人尿源性干细胞来源外泌体的提取及鉴定

doi:10.12307/2022.333

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (13): 2056-2061.doi: 10.12307/2022.333

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人尿源性干细胞来源外泌体的提取及鉴定

王帅1，李超然2，章茜茹3，黄桂林4

1遵义医科大学口腔医学院，贵州省遵义市 563000；2同济大学附属东方医院，上海市 310000；3贵州中医药大学第一附属医院，贵州省贵阳市 550002；4遵义医科大学附属口腔医院，贵州省遵义市 563003

收稿日期:2020-12-14 修回日期:2020-12-18 接受日期:2021-01-23 出版日期:2022-05-08 发布日期:2021-12-20
通讯作者: 王帅，博士，副教授，遵义医科大学口腔医学院，贵州省遵义市 563000 黄桂林，博士，教授，遵义医科大学附属口腔医院，贵州省遵义市 563003
作者简介:王帅，男，1982年生，山东省青岛市人，汉族，2015年加拿大麦吉尔大学毕业，博士，副教授，主要从事干细胞生物学、骨组织再生以及口腔种植学的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81860193)，项目负责人：王帅；贵州省科技厅项目(黔科合基础【2016】1170，黔科合基础【2019】1340)，项目负责人：王帅；贵州省教育厅青年科技人才成长项目(黔教合KY字【2016】198)，项目负责人：王帅

Isolation and identification of human urine-derived stem cell-derived exosomes

Wang Shuai1, Li Chaoran2, Zhang Xiru3, Huang Guilin4

1School of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; 2Dongfang Hospital Affiliated to Tongji University, Shanghai 310000, China; 3First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, Guizhou Province, China; 4Hospital of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China

Received:2020-12-14 Revised:2020-12-18 Accepted:2021-01-23 Online:2022-05-08 Published:2021-12-20
Contact: Wang Shuai, PhD, Associate professor, School of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China Huang Guilin, MD, Professor, Hospital of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
About author:Wang Shuai, PhD, Associate professor, School of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81860193 (to WS); a grant from Department of Science and Technology of Guizhou Province, No. [2016]1170 (to WS), No. [2019]1340 (to WS); the Youth Science and Technology Talents Growth Project of Guizhou Provincial Education Department, No. [2016]198 (to WS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
人尿源性干细胞：是一种可能来源于肾脏的祖细胞/干细胞，不仅稳定地高表达间充质干细胞特异性表面标志物(CD29、CD44、CD54、CD73、CD105、CD16)，还能表达胚胎干细胞特异性标志物(SSEA4、TRA-1-81、Sox2、Oct3/4)。与其他干细胞相比，其具有取材无创，提取分离步骤简便，较高的端粒酶活性和较长的端粒序列，良好的多向分化潜能以及安全性高、无致瘤性等优点。
外泌体：是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成直径40-100 nm的膜性脂质小囊泡，其内含有功能性蛋白质、mRNA、microRNA及长链非编码RNA等物质，在细胞间的信息传递过程中发挥重要作用，其载有的mRNA可在靶细胞内翻译出相应蛋白质，载有的microRNA可通过降解靶细胞内mRNA或抑制mRNA翻译来调控目的蛋白的表达。研究证实，外泌体参与机体的各种生理或病理过程，如免疫调节、肿瘤转移、遗传信息交换、细胞增殖及凋亡、血管新生等。

背景：近年来研究发现，干细胞所发挥的组织修复与再生功能在很大程度上是通过旁分泌作用实现的，外泌体作为其中一种重要的旁分泌因子，已经被证实在心脏、神经、骨、视网膜损伤修复及再生方面发挥重要作用，研究人员也在寻找更好的干细胞来源外泌体。
目的：提取并鉴定人尿源性干细胞来源外泌体。
方法：收集健康成年男性新鲜尿液，采用贴壁培养法分离得到人尿源性干细胞，对其进行培养、传代。流式细胞术鉴定其表面标记物，体外定向诱导其向成骨细胞、脂肪细胞分化，分别采用茜素红、Von Kossa和油红O染色进行鉴定。采用改良超高速离心法从人尿源性干细胞培养上清中提取外泌体，透射电镜观察其形态，纳米颗粒跟踪分析其大小及浓度，蛋白质免疫印迹法检测其特异性蛋白CD9、CD63和HSP70的表达。
结果与结论：①人尿源性干细胞培养3-5 d后开始贴壁生长，细胞在原代时呈“铺路石”样，第1代和第2代细胞呈“米粒”样，传至第3代后逐渐呈“纺锤形”或“梭形”；流式细胞仪检测结果显示人尿源性干细胞阳性表达间充质干细胞的特异表面标志物CD44、CD73、CD90和CD105；人尿源性干细胞经成骨、成脂诱导培养后能成功分化为成骨细胞、脂肪细胞；②经过低速、高速、超高速序列离心方法，从人尿源性干细胞的条件培养基中提取外泌体，透射电镜观察呈圆形或者椭圆形膜性囊泡样，形似“茶托”，大小主要集中在64-141 nm之间，蛋白质免疫印迹分析显示人尿源性干细胞来源外泌体表达CD9、CD63和HSP70蛋白；③该研究证实了改良超高速离心法提取人尿源性干细胞外泌体的可行性。
缩略语：人尿源性干细胞来源外泌体：exosomes secreted by human urine-derived stem cells，hUSCs-Exo

https://orcid.org/0000-0001-6805-7239(王帅)；https://orcid.org/0000-0003-3224-7094(黄桂林)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 人尿源性干细胞, 外泌体, 超高速离心, 成骨分化, 粒径, 纳米

Abstract: BACKGROUND: Recent studies have found that the tissue repair and regeneration function of stem cells are largely realized by paracrine function. Exosomes, as one of important paracrine factors, have been proven to play an important role in the repair and regeneration of heart, nerve, bone and retina injury. Researchers are looking for a better source of stem cells-derived exosomes.
OBJECTIVE: To isolate and identify exosomes secreted by human urine-derived stem cells.
METHODS: Human urine-derived stem cells were isolated from urine of healthy male adults and then cultured and passaged. The surface markers were identified by flow cytometry. Human urine-derived stem cells were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes, and identified by alizarin red, Von Kossa and oil red O staining, respectively. Modified ultra-high speed centrifugation was used to isolate exosomes secreted by human urine-derived stem cells from human urine-derived stem cells conditioned medium. Transmission electron microscopy was used to analyze their morphology. Nanoparticle Tracking Analysis was used to analyze the size and concentration. Western blot assay was used to detect the expression of specific protein CD9, CD63 and HSP70.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Adherent cell growth was identified in human urine-derived stem cells after 3-5 days of culturing. They resembled “slabstone” in the primary passage, and then resembled “rice” in the first and second passages, and in the third passage, they gradually turned into a “spindle-like shape” or “shuttle-like shape”. Flow cytometry results showed the positive expression of human urine-derived stem cells with mesenchymal stem cell specific surface markers (CD44, CD73, CD90 and CD105). After osteogenic and adipogenic induction in vitro, human urine-derived stem cells successfully differentiated into osteoblasts and adipocytes. (2) After low speed, high speed, ultra-high speed centrifugation, exosomes secreted by human urine-derived stem cells were extracted from conditioned medium of human urine-derived stem cells. Observation by transmission electron microscope showed round or oval membranous vesicles, resembling “saucer”, mainly concentrated with the size of 64-141 nm. Western blot assay showed the protein expression of CD9, CD63 and HSP70 in the exosomes secreted by human urine-derived stem cells. (3) This study confirmed the feasibility of the improved ultra-high speed centrifugation method to extract the exosomes secreted by human urine-derived stem cells.

Key words: stem cells, human urine-derived stem cells, exosomes, ultrahigh speed centrifugation, osteogenic differentiation, particle size, nanoparticle

中图分类号:

王帅, 李超然, 章茜茹, 黄桂林. 人尿源性干细胞来源外泌体的提取及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2056-2061.

Wang Shuai, Li Chaoran, Zhang Xiru, Huang Guilin. Isolation and identification of human urine-derived stem cell-derived exosomes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(13): 2056-2061.

图/表（结果） 4

2.1 人尿源性干细胞形态学变化接种3-5 d后可见细胞贴壁生长，形态呈“铺路石”状，形态不均一，还可见少量丝状非细胞样结构，见图1A；每2 d换液，培养13-16 d时细胞增长达到24孔板1/2融合，此时传代至6孔板，细胞增殖速度明显加快，细胞形态多数呈“米粒”状，见图1B，继续将细胞传代至T25培养瓶中，细胞形态仍以“米粒”状居多，见图1C，继续传代，从第3代开始细胞逐渐呈“纺锤形”或“梭形”，见图1D-H，细胞均一性明显提高，细胞活力和状态达到最佳，至第8代后细胞形态均一性及细胞密度有所下降。

2.2 人尿源性干细胞表面标志物流式细胞仪分析表明，间充质干细胞特异性标志物CD44、CD73、CD90和CD105呈阳性表达，见图2A-D，而造血干细胞标志物CD19、CD34、CD45、CD11b和HLA-DR呈阴性表达，见图2E。该实验结果表明人尿源性干细胞符合间充质干细胞的特征。

2.3 人尿源性干细胞的成脂、成骨分化能力茜素红染色和Von Kossa染色结果呈阳性，1号液诱导组和2号液诱导组均有钙盐矿化结节形成，且2号液诱导组矿化结节形成较1号液诱导组明显增多，见图3A-C，茜素红染色矿化结节定量分析结果显示1号液诱导组和2号液诱导组吸光度值均较对照组明显增高，见图3D，差异有显著性意义(P < 0.05)，且2号液诱导组较1号液诱导组形成的矿化结节多(P < 0.05)。人尿源性干细胞成脂诱导21 d后，油红O染色呈阳性反应，形成了一定数量的鲜红色的脂滴，见图3E。

2.4 hUSCs-Exo的形态特征、大小及特异性蛋白表达经过低速、高速、超高速序列离心后可见少量白色沉淀呈圈状位于管底侧壁，见图4A，沉淀附着较牢，倾斜或轻微振荡离心管不会引起沉淀脱落。在透射电镜下观察所得样本大小在30 nm至130 nm之间不等，镜下呈形态基本一致的圆形或者椭圆形膜性囊泡样，形似“茶托”，见图4B，符合外泌体的形态特征。纳米颗粒跟踪分析结果显示：超高速离心得到的沉淀中颗粒大小主要集中在64-141 nm，见图4C，符合外泌体的大小特征，获得外泌体的浓度为3.56×1011 L-1。蛋白质免疫印迹法检测结果显示，hUSCs–Exo中检测到了进化保守蛋白CD9、CD63和HSP70，而对照组(人尿源性干细胞裂解液)则不表达，见图4D，进一步证实了从人尿源性干细胞培养上清液中提取的纳米级囊泡为外泌体。

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引言

近年来研究发现，干细胞所发挥的组织修复与再生功能并不是在损伤部位的增殖与分化，在很大程度上是通过旁分泌作用释放细胞外囊泡而实现的[1-2]。细胞外囊泡是活细胞释放的纳米级囊泡，不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流，有学者认为细胞外囊泡是细胞间沟通和循环的重要媒介以及疾病诊断和预后的生物学标志[3]。细胞外囊泡根据直径大小分为3类，直径范围50-150 nm的外泌体，直径范围100-1 000 nm的微囊泡、外粒体和微颗粒，直径范围100-5 000 nm的凋亡小体[4]。外泌体作为其中一种重要的旁分泌因子，已经被证实在心脏、神经、骨、视网膜损伤修复及再生方面发挥重要作用[5-8]，得到了组织工程和再生医学领域学者们的诸多关注。因此，研究人员也在寻找更好的干细胞来源外泌体。ZHANG等[9]最早从人尿液中获得尿源性干细胞，是一种新型的成体干细胞，因尿液来源广泛、采集方便、安全、无创、低价，同时尿源干细胞可以取自患者自身，避免了免疫排斥反应和伦理问题，因此，人尿源性干细胞无论在细胞治疗、组织工程还是再生医学中都具有相当广阔的应用前景。同样，人尿源性干细胞来源外泌体(exosomes secreted by human urine-derived stem cells，hUSCs-Exo)也被发现可促进伤口愈合与再上皮化[10]，并且能够促进大鼠股骨骨不连的愈合[11]，对1型糖尿病大鼠的肾脏也具有保护作用[12]。该实验进行了hUSCs-Exo提取方法的研究，并对所提取的外泌体进行相关鉴定，旨在建立成熟、适合的hUSCs-Exo分离和鉴定方法，为hUSCs-Exo在口腔颌面部骨组织再生的深入研究以及遴选更好的干细胞来源外泌体提供依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞模型，随机对照实验，单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2017年12月至2019年5月在遵义医科大学附属医院贵州省细胞工程重点实验室、基础药理教育部重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 人无菌尿液的收集所有尿液样本来源于成年男性健康志愿者，年龄在20-30岁之间，排除泌尿系统疾病、传染病、代谢性疾病和恶性肿瘤。志愿者在留取尿液前洗手，用体积分数为70%乙醇充分清洁消毒尿道外口及周围。无菌容器(玻璃瓶500 mL，经高温高压烘干冷却后使用)内预先放入2.5 mL青链霉素及5 mL胎牛血清，收集健康成年男性新鲜中段尿200 mL。
1.3.2 实验试剂和仪器胎牛血清(Gibco，美国)；DMEM培养基(Gibco，美国)；KSFM培养基(Gibco，美国)；F-12培养基(Gibco，美国)；牛脑垂体提取液(Sclen Cell，美国)：CO2恒温细胞培养箱(Thermo，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；流式细胞仪(Beckman，美国)：超速离心机(Beckman，美国)；低温高速离心机(Eppendorf，德国)。
1.4 实验方法

1.4.1 人尿源性干细胞的分离培养收集健康成年男性新鲜中段尿样200 mL即时分装至4个50 mL无菌离心管，1 500 r/min室温离心5 min后弃上清，每管均剩余0.3-0.5 mL液体；每管加入3 mL人尿源性干细胞基础培养基[由KSFM培养基和祖细胞培养基(3/4 DMEM培养基、1/4 Hamm’s F-12培养基)按1∶1比例组成]重悬沉淀，轻轻吹打混匀后的细胞悬液加至24孔板中，放入CO2恒温细胞培养箱，2 d后换液，待贴壁细胞融合率达24孔板每孔的1/3-1/2时消化传代，此为原代人尿源性干细胞，每2 d换液，待细胞融合至90%时再次传代。取状态良好的第3代细胞消化制成细胞悬液并计数备用。

1.4.2 人尿源性干细胞免疫表型鉴定取第3代生长良好的人尿源性干细胞，0.25%胰酶消化成单细胞悬液，PBS吹打重悬细胞，调整细胞浓度至1×109 L-1，吸取200 μL细胞悬液加入EP管，并于EP管内分别加入10 μL CD90、CD44、CD105、CD73及CD19、CD34、CD45、CD11b和HLA-DR单克隆抗体液，室温避光孵育30 min，PBS清洗重悬，放入流式细胞仪进行检测。
1.4.3 人尿源性干细胞诱导分化检测取90%融合的第3代人尿源性干细胞，更换成骨诱导培养基1号液或2号液(成骨诱导培养基1号液：低糖 DMEM培养液1 L，地塞米松10-7 mol，β-甘油磷酸钠2.16 g，维生素C 50 mg，胎牛血清100 mL；成骨诱导培养基2号液：低糖 DMEM 培养液 1 L，地塞米松10-7 mol，β-甘油磷酸钠2.16 g，维生素C 100 mg，胎牛血清100 mL)及成脂诱导培养基(成脂诱导培养基A液：DMEM基础培养基，体积分数为10%胎牛血清，1%双抗，1%谷氨酰胺，10-6 mol/L 地塞米松、0.2 mmol/L吲哚美辛、10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤；成脂诱导培养基B液：DMEM基础培养基，体积分数为10%胎牛血清，1%双抗，1%谷氨酰胺，10 mg/L胰岛素)，每3 d换液1次，培养21 d后移除培养基，PBS清洗3次后进行以下检测。①茜素红染色：40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗，加入茜素红染液染色3-5 min，蒸馏水清洗，倒置显微镜下观察拍照；②茜素红染色定量分析：成骨诱导培养皿中加入1 mL 10%氯化烷基十六吡啶，室温静置30 min，取100 μL于96孔板，每组设5个复孔，酶标仪在562 nm波长下检测各孔的吸光度值，定量分析各组矿化结节含量；③Von Kossa染色：40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，梯度乙醇水化，蒸馏水漂洗后加入5%硝酸银溶液，孵育箱中放置1 h，白炽灯下曝光30 min，蒸馏水漂洗，倒置相差显微镜下观察拍照；④油红O染色：40 g/L多聚甲醛室温固定230 min，PBS清洗，加入油红O染液染色15 min，PBS洗涤未结合油红O染液，倒置显微镜下观察拍照。
1.4.4 hUSCs-Exo的提取待第3代人尿源性干细胞融合约80%后，PBS清洗，更换人尿源性干细胞无血清培养基，继续培养48 h，收集细胞上清液，4 ℃ 300×g离心10 min，4 ℃ 2 000×g离心10 min，4 ℃ 10 000×g离心30 min后，得到的上清液经0.22 μm过滤器过滤并转移至超速离心管中，经过连续2次4 ℃ 100 000×g超高速离心70 min后，得到hUSCs-Exo沉淀，将沉淀溶解于100 μL PBS中，转移至1.5 mL无菌EP管。
1.4.5 hUSCs-Exo的形态鉴定取hUSCs-Exo悬液10 μL滴于孔径2 nm的载样铜网上，室温下静置3-5 min，滤纸吸干液体，滴加3%磷钨酸溶液10 μL，室温环境下负染5 min，滤纸吸干负染液，将铜网置于透射电镜下，观察hUSCs-Exo形态并拍照。
1.4.6 纳米颗粒跟踪分析外泌体粒径将hUSCs-Exo注射至检测槽中，根据Nanosight-NS300记录的颗粒数调整稀释度，待机器读数，即可获得外泌体粒径分布数据。
1.4.7 Western blot鉴定hUSCs-Exo的表达蛋白取30 μg外泌体蛋白，以4∶1的比例与5×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，100 ℃水浴5 min后冷却至室温；上样并进行电泳，湿转膜封闭2 h；加入稀释好的一抗溶液[CD9(1∶1 000)，CD81 (1∶1 000)，HSP70(1∶1 000)]，4℃孵育过夜；洗膜后加入二抗[辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1∶2 000)]室温孵育2 h；用Odyssey荧光扫描系统检测PVDF膜的荧光。
1.5 主要观察指标 ①人尿源性干细胞免疫表型及诱导分化能力鉴定；②纳米颗粒跟踪分析hUSCs-Exo粒径；③Western blot鉴定hUSCs-Exo的表达蛋白。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计分析。实验结果以x±s表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，当方差齐时各组间数据的两两比较采用Tukey检验，若方差不齐时各组数据的两两比较采用Dunnett’s T3检验。检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

理想的干细胞来源是组织工程技术成功的关键因素之一。人尿源性干细胞因其提取于尿液，来源广泛、采集方便，且分离过程仅涉及物理离心，操作简单，耗时短，可以最大限度地减少人尿源性干细胞损伤和丢失，并且其可以取自患者自身，避免了免疫排斥反应和伦理问题。较之目前运用于组织工程领域的常用干细胞，有着自身的优势，可作为一种理想的新的干细胞来源。该研究采用贴壁法提取人尿源性干细胞，并采用流式细胞法对其进行了表型鉴定，结果显示符合间充质干细胞的特征，高表达间充质干细胞特异性表面标志物，并通过调整成骨诱导液的成分对人尿源性干细胞成骨诱导分化条件进行了优化，发现添加100 mg/L维生素C可以促进人尿源性干细胞更好地向成骨细胞分化，初步验证了人尿源性干细胞具有良好的成骨分化潜力。
外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外隙或生物学体液中的膜性囊泡[13] ，直径为30-200 nm，具有双层膜结构，呈茶杯状形态[14]，广泛存在于人体体液中，包含有蛋白质、RNA、miRNA和DNA片段等多种成分[15-16]，参与人体许多重要的生理或病理过程，在细胞通讯、迁移、免疫反应等方面起了重要的作用，影响疾病的发生发展[17]。目前，根据外泌体的各种理化性质，常用的分离方法包括超速离心法、蔗糖密度梯度法、超滤法、exo-quick试剂盒法、免疫磁珠法等[18]。蔗糖密度梯度离心法分离的外泌体纯度虽高，但其配制蔗糖垫需要重水，且提取过程复杂，技术难度较高，不易普及。exo-quick试剂盒法虽然耗时短且能获得更高的外泌体产量[19]，但其获得的外泌体杂质较多，且试剂盒较为昂贵。超速离心法因其分离纯度较高，相对获得量大，是提取外泌体最广泛的“金标准”[20]。此次实验对传统的超高速离心法进行了改良，将收集的细胞条件培养基首先在300×g条件下离心，去除残存细胞，然后在2 000×g条件下离心，去除死细胞，接着在10 000×g条件下离心，去除细胞碎片，外泌体的直径范围在50-150 nm，因此采用直径0.22 μm的滤器对上清液进行过滤，可以将更小的细胞碎片及大于220 nm的细胞外囊泡全部去除，起到了纯化和浓缩的作用，节省了外泌体提取试剂并且可以获得更多更纯的外泌体；透射电镜下观察提取物，发现背景杂质少，颗粒外观符合外泌体典型特征；采用纳米颗粒跟踪技术对hUSCs-Exo的布朗运动轨迹进行分析，计算其浓度与粒径，结果显示：外泌体粒径范围为64-141 nm，均值为135.3 nm，在外泌体理论的粒径范围内；CD63、CD9和HSP70蛋白在外泌体中呈现阳性表达，符合外泌体特征。因此，可以认为人尿源性干细胞可以稳定地分泌外泌体，且易于提取。
虽然目前尚缺乏有关hUSCs-Exo用于颌面部骨组织再生的相关报道，但有学者研究发现hUSCs-Exo含有骨形态发生蛋白7，提示hUSCs-Exo可能对成骨分化具有明显促进作用[12]，这也为颌面部骨再生研究提供了新的思路。国内学者发现hUSCs-Exo可促进移动性牙根吸收的修复，有效改善牙槽骨密度[21]。该研究建立了一种稳定、高效的人尿源性干细胞提取、培养方法，并利用超速离心结合过滤法提取hUSCs-Exo，经鉴定证实了该方法用于提取hUSCs-Exo的可行性，为后续hUSCs-Exo在口腔颌面部骨组织再生的深入研究奠定了基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人尿源性干细胞来源外泌体的提取及鉴定

Isolation and identification of human urine-derived stem cell-derived exosomes

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