低氧预处理改善去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能

doi:10.12307/2022.329

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (13): 2034-2039.doi: 10.12307/2022.329

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

低氧预处理改善去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能

黄晓雄1，2，陈维凯1，2，刘滔1，杨惠林1，2，何帆1，2

1苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006；2苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215007

收稿日期:2020-11-07 修回日期:2020-11-11 接受日期:2020-12-14 出版日期:2022-05-08 发布日期:2021-12-20
通讯作者: 何帆，博士，研究员，博士生导师，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006；苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215007
作者简介:黄晓雄，男，1995 年生，浙江省宁波市人，汉族，在读硕士，主要从事干细胞、组织工程和再生医学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31771063)，项目负责人：何帆

Hypoxic precondition rescues osteogenic potential of bone marrow mesenchymal stem cells derived from ovariectomized rats

Huang Xiaoxiong1, 2, Chen Weikai1, 2, Liu Tao1, Yang Huilin1, 2, He Fan1, 2

1Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; 2Institute of Orthopaedics at Soochow University, Suzhou 215007, Jiangsu Province, China

Received:2020-11-07 Revised:2020-11-11 Accepted:2020-12-14 Online:2022-05-08 Published:2021-12-20
Contact: He Fan, PhD, Researcher, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopaedics at Soochow University, Suzhou 215007, Jiangsu Province, China
About author:Huang Xiaoxiong, Master candidate, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopaedics at Soochow University, Suzhou 215007, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31771063 (to HF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨髓间充质干细胞：是一种具有高水平增殖能力的多能基质细胞，可分化为多种细胞，如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞在骨基质中起着重要的作用，因而在组织工程研究和再生医学应用领域引起广泛关注，但骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞与健康细胞相比有着较低的生长速率和成骨潜能。
低氧预处理：在进行体内干细胞移植或体外成骨分化前先进行一段时间的低氧环境培养可以提高干细胞的治疗潜力、成骨分化能力，如果在低氧条件下进行预处理，骨髓间充质干细胞在致命缺氧攻击后将存活更长时间并且保持更好的成骨分化能力。此外，低氧诱导因子1α通路的激活加速了体内骨再生，提示低氧是骨愈合的重要辅助因素。

背景：低氧是调节血管生成-成骨分化过程的主要驱动力之一，细胞在分化前进行低氧预处理能够保持干细胞干性和增强干细胞的成骨分化能力，但低氧预处理能否改善去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力尚不清楚。
目的：探讨低氧预处理对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响以及低氧诱导因子1α在其中的作用。
方法：首先建立去卵巢SD大鼠模型，提取假手术大鼠和去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞。将细胞分为3组，①正常组：假手术组大鼠骨髓间充质干细胞在常氧环境培养(体积分数21%氧气)；②骨质疏松组：去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞在常氧环境培养(体积分数21%氧气)；③低氧组：去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞在低氧环境培养(体积分数5%氧气)。采用CCK-8法检测第1，3，5，7天的吸光度值来反映各组细胞的增殖能力；在低氧环境培养72 h后，转移至正常培养箱进行成骨诱导分化14 d，采用茜素红染色和qRT-PCR检测成骨相关基因表达水平。最后将骨质疏松组骨髓间充质干细胞转染小干扰RNA沉默低氧诱导因子1α表达，在低氧环境培养72 h，转移至正常培养箱进行成骨诱导分化14 d，观察沉默低氧诱导因子1α后成骨能力变化。
结果与结论：①去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞增殖能力下降，同时成骨分化能力受损；②低氧环境可以促进去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞增殖，提高钙结节的沉积以及成骨相关基因的表达；③沉默低氧诱导因子1α后，低氧预处理改善成骨能力的效应被消除；④结果表明，低氧预处理可以改善去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化能力，低氧诱导因子1α在低氧预处理促进成骨分化过程中起到重要作用。
缩略语：骨髓间充质干细胞：bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMMSCs；低氧诱导因子1α：hypoxia -inducible factor 1α，HIF-1α

https://orcid.org/0000-0003-4062-0530(黄晓雄)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 骨质疏松, 低氧, 细胞增殖, 成骨分化, 低氧诱导因子1α

Abstract: BACKGROUND: Hypoxia is one of the main driving forces regulating the angiogenesis-osteogenesis differentiation process. Hypoxia treatment of cells before differentiation is considered to maintain the stemness and enhance the osteogenic potential of stem cells. However, it is not clear whether hypoxic precondition could improve the osteogenic potential of bone marrow mesenchymal stem cells derived from osteoporosis rat.
OBJECTIVE: To investigate the effects of hypoxic precondition on the osteogenic potential of bone marrow mesenchymal stem cells derived from osteoporosis rat and the role of hypoxia inducible factor-1α.
METHODS: Ovariectomized SD rat models were established. Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from femurs of female rats in ovariectomized group and sham operation group. The bone marrow mesenchymal stem cells were divided into three groups. In the normal group, the bone marrow mesenchymal stem cells extracted from the sham rats were cultured in the incubator with normal oxygen concentration (21% O2). In the osteoporosis group, the bone marrow mesenchymal stem cells extracted from the ovariectomized rats were cultured in the incubator with normal oxygen concentration (21% O2). In the hypoxia group, the bone marrow mesenchymal stem cells extracted from the ovariectomized rats were cultured in the hypoxic incubator with hypoxic oxygen concentration (5% O2). CCK-8 assay was used to assess the proliferation capacity of bone marrow mesenchymal stem cells by measuring absorbance values at 1, 3, 5, and 7 days. After 72 hours of incubation in hypoxic environment, cells were moved to normal incubator for osteogenic differentiation with other two groups for 14 days. Alizarin red staining and qRT-PCR were utilized to detect osteogenic related gene expression levels. Finally, the bone marrow mesenchymal stem cells of the osteoporosis group were transfected with small interfering RNA to silence the expression of hypoxia inducible factor-1α, cultured in a hypoxic environment for 72 hours, and transferred to a normal incubator for osteogenic differentiation for 14 days. The changes in osteogenic capacity were observed after silencing hypoxia inducible factor-1α. After the silence of HIF-1α, the expressions of HIF-1α and osteogenic markers were furthered detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The proliferation ability of bone marrow mesenchymal stem cells in ovariectomized rats decreased, and the osteogenic differentiation ability was impaired. (2) Hypoxia successfully accelerated the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells, promoted the deposition of matrix mineralization and the expression of osteogenic related genes. (3) Positive effects of hypoxic precondition on osteogenic potential after the silence of hypoxia inducible factor-1α were eliminated. (4) Results suggested that hypoxic precondition could improve the proliferation and osteogenic potential of bone marrow mesenchymal stem cells of ovariectomized rats and hypoxia inducible factor-1α activated by hypoxia may play an important effect on osteogenic differentiation.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, osteoporosis, hypoxia, cell proliferation, osteogenic differentiation, hypoxia inducible factor-1α

中图分类号:

黄晓雄, 陈维凯, 刘滔, 杨惠林, 何帆. 低氧预处理改善去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2034-2039.

Huang Xiaoxiong, Chen Weikai, Liu Tao, Yang Huilin, He Fan. Hypoxic precondition rescues osteogenic potential of bone marrow mesenchymal stem cells derived from ovariectomized rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(13): 2034-2039.

图/表（结果） 6

2.1 骨质疏松模型建立情况两组大鼠实施手术后3个月，使用Micro-CT和3D重建来观察骨组织形态结构，CT显示去卵巢组骨量明显下降，骨小梁数目明显降低，见图1A；去卵巢组骨密度、骨容积比远低于假手术组，但是骨小梁分离度大于假手术组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图1B-D，结果说明去卵巢组大鼠已患骨质疏松。

2.2 低氧对去卵巢大鼠BMMSCs增殖能力的影响正常组、骨质疏松组、低氧组BMMSCs形态相似，BMMSCs分散在培养瓶里，单个细胞形态为长梭形，融合细胞呈放射状或编织状生长，见图2。CCK-8结果显示在培养第3，5，7天，骨质疏松组BMMSCs吸光度值远远低于正常组，低氧组BMMSCs吸光度值高于骨质疏松组，证明骨质疏松来源BMMSCs增殖能力受损，并且低氧可以改善骨质疏松来源BMMSCs的增殖能力，见图3。

2.3 低氧预处理对去卵巢大鼠BMMSCs成骨潜能的影响正常组BMMSCs的钙结节最多，低氧组BMMSCs次之，骨质疏松组BMMSCs的钙结节最少，见图4A；茜素红染色定量分析结果与上述一致(P < 0.01)，见图4B。成骨相关基因检测显示，骨质疏松组BMMSCs的RUNX2、SP7 (osterix)、BGLAP mRNA表达量低于正常组，分别下降了约60%，80%，63%，差异有显著性意义(P < 0.01)，低氧组BMMSCs相对于骨质疏松组又有明显提高，分别上升了约61%，280%，72%，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图4C，提示低氧预处理可以改善骨质疏松来源BMMSCs受损的成骨潜能。

2.4 HIF-1α对低氧预处理促进去卵巢大鼠BMMSCs成骨的作用 qRT-PCR检测发现低氧使去卵巢大鼠BMMSCs的HIF-1α表达上调(P < 0.01)，见图5A。为了进一步探究低氧预处理促进去卵巢大鼠BMMSCs成骨分化的可能机制，采用HIF-1α小干扰RNA和阴性对照组(NC-siRNA)转染沉默低氧组BMMSCs的HIF-1α表达，qRT-PCR检测发现HIF-1α小干扰RNA组的HIF-1α表达量相对于阴性对照组和未转染组显著下降，说明干扰RNA序列本身不起作用以及HIF-1α小干扰RNA转染成功，见图5A。将未转染组、HIF-1α小干扰RNA组、阴性对照组BMMSCs在低氧培养箱培养72 h后转移到正常培养箱进行14 d的成骨诱导，HIF-1α小干扰RNA组矿化水平显著低于未转染组和阴性对照组(P < 0.01)，和正常培养的去卵巢大鼠BMMSCs的矿化水平没有明显差异(P > 0.05)，见图5B，C；HIF-1α小干扰RNA组成骨相关基因(RUNX2，SP7，BGLAP)的表达量也低于未转染组和阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图5D。

2.5 生物相容性 BMMSCs具有高度的可塑性并在一定条件下可向成骨细胞分化等优点使其可以在不同个体间移植。该研究发现低氧对于BMMSCs没有毒副作用，相反的，低氧能够刺激BMMSCs增殖和保留干细胞成骨分化潜能，具有安全性及骨组织再生潜力。

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引言

骨质疏松症的好发群体为老年人与绝经后女性，导致骨质疏松症的关键因素为成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的失衡，成骨能力减弱使得骨质疏松症患者的骨量和强度大幅下降，由此导致骨折、残疾乃至死亡概率增大[1-2]。骨形成包括成骨细胞的迁移、基质的沉积和基质矿化，由于骨质疏松的病理形成因素复杂，在骨质疏松条件下恢复成骨能力十分困难[3]。
骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMMSCs)能够分化出诸多细胞，包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等[4]。保持BMMSCs的最佳分化平衡在维持足够数量的成骨细胞以控制骨组织代谢和重塑等方面起着重要作用。但是，相对正常BMMSCs，骨质疏松来源BMMSCs的增殖能力和成骨潜能已经存在一定程度的损害[5]。
BMMSCs向成骨细胞方向分化是骨形成的重要条件[6]。许多研究已经探索了标准组织培养条件下的成骨分化，通常使用体积分数为21%氧气。骨前体细胞驻留在低氧环境的干细胞憩室中，而低氧微环境被认为是一个更接近干细胞生理条件的微环境[7]。有研究证实，低氧预处理对低氧条件下细胞植入与存活具有改善作用，可增强BMMSCs的成骨潜能。此外，低氧条件下的干细胞能够更好地维持干性，低氧预处理后的细胞则能表现出更强的分化能力[8]。低氧诱导因子1α(hypoxia -inducible factor 1α，HIF-1α)在细胞处于低氧时可被激活，同时可释放巨大效能，加速体内骨再生，提示低氧是骨愈合的重要辅助因素[9-10]。目前，关于低氧预处理能否改善骨质疏松大鼠BMMSCs的成骨分化潜能尚不明确，因此，该研究探索低氧预处理对骨质疏松大鼠BMMSCs成骨分化能力的影响，以及进一步研究HIF-1α在其中所发挥的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计动物模型建立和细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2019年9月至2020年8月在苏州大学骨科研究所完成。
1.3 材料胰酶、胎牛血清、PBS、α-MEM培养基(美国Hyclone公司)；红细胞裂解液(北京生物技术研究所)；抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠、茜素红、TRIzol(美国Sigma公司)；CCK-8试剂盒(碧云天)；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(Takara，日本)；二氧化碳细胞培养箱与低氧培养箱(长沙华曦电子科技有限公司)；酶标仪(美国Bio-Tek公司)；倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；细胞培养瓶/板(NEST公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物模型建立所有动物实验均严格遵守苏州大学伦理委员会的要求(编号SUDA20201224A02)。雌性SD大鼠12只，8周龄，体质量(200.0±5.6) g，购自苏州大学动物中心，随机分成去卵巢组6只和假手术组6只。采用3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后将大鼠仰卧于手术台上，在两侧髂嵴水平处沿后正中线向上作一纵形皮肤切口，长约1 cm，钝性分离皮下组织、肌肉，切开深处腹膜，进入腹腔后充分暴露手术视野，可见粉红色桑葚样卵巢及淡红色输卵管，将其钝性游离，去卵巢组大鼠建立骨质疏松模型，即在距卵巢5 mm处结扎输卵管及伴随血管，切除卵巢及周围脂肪组织，然后按相同的方法摘除对侧卵巢，逐层缝合腹膜及皮肤，碘伏消毒；假手术组大鼠实施和去卵巢组相同的手术操作但是保留双侧卵巢。
1.4.2 μCT分析造模后3个月进行μCT分析。用Micro-CT(Skyscan1176，Kontich，比利时)扫描大鼠股骨，分辨率为18 µm，能量为65 kV和385 µA，利用NRecon v1.6和CTAn v1.13.8.1软件进行三维重建。选定股骨远端的松质骨作为感兴趣区域，采用骨密度、骨容积比、骨小梁分离度3个指标评价骨微结构。

1.4.3 BMMSCs的体外培养假手术组和去卵巢组大鼠造模3个月后处死，无菌条件下取出股骨，用针头吸取α-MEM培养基插入股骨骨髓腔反复冲洗，收集冲洗液，加入红细胞裂解液充分裂解去除红细胞，重悬离心后用标准培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的α-MEM培养基)吹打细胞并接种于T75培养瓶中，放置在37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中培养，待原代细胞融合80%左右，用胰酶将贴壁细胞消化下来，并再次接种传代，以下实验中使用的是第2代细胞。

1.4.4 细胞实验分组 ①正常组：假手术组大鼠BMMSCs在常氧环境培养(体积分数21%氧气)；②骨质疏松组：去卵巢大鼠BMMSCs在常氧环境培养(体积分数21%氧气)；③低氧组：去卵巢大鼠BMMSCs在低氧环境培养(体积分数5%氧气)。
1.4.5 细胞增殖实验向96孔板内接种各组第2代BMMSCs，接种细胞浓度为1×107 L-1，各孔接种量为100 μL，分别在第1，3，5，7天进行CCK-8实验：吸掉96孔板原有培养基，每孔加入100 μL CCK-8溶液，将96孔板放置在培养箱中避光孵育1 h，用酶标仪在450 nm波长处测得相应的吸光度值。
1.4.6 成骨分化和茜素红染色将各组第2代BMMSCs以1×104/cm2接种于12孔板，正常组和骨质疏松组放置于正常培养箱中培养，低氧组放置于氧气体积分数为5%的低氧培养箱中培养，待细胞生长至60%密度后，换为成骨诱导培养液，均在正常培养箱中培养14 d，成骨诱导液组成： α-MEM培养基、体积分数10%胎牛血清、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L L-抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油，成骨诱导液每3 d更换1次。成骨分化14 d后用茜素红染色检测矿化水平，首先用40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，随后加入配好的0.1%茜素红溶液(pH值4.3)室温放置约15 min，用Olympus IX5显微镜拍摄图片，然后进行定量分析，每孔加入200 μL 5%高氯酸溶液，待钙结节充分被溶解后，用酶标仪测定每孔在420 nm波长处吸光度值。
1.4.7 实时定量反转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR) 成骨分化14 d后，参照说明书，通过Trizol试剂完成BMMSCs内总RNA的提取，按反转录试剂盒说明书制备同等浓度的RNA体系，再借助反转录仪经反转录得到cDNA，根据iTaq Universal SYBR Green Supermix试剂操作指导，开展扩增测定。表1为相关引物序列。

1.4.8 基因沉默 HIF-1α小干扰RNA(siRNA)、阴性对照组小干扰RNA(NC-siRNA)均购自苏州吉玛基因股份有限公司。HIF-1α-siRNA序列：5′- GGG CCG UUC AAU UUA UGA ATT-3′；NC-siRNA序列：5′-GAG CUC CCA UCU UGA UAA ATT-3′。将骨质疏松组BMMSCs以30%-50%密度培养在12孔板中，参考说明书，借助Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific)完成HIF-1α小干扰RNA向细胞内转染。将未转染组、HIF-1α小干扰RNA组、阴性对照组BMMSCs在低氧培养箱培养72 h
后转移到正常培养箱进行14 d的成骨诱导，茜素红染色检测矿化水平，qRT-PCR检测成骨基因的表达。
1.5 主要观察指标 ①μCT分析骨密度及骨小梁参数；②各组细胞增殖能力；③各组细胞矿化能力和成骨基因的表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行分析，数据以均值±标准误表示，使用成组t检验比较组间差异，P < 0.05或P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

大多数涉及干细胞的研究通常是在常氧环境下进行的，而未考虑大多数干细胞通常生长在体内低氧环境中，因此，能够改善骨质疏松条件下BMMSCs成骨能力的培养条件值得探索，研究BMMSCs对氧气等有效信号分子的反应能力，也是为了在骨再生医学和组织工程背景下优化基于干细胞的治疗方法[11]。
临床上慢性阻塞性肺疾病和骨质疏松症具有密切的相关性，有大量临床研究发现慢性阻塞性肺疾病患者骨小梁数量、松质骨容量、骨小梁厚度、骨皮质厚度比正常人都有所降低，而骨连接密度降低，骨小梁间距和骨皮质孔隙增加，骨矿化沉积速率降低，这可能与慢性阻塞性肺疾病患者合并慢性呼吸衰竭低氧血症有关，低氧抑制了干细胞向成骨方向分化[12-14]。因此，作者认为低氧保留了干细胞向成骨分化的能力，即维持了干细胞的干性。近年来低氧已被证实是一种可以通过上调HIF-1α激活关键信号通路、提高干细胞活力的有效方式。多项研究发现，低氧预处理可以增加干细胞在缺血性疾病、脑外伤、肝细胞再生中的治疗效果[15-17]。然而，低氧预处理对骨质疏松大鼠BMMSCs成骨能力的影响还未有相关报道。
该实验首先建立去卵巢大鼠模型，提取假手术大鼠和去卵巢大鼠BMMSCs，通过观察发现去卵巢大鼠BMMSCs的增殖能力较差，成骨能力受损，这与先前的研究是一致的[18]。实验进一步使用低氧培养箱模拟氧气体积分数为5%的低氧环境，观察到低氧环境下的去卵巢大鼠BMMSCs比正常氧气环境下的去卵巢大鼠BMMSCs增殖更快。事实上，大量关于低氧培养对干细胞增殖的报道既有上调也有下调，文献报道的差异可能是由于不同的细胞、不同的实验方案、不同的培养基组成和不同的氧气体积分数以及不同的低氧时间等因素导致的[16]。为了观察低氧预处理能否恢复去卵巢大鼠BMMSCs分化潜能这个问题，一组细胞在常氧环境(体积分数21%氧气)成骨诱导之前，先在体积分数5%氧气中扩增72 h；另一组细胞在常氧环境(体积分数21%氧气)下扩增，此后它们继续在常氧环境(体积分数21%氧气)开始成骨诱导，结果显示低氧预处理后的去卵巢大鼠BMMSCs基质矿化明显增多，成骨相关基因RUNX2、SP7、BGLAP表达水平明显上升。成骨分化过程受到氧张力变化的干扰，而恒定的常氧条件支持分化过程，这也解释了为什么BMMSCs可以在恒定常氧条件下分化，也可以在缺氧条件下生长72 h然后在低氧条件下分化。EZASHI等[19]报道显示低氧环境可以减少常氧条件下的自发性分化，维持干细胞的多能状态，所以低氧环境更类似于干细胞的生理位，从而保留了干细胞的干性。
当暴露于缺氧环境时，细胞会触发一系列复杂的信号级联反应，其中HIF-1α起着主导作用，缺氧通过抑制HIF-1α的降解来稳定HIF-1α[20]。HIF-1α导致一系列基因的上调，在低氧条件下协调细胞代谢和存活[10，21]。实验首先发现HIF-1α在低氧组表达量明显升高，为了进一步说明HIF-1α在低氧处理改善去卵巢大鼠BMMSCs成骨潜能中的作用，使用小干扰RNA沉默HIF-1α，发现HIF-1α水平下降的同时低氧预处理去卵巢大鼠BMMSCs的矿化水平也下降，成骨标志物RUNX2、SP7、BGLAP的表达也下调，逆转了低氧预处理对去卵巢大鼠BMMSCs成骨能力的促进作用，由此说明了HIF-1α在低氧处理改善去卵巢大鼠BMMSCs成骨潜能中起到关键作用。
实验还有很多不足之处：首先，判断成骨能力只检测了矿化沉积的量和RUNX2、SP7、BGLAP基因的表达，未检测相关蛋白的表达；其次，HIF-1α改善成骨潜能没有与抗氧化、抗衰老或抗炎症等因素相结合；最后，仅体外实验证明了低氧预处理改善去卵巢大鼠BMMSCs的成骨潜能，后续实验将重点研究低氧预处理在体内动物实验中的运用，如将去卵巢大鼠在低氧环境中饲养一段时间类似于高原反应，再放置在正常环境中吸入正常氧气浓度，经过一段时间成骨修复，通过μCT检测其骨密度，并分离原代细胞进行成骨能力检测。
结论：通过此次研究能够证实，低氧预处理能提高去卵巢大鼠BMMSCs的增殖能力和成骨分化潜能，低氧激活的HIF-1α发挥着关键性的调节作用。作者认为低氧是细胞成功治疗的有用工具，未来还需要大量研究去探索如何利用低氧微环境和HIF-1α的靶向药物治疗。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

低氧预处理改善去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能

Hypoxic precondition rescues osteogenic potential of bone marrow mesenchymal stem cells derived from ovariectomized rats

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