龟鹿二仙胶含药血清介导大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2022.327

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (13): 2020-2026.doi: 10.12307/2022.327

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龟鹿二仙胶含药血清介导大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

陈锦成1，2，朱国涛1，2，秦晓飞1，2，陈彦丞2，罗骏2，刘洪文1，2，吴宜璟2，徐杰1，2

1福建中医药大学中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建省福州市 350122；2福建省立医院骨二科，福建医科大学，福建省福州市 350001

收稿日期:2020-12-18 修回日期:2020-12-19 接受日期:2021-01-23 出版日期:2022-05-08 发布日期:2021-12-20
通讯作者: 徐杰，博士，教授，福建中医药大学中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建省福州市 350122；福建省立医院骨二科，福建医科大学，福建省福州市 350001
作者简介:陈锦成，男，广西壮族自治区贵港市人，汉族，福建中医药大学在读硕士，主要从事骨质疏松、肌少-骨质疏松症基础与临床研究。
基金资助:
福建省自然科学基金面上项目(2019J01173)，项目负责人：徐杰；2019福建省卫生教育联合攻关项目(2019-WJ-01)，项目负责人：徐杰；卫生健康委医学创新课题(2019-CX-1)，项目负责人：徐杰

Guilu Erxian Gum medicated serum mediated osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

Chen Jincheng1, 2, Zhu Guotao1, 2, Qin Xiaofei1, 2, Chen Yancheng2, Luo Jun2, Liu Hongwen1, 2, Wu Yijing2, Xu Jie1, 2

1Key Laboratory of Orthopedics & Traumatology of Traditional Chinese Medicine and Rehabilitation (Fujian University of Traditional Chinese Medicine), Ministry of Education, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; 2Second Department of Orthopedics, Fujian Provincial Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China

Received:2020-12-18 Revised:2020-12-19 Accepted:2021-01-23 Online:2022-05-08 Published:2021-12-20
Contact: Xu Jie, MD, Professor, Key Laboratory of Orthopedics & Traumatology of Traditional Chinese Medicine and Rehabilitation (Fujian University of Traditional Chinese Medicine), Ministry of Education, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; Second Department of Orthopedics, Fujian Provincial Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
About author:Chen Jincheng, Master candidate, Key Laboratory of Orthopedics & Traumatology of Traditional Chinese Medicine and Rehabilitation (Fujian University of Traditional Chinese Medicine), Ministry of Education, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; Second Department of Orthopedics, Fujian Provincial Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
Supported by:
the General Project of Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2019J01173 (to XJ); the Health Education Joint Research Project of Fujian Province in 2019, No. 2019-WJ-01 (to XJ); the Medical Innovation Project of the Health Commission, No. 2019-CX-1 (to XJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
中药含药血清：是指将中药古法煎煮、浓缩成一定浓度并高压灭菌后，按人与动物体质量折算的等效剂量换算给动物灌胃，经过动物机体自然吸收并进入血液循环代谢，在血药代谢峰值时间内采集动物血液，离心得到含有动物真实血药浓度的上层血清，将含药血清加入目的细胞培养体系中，观察含药血清对目的细胞形态学与分子学所产生药理作用的一种体外实验方法。
骨髓间充质干细胞三系诱导分化：骨髓间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，能够分化为肝细胞样细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌原细胞以及神经外胚泡等，在做骨髓间充质干细胞诱导分化实验时，根据其成骨、成软骨、成脂3个方向诱导分化水平来判断它的分化潜能。

背景：在研究骨髓间充质干细胞增殖的基础上揭示其分化机制是防治骨质疏松症研究的热门课题之一。
目的：探讨龟鹿二仙胶含药血清诱导骨髓间充质干细胞成骨分化以防治骨质疏松症的分子机制与激活细胞外信号调节激酶1/2/E26转录因子1信号通路因子之间的相关性。
方法：购买商品化第3代 SD大鼠骨髓间充质干细胞，根据加入不同成分培养基分为胎牛血清组、空白血清组、龟鹿二仙胶含药血清组、经典诱导组以及通路抑制剂组、龟鹿二仙胶含药血清+通路抑制剂组，根据分组条件进行成骨诱导分化，每3 d换液1次，干预7 d时采用碱性磷酸酶活性检测试剂盒测定前4组骨髓间充质干细胞的成骨分化水平；干预14 d时采用茜素红染色观察前4组骨髓间充质干细胞的成骨矿化水平，实时荧光定量PCR检测前4组骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶、runt家族相关转录因子2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和E26转录因子1的基因表达水平，Western blot法检测6组骨髓间充质干细胞中Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、runt家族相关转录因子2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、E26转录因子1、细胞外信号调节激酶1/2和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达。
结果与结论：①与空白血清组比较，龟鹿二仙胶含药血清组碱性磷酸酶、runt家族相关转录因子2、E26转录因子1 mRNA的表达水平均明显升高，成脂分化特异性指标过氧化物酶体增殖物激活受体γ mRNA的表达水平则受到抑制；②与胎牛血清组和空白血清组比较，Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、runt家族相关转录因子2、E26转录因子1、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2等成骨分化相关蛋白表达水平明显升高，过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白表达水平同样受到抑制，使用MAPK信号通路抑制剂PD98059可下调上述成骨分化相关蛋白表达水平，上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白表达水平；③与胎牛血清组和空白血清组比较，龟鹿二仙胶含药血清组骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性(P < 0.05)和钙化能力(P < 0.05)明显提高；④结果表明，龟鹿二仙胶含药血清可能通过调节细胞外信号调节激酶1/2/E26转录因子1信号通路因子介导骨髓间充质干细胞成骨分化，这可能是其防治骨质疏松症的重要机制之一。

https://orcid.org/0000-0003-0168-7599 (陈锦成)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 龟鹿二仙胶, 骨质疏松, 成骨分化, 细胞外信号调节激酶, 机制

Abstract: BACKGROUND: On the basis of studying the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells, revealing their differentiation mechanism is one of the hot topics in the study of prevention and treatment of osteoporosis.
OBJECTIVE: To explore the relationship between the molecular mechanism of Guilu Erxian Gum medicated serum that induces osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells to prevent osteoporosis and the activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2/E26 transcription factor 1 signaling pathway factors.
METHODS: Passage 3 commercial SD rat bone marrow mesenchymal stem cells were purchased, and divided into fetal bovine serum group, blank serum group, Guilu Erxian Gum medicated serum group, classical induction group, pathway inhibitor group, and Guilu Erxian Gum+pathway inhibitor group. Osteogenic differentiation was conducted according to group conditions, and the fluid was altered every 3 days. At 7 days after intervention, alkaline phosphatase activity detection kit was used to determine the osteogenic differentiation level of bone marrow mesenchymal stem cells in the first four groups. At 14 days after intervention, alizarin red staining was used to verify the level of bone formation and mineralization of bone marrow mesenchymal stem cells in the first four groups. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the gene expression levels of alkaline phosphatase, core binding protein 2, peroxisome proliferator activated receptor γ, and E26 transcription factor 1 in bone marrow mesenchymal stem cells of the first four groups. Western blot assay was utilized to determine protein expression of type I collagen, alkaline phosphatase, core binding protein 2, peroxisome proliferator activated receptor γ, E26 transcription factor 1, extracellular signal-regulated kinase 1/2 and phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2 in bone marrow mesenchymal stem cells of the six groups.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the blank serum group, the mRNA expression levels of alkaline phosphatase, core binding protein 2, and E26 transcription factor 1 were significantly higher in the Guilu Erxian Gum medicated serum group, while the mRNA expression levels of the adipogenic differentiation specific index peroxisome proliferator activated receptor γ were inhibited. (2) Compared with the fetal calf serum group and the blank serum group, the expression levels of osteogenic differentiation-related proteins, such as type I collagen, alkaline phosphatase, core binding protein 2, E26 transcription factor 1, and phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2 were significantly increased; and the expression level of peroxisome proliferator activated receptor γ protein was also suppressed. The use of MAPK signaling pathway inhibitor PD98059 could down-regulate the expression levels of osteogenic differentiation-related proteins and up-regulate the expression levels of peroxisome proliferator activated receptor γ protein. (3) Compared with the fetal bovine serum group and the blank serum group, the alkaline phosphatase activity (P < 0.05) and calcification capacity (P < 0.05) of bone marrow mesenchymal stem cells were significantly improved in the Guilu Erxian Gum medicated serum group. (4) The results show that Guilu Erxian Gum medicated serum may mediate the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells through extracellular signal-regulated kinase 1/2/E26 transcription factor 1 signaling pathway factors, which may be one of its important mechanisms for preventing and treating osteoporosis.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, Guilu Erxian Gum, osteoporosis, osteogenic differentiation, extracellular signal regulated kinase, mechanism

中图分类号:

陈锦成, 朱国涛, 秦晓飞, 陈彦丞, 罗骏, 刘洪文, 吴宜璟, 徐杰. 龟鹿二仙胶含药血清介导大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2020-2026.

Chen Jincheng, Zhu Guotao, Qin Xiaofei, Chen Yancheng, Luo Jun, Liu Hongwen, Wu Yijing, Xu Jie. Guilu Erxian Gum medicated serum mediated osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(13): 2020-2026.

图/表（结果） 8

2.1 龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞增殖的影响根据CCK-8实验结果可知，以体积分数为10%龟鹿二仙胶含药血清作用72 h对骨髓间充质干细胞的促生长作用最显著(P < 0.01)，见图1，因此后续干预实验均采用体积分数为10%龟鹿二仙胶含药血清，干预期间细胞72 h换液1次。

2.2 龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞钙化结节形成的影响胎牛血清组和空白血清组经茜素红染色未见形成明显橘红色的钙化结节，见图2A，B；龟鹿二仙胶含药血清组和经典诱导组经茜素红染色可见大片或散在明显的橘红色经典钙结节，见图2C，D。与胎牛血清组和空白血清组比较，龟鹿二仙胶含药血清干预骨髓间充质干细胞成骨诱导14 d后，钙化结节明显增多。茜素红染色钙化结节半定量结果也显示龟鹿二仙胶含药血清组成骨分化能力强于胎牛血清组和空白血清组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3。

2.3 龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性的影响与空白血清组相比，龟鹿二仙胶组含药血清干预7 d，可提高骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶的活性(P < 0.05)，但是与龟鹿二仙胶含药血清组比较，经典诱导组可更加显著提高骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶的活性(P < 0.05)，见图4。

2.4 各组细胞碱性磷酸酶、runt家族相关转录因子2、E26转录因子1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ的mRNA表达与空白血清组比较，龟鹿二仙胶含药血清组碱性磷酸酶、runt家族相关转录因子2、E26转录因子1的mRNA相对表达水平升高，而过氧化物酶体增殖物激活受体γ的mRNA相对表达水平受抑制，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.5 各组细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、runt家族相关转录因子2、E26转录因子1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达与空白血清组比较，龟鹿二仙胶含药血清组和经典诱导组碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、runt家族相关转录因子2、E26转录因子1和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白相对表达水平升高，而过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白表达水平则受抑制，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

当用MAPK信号通路抑制剂PD98059时，与龟鹿二仙胶含药血清+通路抑制剂(PD98059)组对比，龟鹿二仙胶含药血清组磷酸化细胞外信号调节激酶1/2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、runt家族相关转录因子2和E26转录因子1蛋白表达水平显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，而龟鹿二仙胶含药血清+通路抑制剂组成脂特异性指标过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白表达水平显著高于龟鹿二仙胶含药血清组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

2.6 细胞外信号调节激酶1/2/E26转录因子1信号通路机制许多参与生长和分化的受体都能够激活MAPK/ERK信号通路，根据蛋白免疫印迹实验结果和细胞信号通路图，龟鹿二仙胶含药血清可以激活细胞外信号调节激酶，磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2可以在胞质中调控相关靶蛋白，也可以转运到胞核中直接抑制修饰成脂分化特异性标志物过氧化物酶体增殖物激活受体γ和直接刺激修饰E26转录因子1，见图8。E26转录因子1 作为一个重要的转录调节因子，它可通过与许多骨基质蛋白(runt家族相关转录因子2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原)基因DNA上特殊的调节区相结合，来激活并调节这些基因的转录，该转录因子对骨组织的发育和成骨细胞的分化与成熟起重要的调控作用。

2.7 生物相容性根据CCK-8实验结果可知，体积分数为10%龟鹿二仙胶含药血清作用72 h对骨髓间充质干细胞的促生长作用最显著，具有良好的生物相容性。

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引言

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织微细结构损坏，导致骨脆性事件增加和易发骨折为特征的全身性骨病[1-2]。自然增龄造成的器官功能减退是发生老年性骨质疏松症的主要因素，其中骨髓间充质干细胞成骨分化能力下降在骨质疏松症发生发展中充当重要角色[3]。骨形成减少是老年性骨质疏松症发生的关键环节，而成骨细胞是骨形成的关键细胞，骨髓间充质干细胞被认为是成人骨重建过程中成骨前体细胞的主要来源，故成骨细胞是否顺利分化成熟是决定骨形成的重要条件。
前期动物实验研究发现龟鹿二仙胶(guiliu erxian gum，geg)能改善去卵巢骨质疏松症大鼠的骨密度与骨强度[4]，并且在细胞实验中初步证明了10%的龟鹿二仙胶能通过介导Wnt/β-catenin 信号通路因子有效诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化。但中医药复方往往具有多途径、多靶点的作用特点，成骨细胞定向分化过程可受多条信号通路的综合调控，其中MAPK/ERK信号通路作为胞外刺激信号是调控细胞生长与分化的经典通路[5]。研究表明，细胞外信号调节激酶1/2经典通路可接收多种胞外刺激信号从而介导细胞生长和分化，其主要作用是完成细胞内信息的传递[6-7]。细胞外信号调节激酶1/2通路相关生长因子在维持机体骨质代谢与骨平衡方面有重要作用[8]。
众所周知，骨髓间充质干细胞可分化为成骨细胞，同时分泌胞外基质，细胞外基质与细胞(主要是成骨前体细胞)的接触及相互作用可以激发MAPK/ERK通路因子，促使其进一步生长与分化成熟[9]；磷酸化细胞外信号调节激酶1/2的激活可在胞质中直接调控E26转录因子1靶蛋白并且直接抑制成脂分化特异性指标过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达，E26转录因子1在核内被激活后，可转运Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶和runt家族相关转录因子2等多种调控成骨分化的特异性转录因子。随着骨质疏松症病因、病机认识的发展，细胞外信号调节激酶1/2/E26转录因子1信号通路相关因子也被更多研究者认为是骨质疏松症防治的新靶点。该实验经过大量文献梳理并结合学科前期关于龟鹿二仙胶诱导骨髓间充质干细胞生长与分化相关研究基础，探索龟鹿二仙胶含药血清诱导骨髓间充质干细胞成骨分化以防治骨质疏松症的分子机制与激活细胞外信号调节激酶1/2/E26转录因子1信号通路因子之间的相关性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞模型实验，细胞功能相关数据采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年10月至2020年11月在福建医科大学实验动物中心和福建中医药大学中西医结合研究院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物和细胞选用8周龄SPF级SD大鼠60只制备龟鹿二仙胶含药血清，雌雄各半，体质量360-400 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0005，动物合格证号：20170005015490，饲养于福建医科大学医学实验动物中心SPF级实验室，许可证号：SYXK(闽)2016-0006。SD大鼠骨髓间充质干细胞由中国科学院干细胞库提供(批号：159141)。
1.3.2 实验药物龟鹿二仙胶包括龟板胶9 g(批号18101023)、枸杞子9 g(批号19031693)、鹿角胶6 g(批号19011343)、人参6 g(批号19071573)，药材购买于江阴天江药业有限公司，由福建中医药大学附属国医堂提供。将全方药物先用冷水浸泡半小时，煎煮2次，混合2次药液用旋转蒸发仪浓缩成含生药1 g/mL的龟鹿二仙胶药液，高温高压彻底灭菌后，仔细密封，冰箱4 ℃保存备用。
1.3.3 实验试剂和仪器 α-MEM液体培养基、青霉素链霉素溶液(HyClone公司)；胎牛血清、 0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒(Proteintech公司)；SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基(广州赛业生物科技有限公司，货号：RASMX-90021)；碱性磷酸酶测定试剂盒(微板法，南京建成生物工程研究所)；碱性磷酸酯酶显色试剂盒(碧云天)；茜素红-S粉(美国Sigma公司)；Trizol(Vazyme公司)；碱性磷酸酶兔抗大鼠单克隆蛋白抗体(SAB公司)；过氧化物酶体增殖物激活受体γ兔抗大鼠单克隆蛋白抗体(Proteintech公司)；细胞外信号调节激酶1/2和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2兔抗大鼠单克隆蛋白抗体(美国CST公司)；runt家族相关转录因子2、E26转录因子1和GAPDH(Abbkine公司)；BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司)；PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser 和SYBR® Premix Ex Taq™(Tli RNaseH Plus)(日本TAKARA公司)；ND-2000C型超微量蛋白核酸酶分析仪(美国Thermo公司)；实时荧光定量PCR仪7500 FAST(美国ABI公司)；化学发光凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；MAPK信号通路抑制剂PD98059(APExBIO公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 龟鹿二仙胶含药血清制备 SPF级8周龄SD大鼠60只，适应性饲养1周后，根据随机数字表法将60只大鼠随机分为含药血清组和空白血清组各30只。按人与动物体质量折算的等效剂量换算给药量，含药血清组按3.15 mg/(kg·d)的龟鹿二仙胶药液进行灌胃[10]，空白血清组采用同等条件下等剂量生理盐水灌胃。按药理学常规给药方法，即每天于上午8时，下午15时各灌胃给药1次，连续灌胃7 d。末次灌胃2 h时，20%乌拉坦5 mL/kg剂量麻醉大鼠，进行腹主动脉采血。全血静置于4 ℃冰箱过夜，1 500 r/min离心15 min，取上层血清，水浴锅56 ℃灭活半小时，用0.22 μm微孔滤膜过滤，15 mL离心管分装，于-20 ℃冰箱保存备用[11]。
1.4.2 龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞增殖的有效作用浓度和时间的筛选根据课题组前期流式细胞仪检测结果显示[11]，体积分数为10%龟鹿二仙胶中剂量含药血清可以有效促进骨髓间充质干细胞生长，在骨髓间充质干细胞良好生长的基础上开展后续龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞诱导分化干预时间的筛选实验和机制研究[11]。在96孔板中接种骨髓间充质干细胞悬液(100 μL/孔)，放入培养箱中(37 ℃，体积分数为5% CO2)预培养24 h后，换用含体积分数为10%龟鹿二仙胶含药血清的基础培养液100 μL，每组设8个复孔，每个96孔板设空白孔(仅有培养基而没细胞)，继续培养8，24，48，72，96 h；八联移液器向每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱内孵育1 h，酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值。
1.4.3 碱性磷酸酶活性检测取第3代骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度为5×108 L-1，以5×105个/孔接种于6孔板，分为胎牛血清组(基础培养基+体积分数为10%胎牛血清)、空白血清组(基础培养基+体积分数为10%空白血清)、体积分数为10%龟鹿二仙胶含药血清组(基础培养基+体积分数为10%龟鹿二仙胶含药血清)和经典诱导组(基础培养基+体积分数为10%胎牛血清+10 nmol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+50 mg/L抗坏血酸)进行成骨诱导分化，每3 d换液1次，诱导7 d后收集各组细胞培养液，1 500 r/min离心10 min，取上清液作为样品进行检测。向96孔板内加入50 μL基质液、50 μL缓冲液和30 μL样品，充分混匀37 ℃孵育15 min，添加150 μL显色剂，轻轻振摇孔板混匀，酶标仪检测波长520 nm处各孔的吸光度值；同样检测空白(双蒸水)孔和标准孔的吸光度值，得到各组碱性磷酸酶活性原始实验数据，根据说明书计算公式操作并进行统计分析。
1.4.4 茜素红染色和定量分析选取第3代骨髓间充质干细胞，以2×105个/孔的密度于6孔板，细胞分组同上，细胞血清饥饿1 d，然后根据分组条件诱导分化14 d进行茜素红染色：吸出孔板中的完全培养基，1×PBS冲洗2次，每孔加入体积分数4%中性甲醛溶液1.5 mL固定30 min，1×PBS轻轻冲洗2次，每孔沿边加入茜素红染液约2 mL染色5 min，1×PBS轻轻冲洗3次，倒置显微镜下观察茜素红染色效果并拍照存档。茜素红染色图片用Image J 软件进行定量分析，调整阈值对图片中红色显著部分染色面积进行标记，计算茜素红染色面积。

1.4.5 实时荧光定量PCR检测各组细胞目的基因的mRNA表达水平选取第3代骨髓间充质干细胞，细胞分组同上，然后根据分组条件诱导分化14 d，采用Trizol法提取各组细胞总RNA，按PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒操作说明，20 μL反应体系下将RNA反转录为cDNA模板。碱性磷酸酶、runt家族相关转录因子2、E26转录因子1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和内参基因GAPDH引物序列及反应条件见表1。

按照下列条件进行实时荧光定量PCR反应：步骤①(预变性95 ℃ 30 s，1个循环)；步骤②(PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环)；步骤③(熔解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)，采用7500 Software v2.3软件导出数据并分析，以GAPDH作为内参，每组3个复孔，CT值取均数。实验采用2-ΔΔCt法对目标基因表达水平进行半定量分析。
1.4.6 Western blot检测各组细胞中相关蛋白表达选取第3代骨髓间充质干细胞，分为6组：胎牛血清组、空白血清组、龟鹿二仙胶含药血清组、经典诱导组、通路抑制剂组、龟鹿二仙胶含药血清+通路抑制剂组，进行成骨诱导分化，其中通路抑制剂组、龟鹿二仙胶含药血清+通路抑制剂组在干预到第11天时加入10 μmol/L通路抑制剂PD98059处理3 d。
各组成骨诱导分化14 d后，4 ℃预冷的PBS冲洗3遍，加入RIPA裂解液以提取细胞总蛋白，应用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，5×蛋白上样缓冲液充分混匀后金属浴(99 ℃)10 min将蛋白彻底变性，每孔20 μg上样，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法将蛋白电转到聚偏二氟乙烯膜上，室温条件下5%脱脂奶粉+TBST在摇床上封闭1 h，加入稀释好的一抗[兔抗大鼠Ⅰ型胶原(1∶1 000)、兔抗大鼠碱性磷酸酶(1∶500)、兔抗大鼠核心结合蛋白2(1∶500)、兔抗大鼠E26转录因子1(1∶500)、兔抗大鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ(1∶500) 、兔抗大鼠GAPDH(1∶1 000)，兔抗大鼠细胞外信号调节激酶1/2(1∶1 000)、兔抗大鼠磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(1∶2 000)]，4 ℃摇床孵育过夜，1×TBST洗涤3次，每次5 min，去除残余一抗，加入HRP二抗(1∶5 000)室温摇床孵育1 h，1×TBST洗涤3次，每次5 min；加入超敏ECL化学发光检测试剂，凝胶成像系统扫描，以Image Lab 5.2软件分析，蛋白相对表达量为目标蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值之比。
1.5 主要观察指标 ①龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞增殖的影响；②各组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化7 d的碱性磷酸酶活性；③各组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化14 d的细胞矿化水平；④各组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化14 d的碱性磷酸酶、runt家族相关转录因子2、E26转录因子1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的mRNA表达水平；⑤各组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化14 d的碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、runt家族相关转录因子2、E26转录因子1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达水平。
1.6 统计学分析应用SPSS 22.0专业软件进行数据统计和分析，计量资料采用x±s表示，数据符合正态分布的组间比较则适用单因素方差分析，若数据不符合正态分布，应采用非参数检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

根据流行病学调查和专业机构预测，中国骨质疏松性骨折患者数持续增加，相应的社会医疗压力倍增[12]。骨质疏松症根据其临床症状在祖国医学中多属于“骨痹”“骨痿”和“骨枯”等范畴，其最早记载于《黄帝内经》。根据中医学重要理论“肾藏精，肾主骨生髓”，肾精亏虚则骨髓生化无源，骨骼失养而痿弱无力[13]，所以肾精亏虚是骨质疏松症发生的主要病机[14]。现代医学认为骨质疏松的共同特点是在骨代谢过程中，骨吸收和骨形成之间出现失衡，骨量日益丢失[15]。成骨细胞在整个骨重建过程中扮演重要角色，研究表明其数量多少和功能变化与骨质疏松症的发生发展密切相关。骨髓间充质干细胞作为成骨细胞的主要来源，在一定条件下其可诱导分化为成骨细胞，因此，在研究骨髓间充质干细胞增殖的基础上揭示其分化机制是防治骨质疏松症研究的热门课题之一[16]。
MAPK/细胞外信号调节激酶1/2作为细胞生长和分化的经典通路，其可在各种不同的细胞外刺激信号下激活，激活的细胞外信号调节激酶1/2在细胞内信息传递中扮演着重要角色，并且激活的细胞外信号调节激酶1/2可调控成骨相关基因的转录因子，从而在维持骨平衡方面有着特殊的调控作用。
结合细胞外信号调节激酶1/2信号通路因子以研究龟鹿二仙胶诱导细胞生长与促成骨分化相关机制国内外暂时未见相关文献报道。研究发现，肾虚证和骨髓间充质干细胞增殖分化的失衡往往存在基因与蛋白质的串扰[17]；以补肾为主要功效的中药复方有效成分可通过激活不同的信号通路因子以促进骨髓间充质干细胞成骨分化[18-21]。龟鹿二仙胶中鹿角胶与龟板胶再配伍人参与枸杞子，整方具有滋阴益气补肾、填精髓等功效。该实验结果显示龟鹿二仙胶含药血清能显著增加细胞碱性磷酸酶活性，而碱性磷酸酶活性水平是成骨细胞分化的重要标记，与空白血清组相比，龟鹿二仙胶含药血清干预一定时间能上调成骨分化相关基因Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、runt家族相关转录因子2和靶基因E26转录因子1的mRNA表达水平，下调了成脂分化特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ的mRNA表达水平；同时，蛋白免疫印迹实验显示龟鹿二仙胶含药血清能激活信号通路因子细胞外信号调节激酶1/2和细胞外信号调节激酶1/2通路下游靶蛋白E26转录因子1。当用MAPK信号通路抑制剂PD98059时，龟鹿二仙胶含药血清+通路抑制剂组中过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白水平高于龟鹿二仙胶含药血清组，而成骨分化特异性指标Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、runt家族相关转录因子2和E26转录因子1蛋白表达水平下降。实验从细胞水平初步揭示了龟鹿二仙胶含药血清可通过细胞外信号调节激酶1/2/E26转录因子1通路因子诱导骨髓间充质干细胞成骨分化以防治骨质疏松症的可能机制[22]。但是，尚存在些许不足之处，对于龟鹿二仙胶含药血清激活细胞外信号调节激酶1/2通路后是直接在胞质中调控成骨分化相关靶蛋白还是转运入胞核，在核内磷酸化其他通路因子，还有待课题组进一步设计实验深入探究。
中医药复方防治疾病具有多途径和多靶点的突出优势与特点，强调从整体角度出发进行辨证论治，对于龟鹿二仙胶防治骨质疏松症的其他方面的作用效应及具体分子机制，有待利用基因高通量测序、蛋白质谱和代谢组学技术开展更多深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

龟鹿二仙胶含药血清介导大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

Guilu Erxian Gum medicated serum mediated osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

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