料表面粗糙，以及材料表面加入具有生物活性的矿化胶原。同时，CCK-8实验结果也表明，A组培养后1，3，5 d后的细胞增殖活力均高于B、C、D组，说明聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料能提高细胞的增殖活力，增强细胞黏附。
RUNX2又称为核心结合因子，属于runt域基因家族，是骨髓间充质干细胞、骨发育的必要因子。遗传学研究表明，RUNX2的缺失将会导致骨发育不良或终止。OSX基因为成骨细胞分化关键转录因子，有学者指出该基因含锌指结构并包含有超过400个氨基酸，分子质量为46 ku。大量的实验证明，当生物体中OSX基因水平较低时，软骨和膜内成骨的难度加大。碱性磷酸酶的发现时间较早，该物质是成骨细胞分化中的重要参与者，对于骨矿化具有积极意义。骨钙素为生物体中一类常见的蛋白质，该蛋白可通过多种方式合成，其功能是促进骨钙调节，是近年来被发现的一类生化标志物。Ⅰ型胶原广泛存在于低等脊椎动物体表到哺乳动物体内的一切组织中。实验结果表明，A组材料表面细胞的成骨相关蛋白和基因的表达水平均高于B、C组及空白对照组，说明聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料能提高材料表面成骨相关基因与蛋白表达水平，能调节相关成骨通路水平，有助于促进成骨细胞成骨。
此外，由于体外模拟环境无法完全等同于体内环境，将进行体内实验进一步研究上述问题，并对生物材料植入体内后宿主的免疫反应进行更深入的探讨。
实验证实聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料具有良好的生物相容性及促成骨分化能力，聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料可促进小鼠前成骨细胞的黏附、增殖及成骨分化相关蛋白和基因RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素的表达，对小鼠前成骨细胞成骨分化起积极影响作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料与小鼠前成骨细胞的成骨分化

Effect of polymethyl methacrylate/mineralized collagen/Mg-Ca composite material on osteogenic differentiation of mouse preosteoblasts

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[1]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[2]	曹炜, 冒符荣, 胡小华, 杨晓红. N-6甲基腺嘌呤RNA甲基化调控骨髓间充质干细胞的成骨及成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 266-270.
[3]	车振家, 朱正清, 朱礼伟, 李友斌, 祝晨一, 黄岚峰. 钛植入物表面生物化学改性对骨整合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(16): 2576-2583.
[4]	陈锦成, 朱国涛, 秦晓飞, 陈彦丞, 罗骏, 刘洪文, 吴宜璟, 徐杰. 龟鹿二仙胶含药血清介导大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2020-2026.
[5]	黄晓雄, 陈维凯, 刘滔, 杨惠林, 何帆. 低氧预处理改善去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2034-2039.
[6]	王帅, 李超然, 章茜茹, 黄桂林. 人尿源性干细胞来源外泌体的提取及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2056-2061.
[7]	罗鸣然, 范文豪, 李鑫, 周鹏, 吴泽睿, 袁峰. 靶向调控前列腺素内过氧化物合成酶2基因抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(12): 1888-1893.
[8]	徐林, 齐宏顺, 葛汝村, 李培培, 甄丽晓, 冯肖亚. 微创清除术联合二甲双胍对家兔脑出血炎症反应的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1741-1746.
[9]	李时斌, 夏天, 章晓云, 王伟伟, 周毅, 赖渝. 淫羊藿活性单体成分调控骨质疏松症相关信号通路影响骨吸收与骨形成的稳态[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1772-1779.
[10]	周宏博, 喻正文, 刘建国. 医用金属植入材料促进骨再生的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1588-1596.
[11]	黄涛, 程志坚, 贾志强, 赵晓光, 王磊, 翟文静, 周永新. miR-146a调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 70-75.
[12]	康悦, 刘洁. 环状RNA在间充质干细胞成骨分化中的生物学作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 106-111.
[13]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[14]	刘波, 陈祥和, 杨康, 余慧琳, 陆鹏程. DNA甲基化在运动干预骨质疏松中的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 791-797.
[15]	叶海民, 丁凌华, 孔维豪, 黄祖泰, 熊龙. 多级微管结构骨支架载体促进成骨成血管作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 621-625.