脐带采集液中添加美罗培南对脐带间充质干细胞生物学特性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：为避免脐带采集过程中发生细菌污染，常在脐带采集液中加入抗生素，实验旨在探索可以抑制污染同时又不会对细胞生长增殖造成影响的新型抗生素。
目的：观察美罗培南抗生素对脐带间充质干细胞增殖和分化潜能的影响。
方法：实验分2组，使用传统添加青霉素链霉素(终浓度均为100 U/mL)的脐带采集液采集的标本为对照组，使用添加美罗培南(终质量浓度为1.0 mg/L)的脐带采集液采集的标本为实验组，分别采集脐带标本100份，统计两组标本采集液的阳性率。两组脐带分离培养后取第3代细胞绘制生长曲线，流式细胞术分析其表型以及检测成骨、成脂分化能力。
结果与结论：经统计，实验组的采集液污染率为3%(3/100)，对照组的采集液污染率为20%(20/100)，可见含有美罗培南的采集液标本污染率明显降低。使用含有美罗培南的采集液采集脐带，经培养后获得的第3代脐带间充质干细胞形态、分化能力以及细胞表型均正常，且细胞增殖能力与对照组相比无差异，因此该抗生素可用于脐带采集液。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 美罗培南, 脐带间充质干细胞, 大肠埃希菌, 脐带采集液

Abstract:

BACKGROUND: Due to the difficulty in the control of delivery and collection process, antibiotics are often added into the preservation fluid in order to avoid bacterial contamination but not affect cell growth and proliferation.
OBJECTIVE: To observe the effects of meropenem on the proliferation and differentiation potential of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: There were two groups in this experiment: control group, preservation fluid with penicillin- streptomycin (final concentration of 100 U/mL); experimental group, preservation fluid with meropenem (final mass concentration of 1.0 mg/L). 100 umbilical cord samples were collected in each group, and the positive rate was calculated. After isolation and culture, the passage 3 cells were used to draw a growth curve, flow cytometry analysis was used for phenotype determination, and osteogenic and adipogenic differentiation of cells were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The contamination rates were 3% (3/100) in the experimental group and 20% (20/100) in the control group, indicating that meropenem can obviously reduce the contamination rate. In the experimental group, the morphology, differentiation potential and cell phenotype of the passage 3 cells were all normal. The proliferation ability of cells showed no difference between the two groups. Therefore, meropenem can be added to the preservation fluid.

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Key words: umbilical cord, mesenchymal stem cells, beta-lactams, anti-bacterial agents

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

间充质干细胞属于多能干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。在相应诱导条件下能分化为骨、软骨、肌肉、脂肪、肝细胞等不同类型的细胞^[1-9]，具有取材方便、易获取、易扩增、免疫原性低等优点，在发育生物学研究和临床治疗如组织和器官修复等方面具有广阔的应用前景^[10-11]。但是骨髓间充质干细胞存在一些缺陷，例如成人骨髓含有间充质干细胞的数量非常少，在衰老和疾病等因素的影响下，存在于骨髓内的间充质干细胞的数量和分化能力均有所下降，并且由于创伤性的采集过程，限制了其成为组织工程种子细胞的临床应用^[12-17]。脐带为分娩废弃组织，其间充质干细胞含量丰富^[18-30]，无需创伤性穿刺，较骨髓来源间充质干细胞扩增能力更强，成为近来间充质干细胞研究的重要来源之一^[31]。迄今的研究表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。脐带间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，并且具有无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。

在日常脐带干细胞库的工作中，由于分娩方式、医护人员采集方法不当容易导致脐带标本细菌污染，造成珍贵资源浪费。为了避免细菌污染，常规在采集液中加入青霉素和链霉素，但是细菌抗药性强，抑菌效果并不明显。美罗培南是一种β内酰胺类抗生素，具有非常广泛抗菌性及可供注射性，对大肠埃希菌株均表现高度的抗菌活性，用于治疗多种不同的感染，包括脑膜炎及肺炎。因此本研究拟在采集液中加入美罗培南以降低细菌污染，避免珍贵细胞资源浪费，并观察美罗培南抗生素对脐带间充质干细胞形态、增殖和分化潜能的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2011年5至12月在天津市脐带血造血干细胞库完成。

材料：

脐带标本：脐带采自天津多家三甲医院，经产妇授权同意，胎儿均足月生产且产妇无传染性疾病。

实验方法：

实验分组：实验分2组，使用传统添加青霉素、链霉素(终浓度均为100 U/mL)的脐带采集液采集的标本为对照组，使用添加美罗培南(终质量浓度为1.0 mg/L)的脐带采集液采集的标本为实验组，分别采集脐带标本100份。统计两组标本采集液的阳性率。

标本的分离和培养：将两组标本取出，常规使用胶原酶Ⅱ消化、接种加入含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，置于37 ℃，体积分数为5%的CO₂培养箱中培养，待细胞融合度达80%以上进行传代。

细胞生长曲线的测定：分别取两组对数生长期的第3代细胞，用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA进行消化，接种于24孔板中，使用MTT法每天检测活细胞数，连续8 d。以活细胞数量为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线。

细胞免疫表型的分析：分别取两组第3代细胞同样方法消化后，PBS清洗3次，制成细胞悬液，加入抗体，流式细胞仪检测分析CD31、CD29、HLA-DR、CD34、CD105、CD44、CD73、CD90的表达情况。

体外向脂肪细胞诱导分化及检测：分别取两组第3代细胞，按2×10⁴细胞浓度接种于含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基的24孔板中，至细胞70%融合时，分别更换为含有1 nmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100 μmol/L吲哚美辛的培养液，每周换液2次，3周后用多聚甲醛固定，油红O染色。

体外向骨细胞诱导分化及检测：分别取两组第3代细胞，按每孔2×10⁴细胞浓度分别接种于24孔板中，待融合度达70%更换为含有0.1 μmol/L地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油、0.2 mmol/L 2-磷酸-L-抗坏血酸的培养液中，每周换液2次，4周后用多聚甲醛固定，茜素红染色。

主要观察指标：①细胞形态。②细胞生长进入对数期和平台期的时间以及相应的细胞数。③流式细胞仪检测相应抗体的结果。④成脂分化油红O染色后是否形成亮橙红色脂滴。⑤成骨分化茜素红染色后是否出现红色结节。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，用DPS软件进行统计学分析，采用One-way ANOVA方差分析。

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讨论

随机抽取100份脐带间充质干细胞公共库中污染标本，经检测主要为大肠埃希菌污染，约占全部阳性标本的40.77%。根据文献报道美罗培南对大肠埃希菌株均表现高度的抗菌活性，MIC50(50%抑菌范围)均≤ 0.25 mg/L，MIC90(90%抑菌范围)均≤1.0 mg/L^[32]。因此在脐带采集过程中使用添加美罗培南的采集液，使其终质量浓度为 1.0 mg/L以降低大肠埃希菌的污染。

人脐带间充质干细胞是一种从脐带Wharton’s jelly中分离出的新型干细胞^[33-35]。脐带间充质干细胞可能是未来各系统疾病细胞治疗和基因治疗的最具潜力的种子细胞^[36-37]。2005年“国际细胞治疗协会”ISCT正式命名间充质干细胞，并提出不是所有基质细胞均是干细胞^[38]。在体外培养环境中，最佳的活性期出现在第3-18代之间。经过培养后，细胞呈梭形和旋涡状排列，CD31、CD29、CD34、HLA-DR阴性表达以及CD73、CD44、CD105、CD90阳性表达，成脂分化油红O染色阳性可见产生脂滴，成骨分化茜素红染色阳性，因此本研究的结果符合ISCT规定的3个鉴定标准^[39]。实验组和对照组细胞生长曲线也说明了用含有美罗培南采集液处理后，细胞增殖活力未受影响，并且污染率明显下降。

实验中发现，虽然美罗培南可以用于脐带采集，但是经过分离后的细胞中吸收残留抗生素的量还有待进一步研究。目前临床上常用的抗生素有很多种，具体种类的细胞毒性尚不清楚，抑菌效果相同或更好的抗生素，其对细胞培养的影响需要进一步比较。本研究中得到的结果可以看出，采集过程中加入美罗培南，并不影响后续脐带间充质干细胞的细胞活力和增殖分化能力，为挽救公共库中的珍贵细胞资源起了重要作用。

综上所述，实验采用美罗培南添加到采集液中的方法，使采集液细菌污染率明显下降，并且对细胞形态和增殖能力及细胞表型无影响，成脂和成骨分化能力正常，表明美罗培南可以用于脐带采集。该方法减少了珍贵细胞资源的损失，降低了由于污染造成的生产成本，为大规模脐带采集创造了条件。