多芯片联合分析骨关节炎的分子机制

doi:10.12307/2021.125

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (26): 4223-4229.doi: 10.12307/2021.125

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多芯片联合分析骨关节炎的分子机制

容伟明1，袁长深2，段戡2，卢智贤1，梅其杰2，郭锦荣2

1广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530000；2广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023

收稿日期:2020-07-07 修回日期:2020-07-13 接受日期:2020-08-19 出版日期:2021-09-18 发布日期:2021-05-13
通讯作者: 袁长深，硕士，副主任医师，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:容伟明，男，1995年生，在读硕士，主要从事膝骨关节炎的基础与临床研究。
基金资助:
中医学广西一流学科(桂教科研[2018]12号) (2019XK030)，项目负责人：袁长深；广西中医药大学自然科学研究项目(2019QN022)，项目负责人：袁长深；国家自然科学基金(82060875)，项目负责人：袁长深

Molecular mechanism of osteoarthritis by multi-chip combination analysis

Rong Weiming1, Yuan Changshen2, Duan Kan2, Lu Zhixian1, Mei Qijie2, Guo Jinrong2

1Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2First Affiliated Hospital, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2020-07-07 Revised:2020-07-13 Accepted:2020-08-19 Online:2021-09-18 Published:2021-05-13
Contact: Yuan Changshen, Master, Associate chief physician, First Affiliated Hospital, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Rong Weiming, Master candidate, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the First-class Discipline of Traditional Chinese Medicine in Guangxi Zhuang Autonomous Region ([2018]12), No. 2019XK030 (to YCS); the Natural Science Research Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2019QN022 (to YCS); the National Natural Science Foundation of China, No. 82060875 (to YCS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨关节炎：是一种以关节软骨退行性变和继发骨质增生为主的慢性关节疾病。目前在60岁以上的人群中有9.6%男性和18%女性患有骨关节炎，且其发病率随着社会的老龄化将持续上升，导致关节疼痛和残疾问题较为突出，给社会带来极大的经济负担。由于骨关节炎的发病机制尚未明确，使得其治疗效果不佳，因此分析其分子机制而确定有效的治疗方案是一研究热点。
信号通路：是指细胞外的分子信号经过细胞膜传递到细胞内并引起一系列酶促反应的通路。通过对差异表达基因的信号通路富集分析，可明确这些基因的功能和途径，便于更好地了解基因传导信号在影响疾病发生、发展过程中的重要作用。

背景：骨关节炎是最常见的慢性关节疾病，其发病机制与复杂的基因调控网络密切相关，但其潜在网络尚未完全明确。
目的：利用生物信息学分析方法挖掘骨关节炎滑膜组织中的重要基因、通路、miRNA-mRNA调控网络和免疫浸润情况，以便更全面地阐明骨关节炎的发病机制。
方法：从GEO数据库获取GSE1919、GSE55235和GSE12021基因表达谱芯片，利用R软件筛选差异表达基因，并对其进行富集分析；接着建立蛋白质-蛋白质互作网络和预测差异表达基因上游的miRNA，构建miRNA-mRNA网络，筛选出重要基因和miRNA；最后利用CIBERSORT算法分析骨关节炎与正常对照组滑膜组织的免疫浸润情况。
结果与结论：获得64个上调和23个下调差异表达基因，GO分析主要富集在对类固醇激素的反应、对皮质类固醇的反应、对脂多糖的反应和白细胞迁移等；KEGG分析显示白细胞介素17、NF-κB、TNF和MAPK等通路与骨关节炎密切相关；miRNA-mRNA网络分析显示白细胞介素6、VEGFA、MYC等10个关键基因和miR-21-5p、miR-142-3p在骨关节炎中较为重要；免疫浸润结果表明，骨关节炎滑膜和正常滑膜中幼稚B细胞、浆细胞和调节性T细胞等6种免疫细胞存在着明显的差异。该研究构建了miRNA-mRNA调控网络和深究滑膜组织免疫浸润的差异，为从滑膜方向全面阐明骨关节炎的发病机制提供理论依据。
https://orcid.org/0000-0003-2094-6138 (容伟明)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 基因, 芯片, 数据库, 生物信息学, 分子机制, 免疫浸润, 滑膜组织

Abstract:

BACKGROUND: Osteoarthritis is the most common chronic joint disease. Its pathogenesis is closely related to the complex gene regulatory network, but its underlying network has not been fully clarified.

OBJECTIVE: To identify hub genes, important pathways, miRNA-mRNA regulatory network and immune infiltration in the synovial tissue of osteoarthritis by bioinformatics analysis, with fully clarifying the pathogenesis of osteoarthritis.
METHODS: The gene expression microarrays of GSE1919, GSE55235 and GSE12021 were obtained from GEO database, with differentially expressed genes screened out and enriched by R software. Then, protein-protein interaction network and miRNA-mRNA network were constructed based on upstream regulatory miRNAs of predicted differentially expressed genes to screen out hub genes and miRNAs. Finally, immune infiltration of synovial tissue in osteoarthritis and normal control groups was analyzed by CIBERSORT.
RESULTS AND CONCLUSION: In total 64 up-regulated genes and 23 down-regulated genes were obtained, which were mainly involved in response to steroid hormone, response to corticosteroid, response to lipopolysaccharide and leukocyte migration. The important pathways closely related to osteoarthritis mainly included interleukin-17 signaling pathway, nuclear factor-κB signaling pathway, tumor necrosis factor signaling pathway and mitogen-activated protein kinase signaling pathway. MiRNA-mRNA network analysis showed that 10 hub genes, such as interleukin-6, VEGFA, MYC and miR-21-5p and miR-142-3p, were identified in osteoarthritis. Results of immune infiltration showed that there were significant differences in six kinds of immune cells, such as naïve B cells, plasma cells and regulatory T cells, between osteoarthritic synovium and normal synovium. The study constructed miRNA-mRNA regulatory network and investigated the difference of immune infiltration in synovial tissues, providing a theoretical basis for understanding the pathogenesis of osteoarthritis from the perspective of synovial tissue.

Key words: osteoarthritis, gene, microarray, database, bioinformatics, molecular mechanism, immune infiltration, synovial tissue

中图分类号:

容伟明, 袁长深, 段戡, 卢智贤, 梅其杰, 郭锦荣. 多芯片联合分析骨关节炎的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(26): 4223-4229.

Rong Weiming, Yuan Changshen, Duan Kan, Lu Zhixian, Mei Qijie, Guo Jinrong. Molecular mechanism of osteoarthritis by multi-chip combination analysis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(26): 4223-4229.

图/表（结果） 7

2.1 差异表达基因的筛选下载原始数据后，对每个数据集进行数据标准化，见图1。对GSE1919、GSE55235和GSE12021数据集依次进行差异表达分析，得到的差异表达基因分别是177个(上调120个，下调57个)、574个(上调280个，下调294个)、256个(上调166个，下调90个)，见图2。将标准化的3个微阵列数据集合并予批次效应去除后，再进行差异表达分析，最终筛选出87个差异表达基因(64个上调和23个下调)，见图3。

2.2 差异表达基因GO和KEGG富集分析通过R软件对筛选出的87个差异表达基因进行GO批注和KEGG富集分析以了解其生物学功能，结果显示有450个GO项目和55个KEGG项目，其中与骨关节炎密切相关的GO分析主要富集在对类固醇激素的反应、对皮质类固醇的反应、对脂多糖的反应和白细胞迁移等，见图4A；与骨关节炎高度相关的KEGG通路有白细胞介素17、NF-κB、TNF和MAPK等通路，见图4B。

2.3 miRNA-mRNA调控网络采用STRING数据库构建差异表达基因蛋白质-蛋白质相互作用网络，包含84个节点和338个边，边线的粗细代表两种蛋白间关系的强弱，见图5A。通过miRDB数据库预测差异表达基因上游miRNA，同时满足靶标得分> 60和结合位点< 800的miRNA共265个；miRNet数据库预测到1 501个miRNA；将2个数据库的网络交集得到1个含有67个miRNA和30个差异表达基因的网络；再利用Cytoscape将合并后的网络构建成1个包括142个节点和415条边的miRNA-mRNA调控网络，见图5C；最后利用“CytoHubba”插件筛选出前10位关键基因(白细胞介素6、VEGFA、MYC、ATF3、CXCL8、白细胞介素1β、PTGS2、BTG2、FOSB和NFKBIA)及2个重要的miRNA(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-142-3p)，见图5B，表1。

2.4 芯片的免疫浸润分析使用CIBERSORT算法分析多芯片数据中25个骨关节炎滑膜样品与24个正常滑膜样品之间的22个免疫细胞的免疫浸润差异，同时筛选得到符合条件的有25个骨关节炎滑膜样品和8个正常组织样品，并计算出这33个样品中每种免疫细胞所占百分比，见图6A。通过与正常滑膜相比，骨关节炎滑膜中含量较高的有幼稚B细胞、浆细胞、调节性T细胞、M1巨噬细胞和静息肥大细胞等5种免疫细胞，而活化肥大细胞含量相对较低，见图6B。

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引言

材料方法

1.1 数据来源从GEO数据库下载GSE1919、GSE55235和GSE12021基因表达谱芯片。GSE1919数据集包含5例骨关节炎患者和5例正常关节患者的滑膜组织，骨关节炎组是由UNGETHUEM等[10]在进行开放性滑膜切除术或关节置换术时收集骨关节炎患者的滑膜组织样本，正常组是因发生致命事故而采集的正常关节滑膜组织样本；该数据集是由GPL91(Affymetrix Human Genome U95A Array)平台生成。GSE55235数据集包括10例骨关节炎患者和10例正常关节患者的滑膜组织，由WOETZEL等[11]在进行关节置换术或滑膜切除术时收集的骨关节炎患者的滑膜组织样本以及个体死后正常关节或创伤性关节损伤患者(均为白种人)的滑膜组织样本；该数据集是基于GPL96(Affymetrix Human Genome U133A Array)平台完成。GSE12021数据集包含10例骨关节炎患者和9例正常关节患者的滑膜组织，是HUBER等[12]在德国耶拿大学医院骨科对骨关节炎患者行关节置换术或滑膜切除术后10 min内获得的滑膜组织，对照组是关节创伤手术时的组织标本；该数据集是基于GPL96(Affymetrix Human Genome U133A Array)平台生成。
1.2 数据处理及差异基因的筛选通过R软件(版本3.6.1)的“limma”包分别对3组表达矩阵分别进行常规背景校正和分位数归一化，再通过t检验计算每个基因的表达水平，并利用FDR方式校正P值，观察每个矩阵是否都存在差异的表达基因以确保矩阵的可用性，再使用R软件中的“Gplot”软件包构建差异分析的火山图。由于3个基因数据表达集(GSE1919、GSE55235和GSE12021)来源于不同平台，其制造商和处理过程的温度也存在差异，对每个数据集单独分析得到的差异基因可能存在较大的偏差，因此通过整合3组数据集并利用R软件的“SVA”软件包对整合矩阵批次效应去除，使表达量基本处于同一水平线后再采用t检验分析两组间所有基因表达差异，并用“Benjamini-Hochberg”方法对得到的P值进行矫正；分析后选择同时符合adj.P < 0.05和|log2FC|>1条件的基因作为差异表达基因(DEGs)，即矫正后P < 0.05为差异有显著性意义，差异倍数(foldchange，FC) > 2；最后使用“pheatmap”软件包构建整合数据集中差异表达基因的分层聚类图。
1.3 差异表达基因的GO功能注释和KEGG通路富集分析为了探索差异表达基因的主要功能和途径，通过R软件中“Bioconductor”软件包对差异表达基因进行基因本论(gene ontology，GO)富集和KEGG(kyotoencyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，选出P < 0.05的结果(P < 0.05代表差异有显著性意义)；其中GO分析包括生物过程(biological process，BP)、细胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)；最后通过“ggplot2”包对富集结果分别进行可视化。
1.4 预测差异表达基因上游的miRNA miRNA是一种内源性具有调控功能的非编码RNA，转录后可调控基因的表达；由于miRNA是基因表达的关键调节剂，已成为目前生物标志物研究的热点[13]。miRDB数据库(http://mirdb.org)是一个在线资源数据库，可用于miRNA与靶标的相互预测和功能注释。miRNet(www.mirnet.ca)数据库可将用户数据与现有知识进行网络视觉分析，从而阐明microRNA(miRNA)功能及与靶标关系的在线平台。该研究通过miRDB和miRNet分别预测差异表达基因上游的miRNA并构建miRNA-mRNA网络，其中miRDB数据库筛选的条件是同时满足靶标得分> 60和结合位点< 800；再将两个数据库分别获得的关系网络交集得到一个更可靠的关系网络。
1.5 miRNA-mRNA网络分析 STRING数据库(https://string-db.org/)是一个在线资源搜索工具，用于检索直接和间接基因表达蛋白间的相互作用。通过STRING在线构建差异表达基因蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，并设定筛选阈值为0.4；将交互数据与上游miRNA调控数据合并后导入Cytoscape软件(版本：3.6.1)建立miRNA-mRNA调控网络模型，最后利用“cytoHubba”插件，根据度(degree)得分筛选出Hub基因以及重要的miRNA。Hub基因是在生物过程中起关键作用的基因，影响着相关途径中其他基因的表达；而miRNA同样影响着基因的表达，被认为是重要的靶标以及研究热点。
1.6 芯片的免疫浸润分析该研究使用R x64的3.6.3版本通过CIBERSORT算法对以上获得联合芯片的矫正基因表达矩阵进行分析，筛选出P < 0.05的样品(P < 0.05代表样品的细胞组成具有较高的准确性)，并计算每个样品中22种免疫细胞分别占的百分比。另外，利用“vioplot”软件包及“wilcoxon秩和检验”对筛选出的骨关节炎样品与正常样品的滑膜组织进行比较，分析每个免疫细胞在两组间的免疫浸润水平，P < 0.05代表两组间差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎是最常见的关节退行性疾病，被认为是导致中老年人关节功能障碍和残疾的主要原因之一，给社会带来极大的经济负担[14]。目前骨关节炎的发病机制尚未明确，但认为与复杂的生化因素网络密切相关[15]，因而给临床治疗造成极大的困难[16]，探究其潜在机制和确定有效的治疗指标是当务之急。
通过使用生物信息学方法分析滑膜基因表达芯片，总共筛选出87个差异表达基因(64个上调和23个下调)；通过对这些差异表达基因进行GO分析，结果显示其主要富含在对类固醇激素的反应、对皮质类固醇的反应、对脂多糖的反应和白细胞迁移等。类固醇激素、皮质类固醇均属于激素，在体内物质代谢、免疫调节、炎症反应等方面起重要作用，目前尚未见其与骨关节炎的相关机制研究。但有研究表明，向关节腔内注射皮质类固醇可在短期内减少软骨破坏，缓解骨关节炎的疼痛[17]。脂多糖是由O抗原、核心多糖和脂质A 组成的一种糖脂，它可激活多器官(包括关节)免疫细胞上的Toll样受体进一步合成白细胞介素1β、肿瘤坏死因子和基质金属蛋白酶等炎性递质，并募集更多的白细胞引发炎症反应，从而导致关节组织结构、功能的破坏[18-19]。KEGG富集分析显示差异表达基因主要富集在白细胞介素17、NF-κB、肿瘤坏死因子和MAPK等通路。白细胞介素17信号通路是由白细胞介素17家族引起的传导途径，可通过调节大多数非造血区室细胞中炎症基因的表达来控制炎症；同时可激活下游的MAPK、NF-κB等信号通路，引起炎症反应及软骨破坏[20-22]，而阻断白细胞介素17信号通路可有效控制骨关节炎的进展[22]。NF-κB信号通路可分为经典与非经典途径，分别由IκB和p100介导，该通路在炎症、免疫、细胞增殖分化和凋亡中均发挥重要作用[23]。在关节中，机械应力或细胞因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β)均可激活软骨细胞和滑膜细胞中NF-κB通路，介导凋亡分子、趋化因子和细胞因子等物质的产生，最终诱导软骨破坏和滑膜发炎[24]。肿瘤坏死因子信号通路是由肿瘤坏死因子与两种不同的跨膜受体结合引起的TNFR1和TNFR2途径。肿瘤坏死因子α是该细胞因子家族中主要的信号分子，其生物学活性影响着通路效应，其中TNFR1通路主要在炎症和凋亡中发挥作用，TNFR2通路则起到维持细胞存活、增殖和免疫防护功能的作用[25-26]；由于肿瘤坏死因子α是介导骨关节炎中软骨破坏和滑膜炎症的关键细胞因子[26-27]，因此抑制该因子可通过其信号通路有效控制骨关节炎的进展[28]。MAPK信号通路由细胞外信号相关激酶(ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(JNK1/2/3)、p38-MAPK和ERK5四个不同的级联共同组成，可将细胞外不同信号从细胞膜传递到细胞核，控制细胞增殖、分化、衰老、凋亡、炎症等[29-30]；在骨关节炎中，激活MAPK途径可增加软骨和滑液中白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、一氧化氮和基质金属蛋白酶13水平，因此利用MAPK抑制剂治疗骨关节炎可起到较好的效果[31]。
越来越多的研究表明，miRNA在骨关节炎的发病机制中起关键作用，影响软骨破坏、软骨细胞凋亡。因此该研究通过预测差异表达基因上游的miRNA，并构建完整的miRNA-mRNA调控网络，筛选出前10位关键基因(白细胞介素6、VEGFA、MYC、ATF3、CXCL8、白细胞介素1β、PTGS2、BTG2、FOSB、NFKBIA)和2个重要miRNA(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-142-3p)。白细胞介素6作为一种参与多种炎症性疾病的细胞因子，在骨关节炎发病中起到重要作用[32]，被认为是一种诊断骨关节炎的潜在生化指标[33]；白细胞介素6可通过NF-κB途径诱导自身和转录激活因子3的表达和分泌，继而增强骨关节炎滑膜和软骨的炎症反应[34-35]，加重骨关节炎进程[36]；有研究表明通过抑制白细胞介素6介导的各种信号通路[37-38]，可有效控制骨关节炎炎症反应，达到治疗骨关节炎的目的[39]。白细胞介素家族另一成员白细胞介素1β在骨关节炎进展中也扮演着重要角色，它可同时促进细胞因子(白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)和炎性因子(一氧化氮、前列腺素E2)的表达与分泌，有效抑制白细胞介素1β表达可防止软骨基质降解和软骨破坏[40]。VEGFA是VEGF家族中血管生成的主要调控因子，在炎症性疾病的发病机制中起到关键作用[41]；在骨关节炎中，其高表达可增加病灶组织区域的血流灌注水平，使炎症因子向外扩散[42]，进而引发滑膜增生和软骨破坏[43]，导致骨关节炎的发生发展；另外骨关节炎的疼痛不适与VEGF表达水平密切相关[44]。MYC基因家族成员包括c-myc、n-myc及l-myc；c-myc是一种涉及细胞分化、生长、增殖以及凋亡的转录因子，与肿瘤的形成、发展和转移密切相关[45]。虽然目前未见MYC与滑膜相关的研究报道，但研究显示c-myc在骨关节炎软骨中呈高表达，并参与骨关节炎软骨细胞凋亡过程[46]；有效抑制c-myc的表达，可延缓骨关节炎的发病进程[47]。CXCL8是一种趋化因子，可抑制中性粒细胞凋亡并使其募集至病变部位引起炎症反应，加速软骨细胞凋亡，影响着骨关节炎的进展[48]。PTGS2(即COX-2)是前列腺素合成的关键酶，与骨关节炎的炎症反应密切相关，其过表达可促进骨关节炎滑膜成纤维细胞增殖[49]，被认为是非类固醇类抗炎药作用于骨关节炎的关键靶点[50]。BTG2、FOSB分别是BTG(即B细胞易位基因)和FOS基因家族的一员，均参与细胞增殖、分化和凋亡等生物过程的调控[51-52]，但其在骨关节炎的作用尚无定论，有待进一步探讨。NFKBIA作为编码IκBa蛋白的基因，通过与转录因子NF-κB结合引发炎症反应、细胞凋亡和自噬，阻断该途径可有效控制骨关节炎的进展[53]。在骨关节炎中，这些基因受到miRNA的调控，但以hsa-miR-21-5p、hsa-miR-142-3p较为重要。miR-21-5p通过抑制成纤维细胞生长因子18的表达，使软骨降解并进一步加重软骨的破坏[54]，而miR-142-3p则可通过NF-κB信号通路来控制骨关节炎中的软骨细胞凋亡和炎症[55]，它们均可作为治疗骨关节炎的重要靶点。
由于这些关键基因与免疫细胞间有着密切联系[56-57]，且有研究表明调节免疫细胞浸润可有效控制骨关节炎的病程[58]，因此该研究通过CIBERSORT方法分析免疫细胞在骨关节炎滑膜中的表达情况，从细胞因子的免疫反应层面研究其机制，结果发现骨关节炎滑膜和正常滑膜中幼稚B细胞、浆细胞、调节性T细胞、M1巨噬细胞、静息肥大细胞和活化肥大细胞等6种免疫细胞存在着明显的差异。骨关节炎滑膜中最丰富的细胞巨噬细胞，可促进细胞因子(白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α)和软骨降解因子(基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶2)在滑膜中释放，导致关节软骨损害[59]；调节性T细胞在骨关节炎滑膜和滑液中均显著富集[60]，而B细胞、浆细胞以及肥大细胞同样可影响着骨关节炎的发生发展[61]，然而其在骨关节炎中的病理作用仍不确定，需进一步研究加以证实，且更多的基因与免疫细胞的作用关系也有待进一步探讨。
该文章通过联合分析多个基因表达谱芯片数据，挖掘出骨关节炎病变中的重要基因、通路，构建潜在的miRNA-mRNA调控网络和探讨滑膜免疫浸润情况，为阐明骨关节炎的发病原因提供详细的分子机制。然而，根据大数据预测出的分子机制，仍需进一步通过实验加以验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

多芯片联合分析骨关节炎的分子机制

Molecular mechanism of osteoarthritis by multi-chip combination analysis

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