脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.008

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (37): 5947-5954.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.008

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脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存

吴洁莹¹，陆琰¹，陈劲松¹，朱璐²，甘文婷²

广州市妇女儿童医疗中心，¹广州脐血库，²血液内科，广东省广州市 510623

修回日期:2014-08-12 出版日期:2014-09-03 发布日期:2014-09-03
作者简介:吴洁莹，女，1975年生，广东省梅州市人，汉族，2002年暨南大学毕业，硕士，主任技师，主要从事脐带血干细胞冷冻保存及临床应用相关研究。
基金资助:
广东省科技厅计划项目(2011B031800375)；广州市卫生局科研项目(201102A213061)；广州市妇女儿童医疗中心博士启动项目(201011)

Human umbilical cord blood plasma can replace fetal bovine serum for primary culture, proliferation and cryopreservation of umbilical cord mesenchymal stem cells

Wu Jie-ying¹, Lu Yan¹, Chen Jin-song¹, Zhu Lu², Gan Wen-ting²

¹Guangzhou Cord Blood Bank, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou 510623, Guangdong Province, China; ²Department of Hematology, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou 510623, Guangdong Province, China

Revised:2014-08-12 Online:2014-09-03 Published:2014-09-03
About author:Wu Jie-ying, Master, Senior technologist, Guangzhou Cord Blood Bank, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou 510623, Guangdong Province, China
Supported by:
the Project of Guangdong Science and Technology Bureau, No. 2011B031800375; the Scientific Research Project of Guangzhou Health Bureau, No. 201102A213061; the Initial Project for Ph.D. of Guangzhou Women and Children’s Medical Center, No. 201011

摘要/Abstract

摘要：

背景：采用胎牛血清扩增培养及冷冻保存的间充质干细胞，在临床应用中存在一定的风险。
目的：探讨以脐血血浆替代胎牛血清体外分离培养、扩增及冷冻保存脐带间充质干细胞的可行性。
方法：选择符合广州脐血库供者合格性筛选标准的脐血，收集脐血干细胞制备过程中去除的血浆，经病原学及微生物检测合格，多份混合用于细胞培养。采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得脐带间充质干细胞，分为两组，分别以DMEM/F12为基础培养基，添加胎牛血清或混合脐血血浆，经培养扩增后，采用流式细胞仪检测细胞免疫表型，并进行间充质干细胞成骨、成脂分化鉴定。在含有10%二甲基亚砜的DMEM/F12培养基中，分别添加体积分数为20%的胎牛血清或混合脐血血浆作为冷冻保存液，对扩增至第3代的细胞冷冻保存至6个月以上，观察复苏后细胞的活率、贴壁情况、增殖、免疫表型及向成骨细胞分化的能力。
结果与结论：两种培养体系下的脐带间充质干细胞均呈现典型的梭形漩涡状生长，间充质干细胞免疫表型的表达谱系基本无差异，均具有成骨、成脂分化的能力，但脐血血浆培养条件下细胞的增殖速度显著高于胎牛血清。冻存复苏后的细胞可正常贴壁，且具有向成骨细胞分化的能力，采用脐血血浆冻存的细胞具有更高的贴壁效率及扩增能力。上述结果表明，脐血血浆可以替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的扩增培养及冷冻保存，并维持了间充质干细胞的基本生物学特性，是大量扩增间充质干细胞用于临床治疗较为安全的选择。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐血, 脐带间充质干细胞, 体外扩增, 免疫表型, 成骨分化, 成脂分化, 冷冻保存, 复苏

Abstract:

BACKGROUND: Fetal bovine serum based media used for expanding and cryopreserving human mesenchymal stem cells raise safety concerns in the clinical setting.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of human umbilical cord blood plasma as a replacement for fetal bovine serum in culture and cryopreservation of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord.
METHODS: Umbilical cord blood units were suitable for this research if they fulfilled the donor selection criteria of the Guangzhou Cord Blood Bank strictly. Cord blood plasma was ready to use after collected from the plasma reduction during the suitable cord blood units processing and pooling. Umbilical cord mesenchymal stem cells were harvested from the umbilical cord tissue of health full-term newborns after delivery by enzyme digestion and were cultured in the presence of Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12 containing either fetal bovine serum or pooled cord blood plasma. Morphology, proliferation, immunophenotype detected by flow cytometry and differentiation toward adipogenic and osteogenic lineages were utilized for investigating the effect of media on umbilical cord mesenchymal stem cells after 3-5 passages. Then cells were cryopreserved in media containing 10% dimethyl sulfoxide, 20% fetal bovine serum or 20% pooled cord blood plasma for at least 6 months. Viability, adhesion, proliferation, immunophenotype and osteogenic differentiation of the cells were assessed after thawing.
RESULTS AND CONCLUSION: The morphology (spindle-shaped and plastic-adherent), phenotype and differentiation potential (osteogenic and adipogenic) were almost indistinguishable between cells cultured in fetal bovine serum or cord blood plasma medium, while cells grown in cord blood plasma medium demonstrated significantly higher proliferation rates than those in medium containing fetal bovine serum. After thawing, the cells maintained their adherence to the culture surface and differentiation potential to osteoblasts, but cells from cord blood plasma cryopreservation medium showed significantly better plastic attachment and produced greater cell numbers than fetal bovine serum for the first three post-thaw passages. The results demonstrate that cord blood plasma can sever as an effective substitute to fetal bovine serum for growth, maintenance and differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells, and thus it will be a safe choice for clinical-scale production of human mesenchymal stem cells.

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Key words: fetal blood, plasma, umbilical cord, mesenchymal stem cells, freezing

中图分类号:

R394.2

吴洁莹，陆琰，陈劲松，朱璐，甘文婷. 脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 5947-5954.

Wu Jie-ying, Lu Yan, Chen Jin-song, Zhu Lu, Gan Wen-ting. Human umbilical cord blood plasma can replace fetal bovine serum for primary culture, proliferation and cryopreservation of umbilical cord mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 5947-5954.

图/表（结果） 7

2.1 两种培养体系下的脐带来源间充质干细胞的形态及增殖 原代培养第5天大部分细胞贴壁，细胞呈梭形或角形，可见数个细胞集落形成。第2-3代的两组脐带来源间充质干细胞均呈现典型的梭形漩涡状生长，形态、大小没有明显差别；但第1组细胞(胎牛血清培养)传至第8代出现体积增大、分泌颗粒增多等衰老现象，而第2组细胞(脐血血浆培养)传至第15代，细胞形态没有明显改变，见图1。

两组细胞的累积群体倍增数(CPD)均呈上升趋势，第2组细胞(脐血血浆培养)第3-5代的累积群体倍增数均高于第1组细胞(胎牛血清培养)，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2；细胞传代时间反映细胞增殖能力，细胞所需要的传代时间(GT)越长，提示细胞活力下降，增殖能力降低，第2组细胞第1-5代的传代时间均低于第1组细胞，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.2 脐带来源间充质干细胞冻存复苏后观察 分别取两组第3代脐带间充质干细胞，置于含胎牛血清或脐血血浆的冻存液冷冻保存至少6个月后复苏。7-AAD标记检测的复苏后细胞活率分别为93.7%(胎牛血清冻存)及95.2%(脐血血浆冻存)，24 h细胞贴壁率分别为78%(胎牛血清冻存)及89%(脐血血浆冻存)；复苏后两组细胞的生长状态良好，见图4。体外继续培养至第3代，两组细胞的增殖情况与各自冻存前的实验结果没有明显差异，但在两组细胞之间进行比较，第2组细胞(脐血血浆培养)第3代累积群体倍增数高于第1组细胞(胎牛血清培养)，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5；第2组细胞第1-3代的传代时间均低于第1组细胞，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

2.3 脐带间充质干细胞免疫表型特征 采用流式细胞术检测两组细胞免疫表型的表达，两组细胞均高表达CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90、CD105、CD166及HLA-ABC，其中 CD73、CD90、CD105、CD166阳性率均高于90%；而造血系细胞表面抗原CD34、CD45及免疫排斥反应等重要抗原CD80、CD86、HLA-DR未见表达，两组细胞之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，复苏后细胞的免疫表型表达情况没有明显改变，见表1。

2.4 脐带间充质干细胞成骨、成脂分化鉴定 经成骨诱导体系诱导2周后，细胞基质可见粗糙的颗粒样沉积，诱导4周后进行茜素红染色，可见大量桔红色的矿化结节沉积；经成脂诱导体系诱导7-10 d后，在光镜下可看见微小明亮的脂肪滴，诱导至第2，3周，融合的脂肪滴充满整个细胞，油红染色呈明亮的橙红色。两组细胞均具备成骨和成脂分化能力，见图7。取脐血血浆冻存液冻存复苏后并继续传至第3代的细胞，再次进行成骨诱导分化，茜素红染色结果阳性，对照组未加诱导剂而呈阴性，见图8(胎牛血清组的结果未显示)。

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引言

人间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能，能够向特定的细胞表型分化，被用于某些损伤性疾病的替代性治疗；具有向病灶归巢的能力，并能合成和分泌大量生物活性因子，促进组织修复或再生；具有免疫调节特性，体外研究表现出一定的免疫抑制能力，能减少各种免疫细胞群炎性因子的产生；具有低免疫原性特征，可安全地开展异体移植等等，被认为是细胞治疗和组织工程的理想来源^[1]。临床已应用不同来源的人间充质干细胞治疗某些疾病和损伤^[2-4]。尽管人间充质干细胞治疗应用的理想剂量仍不清楚，对于一个成年患者而言，通常建议至少为(1.0-2.0)×10⁶/kg^[5]。除了骨髓，间充质干细胞样细胞还存在于多种组织，包括脂肪组织、关节滑膜、骨、皮肤、胰腺、血液、胎肝、肺脏和脐血中^[5-6]，但是不管何种来源的原代人间充质干细胞的数量，对于研究还是临床使用都是不够的。因此，必须分离人间充质干细胞，体外培养多次传代扩增产生临床所需数量的细胞。

目前广泛应用的人间充质干细胞培养体系多含有胎牛血清，胎牛血清可能被有害病原体污染，并将这些污染源传播给细胞，如：病毒、支原体、朊病毒或其他未确定的动物源性成分；在体外培养过程中，细胞的吞噬作用使牛血清中的蛋白分子细胞内化，即使通过洗涤也不能清除，而临床治疗通常需要小剂量多次输注，残存的异种蛋白直接进入人体，存在发生免疫排斥反应的风险，必然干扰治疗效果；以动物血清为主体的干细胞培养体系已经成为目前限制干细胞技术向临床转化的一大障碍，建立一种无异种血清的人间充质干细胞培养体系是开展相关细胞治疗的基础^[7-9]。

已证实自体或异基因供者的血液成分，包括：人血清、血浆、血小板裂解液及脐血血清可作为替代性培养基补充物供临床使用^[10]，其中脐血血清因富含生长因子被建议作为胎牛血清的替代物^[11]。在本研究中，利用脐血干细胞库的技术平台，收集脐血干细胞制备过程中多余的血浆，探讨其用于分离培养脐带来源间充质干细胞的可行性，并观察其冷冻保存脐带来源间充质干细胞的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外对比观察实验。

时间及地点：实验于2013年9月至2014年5月在广州市妇女儿童医疗中心广州脐血库完成。

材料：

脐血和脐带：脐血和脐带标本的采集经广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准，并经产妇(或家属)书面同意用于科学研究。

人脐带间充质干细胞分离培养及冷冻保存实验所需主要试剂及设备：DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、间充质干细胞专用成骨、成脂诱导试剂盒(Gibco, USA)；FITC标记鼠抗人CD45，PE标记鼠抗人CD29，CD34，CD44，CD49e， CD80，C86，CD73，CD90，CD105，CD166，HLA-ABC，HLA-DR，小鼠同型阴性对照IgG-FITC、IgG-PE，流式细胞仪(FACSCanto II)(BD Biosciences，USA)；茜素红染色试剂盒(南京杰美基因公司)；油红O染色试剂盒(北京鼎国生物技术公司)；冷冻保护剂二甲基亚砜(WAK，Germany)；DNA 酶Ⅰ (Promega，USA)；恒温摇床(QYC-200型)(上海福玛公司)；超净工作台(BDW-1600A)(苏净集团)；离心机(Centra^®GP8R)(IEC，USA)；二氧化碳培养箱(Labotect，Germany)；倒置显微镜(NIKON，Japan)；程序降温仪(Planner Kryo 550-16) (Planner，England)。

实验方法：

脐血血浆(umbilical cord blood plasma，CBP)的制备：脐血供者的筛选、脐血采集、处理及检测依照脐血库标准操作规程完成^[12]。在去除血浆的步骤中，无菌操作下留取 5 mL上层血浆，置于4 ℃保存，经细菌、真菌、HBsAg、HBeAg、HCV、HIV、CMV及梅毒等病原微生物检测为阴性后，方可用于实验。将至少30份检测合格的脐血血浆等体积混合，1 200×g 4 ℃离心10 min，用注射器小心抽取上清，以0.22 μm滤膜过滤，分装，-20 ℃保存待用。

脐带来源间充质干细胞的分离和培养：用含100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DPBS漂洗脐带2次，去除残留血液。置于含DMEM/F12的培养液中保存运输，12 h内处理。将脐带剪成碎块，加预热至37 ℃的0.25%胰酶-EDTA液消化10 min，去消化液。再加入0.25%胰酶-EDTA液，37 ℃恒温摇床振荡消化40 min，终止消化后去上清。然后加入0.1%胶原酶Ⅳ和10 U/mL的DNA酶Ⅰ，37 ℃恒温摇床振荡消化60 min，收集细胞悬液，300目孔径钢网过滤后，400×g室温离心10 min。去上清，用DPBS离心漂洗2次，重悬细胞沉淀。锥虫蓝计数细胞活率，以5×10⁵/cm²接种于10 cm²培养皿，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂的饱和湿度培养箱培养。5 d后首次全量换液，弃去未贴壁细胞，每三四天换液1次。细胞达70%-80%融合后，按照 1∶3-1∶4的比例传代培养。

根据培养体系的不同将细胞分为2组：第1组为添加体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基；第2组为添加10%脐血血浆的DMEM/F12培养基，同时按1.5 U/mL的浓度加入肝素钠注射液(因脐血血浆含有一定量的抗凝剂成分而被稀释，经推算，培养体系中血浆的实际浓度约为6.5%)。在第2组实验中细胞传代使用了无动物源成分的酶TrypLE^TM Express进行消化，并事先以脐血血浆预包被，以提高细胞贴壁率。具体方法是：将脐血血浆覆盖培养器材表面，置于37 ℃ 1 h，室温平衡1 h，使用前吸走多余液体。

细胞增殖测定：群体倍增数(population doubling，PD)及累积群体倍增数 (cumulative population doublings，CPD)计算：第1代以5 000/cm²密度接种细胞，当细胞融合至70%-80%时传代，每代均以相同密度接种，观察至第5代。参照文献[10，13]方法，以公式X=[log(10)N_H- log(10)N₁]/log(10)²计算细胞群体倍增数，N_H为每代最终收集的细胞数，N₁每代初始接种的细胞数。每代群体倍增数加上上一代群体倍增数，即为累积群体倍增数；细胞传代时间(generation time，GT)即细胞倍增的平均时间，公式为X= [log(10)²]×?t/[log(10)N_H-log(10)N₁]。

细胞免疫表型的流式分析：取第3-5代细胞，胰酶消化后，PBS洗涤2次，调整细胞浓度至2.0×10⁹ L^-¹，分为每管0.1 mL。阴性对照管加入鼠抗人IgG-FITC或IgG-PE；其他管分别加入CD29-PE、CD44-PE、CD49e-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-ABC-PE、CD34-PE、CD45-FITC、HLA-DR-PE、CD80-PE、CD86-PE各10 μL，室温避光孵育30 min，用PBS反复洗两三次，减少非特异性结合；加入200 μL PBS混匀细胞，并以10 g/L多聚甲醛固定，4 ℃保存，24 h内上流式细胞仪检测，每管至少获取1.0×10⁴个细胞。

细胞成骨、成脂诱导分化及染色：

成骨诱导及茜素红染色：取第3代细胞，以(1.0-2.0)× 10⁷ L^-¹接种于24孔板内。待细胞融合达60%时，去掉原培养基，PBS洗涤1次，换用成骨诱导培养基向成骨细胞诱导分化，每三四天换液1次。诱导4周后按试剂盒操作说明进行茜素红染色。

成脂诱导及油红O染色：取第3代细胞，以(1.0-2.0)× 10⁷ L^-¹接种于24孔板内。待细胞融合达60%时，去掉原培养基，PBS洗涤1次，换用成脂诱导培养基向脂肪细胞诱导分化，每三四天换液1次，观察到胞质中有较大脂滴形成时，吸去培养液，PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，油红O染色。

细胞的冻存复苏及复苏后培养：取经形态学观察、免疫表型及诱导分化能力等指标鉴定的第3代细胞，常规消化离心，PBS洗涤后，去除上清，缓慢加入预冷的含有体积分数为10%二甲基亚砜+体积分数为20%胎牛血清+ 70%DMEM/F12或10%二甲基亚砜+20%脐血血浆+ 70%DMEM/F12的冷冻保存液，置于Planer kryo series Ⅲ程序降温仪，先以5 ℃/min速率降至4 ℃，再以1 ℃/min速率降至-45 ℃，然后以5 ℃/min速率降至-100 ℃，置于液氮保存。至少冻存6个月后取出冻存管，于37 ℃水浴箱快速解冻，并立即加入2 mL预冷复苏液(含体积分数为10%胎牛血清或10%脐血血浆+90%DMEM/F12的完全培养基1 mL、5%白蛋白1 mL及1.0×10⁶ U/L DNA酶10 μL)，小心混匀，离心去除二甲基亚砜，取1.0×10⁵个细胞进行核酸染料7-AAD标记，流式细胞仪检测细胞复苏率，剩余细胞接种于培养皿进行培养，24 h后计算细胞贴壁率。待细胞融合达80%左右，常规消化传代。将复苏后的细胞继续传至第3代，并进行细胞增殖、免疫表型及成骨诱导分化的测定(方法同前)。

复苏细胞活率=(7-AAD阴性细胞数/获取的总细胞数)×100%。

24 h细胞贴壁率=(1-悬浮细胞数/接种的总细胞数) ×100%。

主要观察指标：比较原代及冻存复苏后的脐带来源间充质干细胞在含胎牛血清和脐血血浆的两种培养体系下的生长形态、扩增倍数、免疫表型及分化能力的差异。

统计学分析：使用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，结果用x(_)±s表示，组间均数间比较采用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

血清是血浆去除纤维蛋白的产物，含有细胞存活及生长所必须的多种复杂成分。血清富含生长因子能够促进细胞增殖或抑制细胞生长而诱导其分化；血清中的基膜成分和黏附分子可以支持细胞贴壁及伸展；微量元素和激素等可以刺激细胞生长，并参与多种生化过程；血清含有的蛋白酶抑制剂还可以保护细胞免受蛋白酶(如传代操作中使用的胰酶)的损伤^[14]。

胎牛血清一直是细胞培养中最为经典的营养补充物，其来源较为丰富，制备过程简单，可作为试剂商品购买。但是，在临床应用中，如使用含有胎牛血清的培养基存在的安全问题不容忽视^[14]：首先，胎牛血清可能被有害病原体或其他动物源性成分污染并传播给细胞；其次，胎牛血清含有较高浓度的异种蛋白，可能引起受者的免疫反应；另外，不同批次的胎牛血清产品存在批间差异，可能影响细胞扩增效率，应在使用前进行测试。胎牛血清是从胎牛心脏直接穿刺采血分离获得，活体采集对动物造成伤害而引发一定的伦理道德问题^[9]。为减少使用胎牛血清培养人间充质干细胞的安全隐患，人们已开始研究自体或异基因供者血液成分，包括：人血清、血浆、血小板衍生物(如：血小板裂解液)及脐血血清作为替代性培养基补充物供临床使用。自体血清被证实能够维持人间充质干细胞的免疫表型及分化能力^[15-16]，但采集总量有限且受供者年龄限制，而异体血清的培养效果存在争议^[10,17-21]；血小板裂解液可通过机械破坏(如反复冻融并离心)或化学溶解血小板膜制备获得，多数研究报道富含生长因子的异基因血小板裂解液具有强大的促进人间充质干细胞生长，维持其分化潜能及免疫调节特性的能力^[22-26]，但是也有研究发现，即使细胞的增殖能力显著提高，使用血小板裂解液(添加在RMPI1640培养基中)改变了某些人间充质干细胞表面分子的表达，导致其体外免疫抑制能力的下降^[27]。

脐血是胎儿娩出后残留在胎盘和脐带中的血液，在胎儿出生后，这部分血液与胎盘、脐带及其他胎儿附属结构即完成使命，成为医疗“废弃”物，对其研究、应用不会涉及伦理道德问题；与采集其他来源的供者细胞或组织(如骨髓、自体血浆、血小板等)相比，更方便、安全、无害，不受供者身体状况及年龄因素等的影响。国内外均有报道，脐血血清或血浆富含细胞生长和存活必需的细胞因子，可以促进骨髓或其他来源的人间充质干细胞体外生长、增殖和多向分化^{[11, 28-31]}，但这些研究通常是采集非抗凝状态的脐血，在获取脐血血清后，无法从血凝块中分离出其他细胞成分；或将脐血反复离心、沉淀而获得富血小板血浆^[32]；或将脐血血浆经过冻融、盐析、透析的方法去除纤维蛋白^[33]，但操作过程较为繁琐。由于血清是血浆去除纤维蛋白的产物，而在本实验室制备脐血干细胞的常规操作中，大部分血浆和红细胞是被去除的，以减少冻存体积和冷冻保护剂的添加量，节约存储空间，并显著降低临床输注时的液体负荷。因此，作者设想利用脐血库的技术平台，在GMP操作间内收集供体脐血血浆，经过简单的处理，用于分离培养脐带间充质干细胞，体现了在实验对象选材方面的创新性。

经体外实验发现，脐带间充质干细胞在含脐血血浆的培养液中可稳定贴壁生长，显微镜下细胞为典型的梭形漩涡状，传代及冻存复苏后可正常贴壁，增殖速度和传代能力均高于含胎牛血清培养条件下生长的细胞，体外扩增至15代，细胞形态不发生明显改变；流式细胞仪检测其高表达CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-ABC，低表达CD34、CD45及CD80、CD86、HLA-DR；在适宜的诱导条件下，能够分化为成骨细胞及脂肪细胞，具有多向分化能，符合间充质干细胞的最低标准^[34-35]。在证实脐血血浆可以替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的分离、纯化及扩增培养后，实验继续观察了脐血血浆是否可以取代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的冷冻保存。在含脐血血浆冻存液中冻存6个月以上的脐带间充质干细胞复苏后生长状态良好，间充质干细胞表面抗原表达无改变，并维持了分化为成骨细胞的特性；与同等条件下采用经典的胎牛血清冻存液冻存的细胞相比，其在复苏后的后续培养中具有更好的贴壁效率及增殖能力。上述结果表明，脐血血浆不仅可用于脐带间充质干细胞的分离纯化、扩增培养，还可以替代胎牛血清用于细胞的长期冷冻保存，减少了细胞复苏后使用前的反复洗涤、稀释或换用其他体系的步骤，降低了残留动物血清的风险，对临床细胞治疗具有特殊意义，也反映出本研究结果对临床应用具有一定的创新价值。

本研究中采用的脐血血浆均来自广州脐带血库的合格脐血产品，供者经多项筛选及检测(包括病原学及细菌培养)合格，符合临床应用标准^[12]。由于脐血血浆是分离自含有枸橼酸盐-磷酸盐-葡萄糖-腺嘌呤(CPD-A)抗凝剂及按比例添加了羟乙基淀粉的抗凝全血，为平衡上述成分在每份全血中含量不同而造成血浆稀释程度的差异，并减少脐血供体的个体差异可能造成的血浆中因子含量的差异，本研究采用了多份脐血血浆(至少30份)等体积混合的方法，并进行不同批次的试验，保证了结果的稳定性。

有学者发现因血小板裂解液含有血浆中的纤维蛋白原和其他凝血因子，将其作为胎牛血清的替代物加入含钙培养基后，血浆中原有的抗凝剂(如：枸橼酸盐)不足以拮抗多余的钙而形成胶冻状，应加入肝素阻止凝胶形成。肝素是一种含有硫酸基团的黏多糖，能活化抗凝血酶-Ⅲ，抑制凝血过程中的多种凝血酶活性，具有显著的抗凝效应；但由于其多糖成分能够与多种生长因子(如：血小板生长因子)发生作用，也会显著影响细胞的增殖和分化。为防止培养基凝固，添加的低分子量肝素的浓度至少应为0.024 g/L(相当于2.4 U/mL)。随着肝素浓度的升高，人间充质干细胞的增殖及分化均会受到抑制，集落形成单位的数量也会减少^[36]。本实验中的脐血血浆培养体系也曾出现凝胶现象，经过多次实验，确定在培养体系中添加商品化的低分子肝素钠注射液，浓度为1.5 U/mL，在换液、传代、冻存复苏后均无凝胶生成，同时细胞可以正常生长。

脐血血浆含有丰富的促细胞生长的蛋白(如：白蛋白、转铁蛋白、纤维连接蛋白等)及生长因子(如：表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子等)，被认为是其促进细胞生长和增殖的主要原因^[9]，将在后续实验中观察上述不同培养体系下的这些成分存在及变化的情况，进一步探讨脐带间充质干细胞在不同培养条件下出现差异的可能机制。

综上所述，与目前已检索到的相关文献比较，本研究具有以下特点：首先，选用合格的供体脐血，将其中富含造血干细胞的成分冷冻保存用于移植，同时收集处理过程中去除的血浆用于细胞培养，充分利用了脐血资源；其次，通过多人份血浆混合的方式平衡每份血浆稀释程度不同可能给实验造成的影响，并减少了脐血供体的个体差异；第三，添加较低浓度的肝素防止凝胶形成，保证了细胞在生长、传代、冻存、复苏等各种条件下培养体系的稳定性。尽管实验中的脐血血浆均来自广州脐带血库的合格脐血产品，供者经多项筛选及检测合格，由于血浆成分的复杂性，某些隐匿的致病因素仍存在被漏检的可能。相比之下，化学成分明确的商品化无血清或无异种蛋白培养基可以避免血清中潜在有害物质的污染，但在使用无血清培养体系时，需要相应的贴壁基质成分、作用温和的蛋白酶等配套试剂^[37-40]，同时应确保在体系中使用过的任何成分都是无动物源性的，这会导致细胞培养的总体费用昂贵。由于脐血供体血浆来源丰富，操作简便，不涉及伦理问题，可以替代动物血清用于人间充质干细胞的分离培养及冷冻保存并维持其生物学特性，符合建立临床级人间充质干细胞大量扩增体系的需求，因此，在目前阶段仍然是一种较为理想的无动物源性的血清补充物。

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延伸阅读

人间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能，被认为是细胞治疗和组织工程的理想来源。目前临床已开展了应用不同来源的人间充质干细胞治疗某些疾病和损伤的前期研究，常规技术路线是从选定的供体组织中分离出少量原代人间充质干细胞，经体外多次扩增传代以获得纯化的且满足临床治疗剂量的细胞。为确保临床治疗的安全性及有效性，首先应考虑供体细胞的可获得性及扩增效率，其次要建立稳定安全的培养体系，能够维持人间充质干细胞的再生和分化特性，减少培养过程中动物源成分，如：胎牛血清的残留，降低输注风险。

人间充质干细胞通常来源于骨髓，但已证实其他组织(脂肪、脐血、脐带组织、胎盘、羊水、肝脏、肺脏、胰腺和肌肉等)来源的细胞也表现出与人骨髓间充质干细胞类似的特征。治疗用人间充质干细胞的理想来源应是现成的，经培养能够迅速扩增，因此，来自于容易获得、原本会丢弃的组织，如脐带血、脐带组织和胎盘，可能是比骨髓更好的选择，毕竟采集骨髓是一项侵入性操作，而且与成体来源人间充质干细胞相比，其遗传变异更少，增殖能力更强。人间充质干细胞分离和扩增的最佳条件需要添加体积分数为10%-20%胎牛血清的培养基，每毫升培养基含5-10mg胎牛血清蛋白。培养基含有胎牛血清而导致的安全问题，应通过寻找不含胎牛血清的替代方案加以避免。

本实验选择足月分娩后新生儿的脐带组织和脐血为研究对象，结果表明脐血血浆可以替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的分离、纯化、扩增培养及冷冻保存，较为理想地解决了上述供体细胞来源及培养体系安全性两方面的问题。

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脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存

Human umbilical cord blood plasma can replace fetal bovine serum for primary culture, proliferation and cryopreservation of umbilical cord mesenchymal stem cells

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