干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变：细胞因子与血管新生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.024

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞在一定诱导条件下可分化成为血管性内皮细胞，可促进局部血管再生，生成新的毛细血管网，建立丰富的侧支循环，以达到改善和治疗下肢缺血的目的。
目的：概述糖尿病下肢血管病变的发病机制，以及自体外周血干细胞移植、脐血干细胞移植、干细胞联合细胞因子移植治疗糖尿病下肢血管病变的基础研究和临床研究现状。
方法：检索1983至2014年PubMed 数据库、维普中文科技数据库及万方数据相关文献。英文检索词为“stem cells；stem cell transplantation；cord blood stem cell transplantation；diabetic angiopathies”；中文检索词为“干细胞；干细胞移植；脐血干细胞移植；糖尿病血管病变”。
结果与结论：糖尿病下肢血管病变的发病机制可能与免疫异常诱发炎症反应有关，目前还缺乏有效的治疗方法。干细胞移植治疗糖尿病并发症在动物模型及临床上均取得了一定的成果，其中应用较多的有胚胎干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞，其治疗糖尿病下肢血管病变的机制主要与其参与新生血管形成、启动和分泌相关因子、免疫调节以及干细胞的增殖和分化能力等有关。目前的基础研究主要限于单纯的干细胞移植和联合基因治疗的干细胞移植。与外周血干细胞移植相比，自体骨髓干细胞移植所采细胞更原始，操作更简单，费用更低。证实干细胞分泌的细胞因子不足以促进血管新生，而是刺激骨骼肌细胞分泌足够的细胞因子促进血管新生。目前干细胞的临床应用有很多的问题有待解决。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 移植, 糖尿病血管病变, 外周血干细胞, 脐血干细胞, 糖尿病

Abstract:

BACKGROUND: Stem cells under the certain condition can be induced to differentiate into vascular endothelial cells, to promote local angiogenesis and generate new capillary network and establish abundant collateral circulation, in order to achieve the purpose of improvement and treatment of lower limb ischemia.
OBJECTIVE: To review the pathogenesis of diabetic lower extremity vascular lesions, and the basic and clinical development of autologous peripheral blood stem cell transplantation, umbilical cord blood stem cell transplantation, and stem cell transplantation combined with cytokines for the treatment of diabetic lower extremity vascular lesions.
METHODS: A computer-based online search was performed in the PubMed database for relevant literatures published from 1983 to 2014. The keywords were “stem cells; stem cell transplantation; cord blood stem cell transplantation; diabetic angiopathies”.
RESULTS AND CONCLUSION: The pathogenesis of diabetic lower extremity vascular lesions may be associated with dysimmunity-induced inflammation. It is lack of effective treatment methods. Stem cell transplantation in animal models and clinical treatment of diabetes complications has obtained certain achievements. Embryonic stem cells, mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells are widely used, and the their mechanism underlying treatment of diabetic lower extremity vascular lesions is mainly related to their participation in new vessel formation, starting and secreting factors, immune regulation, and stem cell proliferation and differentiation ability. Currently, the basic research is mainly limited to simple stem cell transplantation and stem cell transplantation combined with gene therapy. Compared with peripheral blood stem cell transplantation, autologous bone marrow stem cell transplantation is preferred because of more primitive cells, simpler operation, and lower cost. Studies have confirmed that cytokines secreted from stem cells are not enough to promote angiogenesis, but stimulate the skeletal muscle cells to secrete enough factors for promoting angiogenesis. The current clinical application of stem cells has a lot of problems to be solved.

全文链接：

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, stem cell transplantation, cord blood stem cell transplantation, diabetic angiopathiese

中图分类号:

R318

钟咏红. 干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变：细胞因子与血管新生[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5225-5229.

Zhong Yong-hong. Stem cell transplantation in the treatment of diabetic lower extremity vascular disease: cytokines and angiogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5225-5229.

图/表（结果） 1

2.1 糖尿病下肢血管病变的发病机制目前2型糖尿病的病因与发病机制尚未完全阐明，多数研究支持2型糖尿病是一种慢性低度炎症状态的假说。大量的临床研究也进一步证实，多种影响因子如白细胞介素、肿瘤坏死因子α、C-反应蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂1、内皮黏附分子等参与了糖尿病及其血管并发症的形成，与糖尿病的发展、转归及预后明显相关^[4-5]。

研究认为糖尿病下肢血管病变的发病机制可能与免疫异常有关，免疫紊乱诱发炎症反应^[6]，白细胞介素6的升高可加重炎性反应，使血管斑块不稳定，导致血栓形成、与2型糖尿病外周动脉疾病密切相关^[7]。糖尿病下肢血管病变的患者炎症因子C-反应蛋白，肿瘤坏死因子α，白细胞介素6明显高于未合并下肢血管病变者^[8]；糖尿病下肢血管病变患者的C-反应蛋白水平明显高于糖尿病患者及健康人，说明炎症在下肢血管病变过程中起着至关重要作用^[9]。

胰岛素样生长因子1是细胞增殖的刺激剂，对血管内皮细胞有很强的刺激作用，能刺激大血管平滑肌细胞的分裂和弹力纤维的增生^[10]，提示高胰岛素样生长因子1水平是2型糖尿病大血管并发症的危险因素，胰岛素样生长因子1的变化对糖尿病患者下肢血管病变有较好的预测价值。瘦素是由脂肪细胞合成并分泌入血，与瘦素受体结合后发挥作用，研究表明瘦素与糖脂代谢异常、胰岛素抵抗密切相关。瘦素水平与2型糖尿病下肢血管病变有无相关性还存在争议^[11-12]。研究显示，脂肪因子与糖尿病血管并发症的发生发展有关^[13]。实验证实，长期高血糖状态可激活晚期糖基化终产物及其受体，启动糖基化终产物及其受体信号传导通路，最终导致全身微血管不可逆损害及相关脏器功能的丧失^[14]。已初步证实糖基化终产物受体基因序列的变异可改变糖基化终产物及其受体的相互作用而影响2型糖尿病微血管并发症的发生^[15]。

2.2 干细胞治疗的基础研究血管新生有血管生成和血管形成2种方式：血管生成是指通过血管内皮细胞迁移、增殖，在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管；血管形成是指在原来没有血管系统的情况下，通过内皮祖细胞和造血干细胞的分化和相互作用产生新的血管^[16]。干细胞移植后一方面整合于受损的血管丛，进而直接分化、成熟为新血管；另一方面以直接分泌和旁分泌细胞因子方式促进局部缺血组织的血管新生。目前的基础研究主要限于单纯的干细胞移植和联合基因治疗的干细胞移植。单纯的干细胞移植主要分为单个核细胞移植、骨髓间充质干细胞移植、内皮祖细胞移植三大类^[17]。

周晨光等^[18]体外培养糖尿病大鼠和正常大鼠骨髓单个核细胞，定向培养为内皮祖细胞，并局部移植至糖尿病大鼠及正常大鼠下肢缺血模型病变部位，分别采用受体相同、移植物不同；移植物相同，受体不同的方法移植，结果说明在该实验条件下，糖尿病对骨髓来源内皮祖细胞移植促血管新生作用无明显影响，而对血管新生所处的病变部位微环境有明显影响。高登鹏^[19]研究不同糖环境对人纤维蛋白原样蛋白2基因沉默后的大鼠心肌微血管内皮细胞全基因表达谱的影响，证明Fgl2基因通过RNA干扰对大鼠心肌微血管内皮细胞的基因有显著的影响。樊明世等^[20]做了人脐带间充质干细胞移植改善糖尿病模型兔下肢缺血的实验研究，建立糖尿病兔动物模型，结扎双后肢股动脉及分支建立糖尿病兔下肢缺血模型，人脐带间充质干细胞经氯甲基苯甲酰氨染料标记注射于兔肢缺血部位，并以注射生理盐水的肢缺血部位做对照，2周和4周后取双侧后肢内收肌和腓肠肌标本做病理观察，病理切片显示移植组较对照组侧支血管明显增多，采用CD31免疫组织化学标记人脐带间充质干细胞移植组较对照组毛细血管密度增加，人脐带间充质干细胞移植组皮温比对照组明显增高。刘艳枚^[21]进行的人血管内皮生长因子基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病后肢缺血研究，利用含人血管内皮生长因子基因的腺病毒表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞，并以BrdU标记细胞，局部肌肉注射到糖尿病大鼠的后肢缺血部位，结果表明成功实现血管内皮生长因子基因的腺病毒表达载体修饰大鼠骨髓间充质干细胞，经局部注射移植BrdU标记的、修饰的骨髓间充质干细胞可以定植在病损组织中，并可改善糖尿病后肢缺血大鼠后肢血供，证实了血管内皮生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病后肢缺血的可行性。

2.3 自体外周血干细胞移植治疗的临床应用外周血干细胞移植是通过化学驱动因子增加外周造血干细胞和祖细胞数量，使骨髓干细胞充分动员到外周血循环中。外周血干细胞移植的缺点在于很难像血管搭桥一样立即见效^[14]。毛红等^[22]观察89例2型糖尿病下肢血管病变患者自体外周血干细胞移植治疗临床效果，所用患者均皮下注射重组人粒细胞集落因子500-600 μg/d，注射5 d后采集外周血干细胞，将采集的外周血干细胞悬液进行缺血肢体肌间分层注射，移植后1，3和6个月患肢疼痛、冷感、间歇性跛行情况较移植前均有改善，且随着时间延长改善程度逐渐增加，踝肱指数均有不同程度增高；移植后患者肢体皮温较移植前有所升高，深部感觉检测肢体感觉功能有所改善；移植后患者下肢血管彩色多普勒与移植前比较未见明显变化，CT及血管造影显示23例患者有不同程度新生侧支血管形成，说明自体外周血干细胞移植可增加糖尿病下肢血管病变与糖尿病足患者的下肢血流，促进部分患者下肢血管新生。

2.4 自体骨髓干细胞移植治疗的临床应用与外周血干细胞移植相比，自体骨髓干细胞移植所采细胞更原始，操作更简单，费用更低。但骨髓采集创伤较大，对患者要求高，有些患者因痛苦和恐惧而难以接受。

陈明卫等^[23]对不同来源和移植途径的自体干细胞治疗糖尿病缺血性下肢血管病变进行了随机对照观察，选择糖尿病缺血性下肢血管疾病患者76例，分为4组，分别为自体外周血干细胞局部肌肉注射移植和动脉腔内注射移植；自体骨髓干细胞局部肌肉注射移植和动脉腔内注射移植，移植后第2，4，12，24，48周4组患者疼痛评分、冷感评分、麻木评分、皮肤温度、踝肱指数、持续经皮氧分压、间歇性跛行距离、下肢动脉的CT血管成像评分的差异无显著性意义，表明采用不同来源和移植途径的自体干细胞治疗糖尿病缺血性下肢血管病变疗效相当。高雪等^[24]观察了干细胞重建糖尿病足缺血态组织血流，对糖尿病下肢动脉缺血性疾病患者42例均接受自体外周血干细胞移植，随访1年，自体干细胞移植后患者肢体局部血流量变效应指标皮温指数、经皮氧分压、踝肱指数、光电容积微血流态指数、血氧饱和度、数字减影血管造影评分及间歇性跛行距离均得到改善。李华等^[25]应用自体自体外周血干细胞移植治疗18例糖尿病性下肢缺血，移植后1个月患者疼痛、冷感、麻木症状明显改善，间歇性跛行明显缓解，总有效率为77%，3个月后踝肱指数升高，患者皮氧分压不同程度地升高，足部感染得到控制，溃疡或足趾坏疽好转或愈合，提示自体自体外周血干细胞移植治疗糖尿病性下肢缺血是一种相对简单、安全、有效的方法。

2.5 脐血干细胞移植治疗的基础研究与临床应用脐血作为干细胞的主要来源，近年来国内外对其进行了大量的基础性研究和临床探索。已经证实脐血中含有大量造血干细胞、丰富的间充质干细胞^[26]。临床干细胞移植治疗采用脐血具有诸多优势，如来源丰富，组织配型时间短，抗原表达弱，加之间充质干细胞的免疫调节及加速造血恢复等影响，脐血的移植成功率高，移植反应弱、移植物抗宿主病少见。目前脐血移植治疗的疾病已经达到80余种，治疗的患者全世界已经超过了6 000例。脐血移植已经在恶性肿瘤、免疫缺陷、心脏病、神经系统损伤、组织器官修复、糖尿病、血管疾病等的治疗上显示巨大的潜力^[27]。

目前临床使用的脐血干细胞基本都是异体的，移植到那些有正常骨髓功能的患者会导致免疫性移植物抗宿主反应，这样就极大限制了其广泛临床应用。于凤泉等^[28]分别采用脐血干细胞移植、微球囊扩张、微球囊扩张加脐血干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变，结果显示微球囊扩张加脐血干细胞移植治疗后各项检测指标的改善明显优于其他两种方法。杨耀国^[29]发现移植培养扩增的脐血干细胞可以改善糖尿病裸鼠缺血局部的皮温、增加缺血局部的血管密度、促进缺血恢复；缺血组织中转化生长因子β1和CD105的表达增高可能对缺血恢复有重要作用。

2.6 干细胞结合细胞因子移植治疗的基础研究与临床应用 Tateno等^[30]已经证实，干细胞分泌的细胞因子不足以促进血管新生，而是刺激骨骼肌细胞分泌足够的细胞因子促进血管新生。目前临床常用的细胞因子包括血管内皮生长因子、成纤维生长因子血小板衍生生长因子转化生长因子β等和其他促进血管形成的细胞因子。

章涛等^[31]制备大鼠2型糖尿病后肢缺血模型，分别将不同的骨髓间充质干细胞分点注射入模型大鼠左后肢的股直肌和腓肠肌中，右后肢相同部位注射等量生理盐水作为对照，发现移植后2，6，10周血管内皮细胞生长因子基因腺病毒表达载体转染骨髓间充质干细胞大鼠双侧后肢血管显影及毛细血管密度均较单纯骨髓间充质干细胞移植、Ad-GFP转染骨髓间充质干细胞移植明显丰富(图1)。移植后2周，各组大鼠左后肢均见BrdU标记阳性移植细胞，表明大鼠后肢肌肉注射移植血管内皮生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞可定植在病损组织中，并可改善大鼠糖尿病后肢缺血。王伏生等^[32]将新西兰大白兔下肢缺血模型分别于股内肌注射血管内皮生长因子基因裸质粒DNA转染自体外周血干细胞悬液、自体外周血干细胞悬液和血管内皮生长因子基因裸质粒，证实血管内皮生长因子基因裸质粒DNA转染白体外周血干细胞移植后兔肢体无坏死，血管再生指标明显好于其他2组。

参考文献

[1] 焦雪琴,申雅君,姚建宇,等.2型糖尿病下肢血管病变的危险因素分析[J].现代生物医学进展,2013,13(19):3714-3717.
[2] Williams LH, Miller DR, Fincke G, et al. Depression and incident lower limb amputations in veterans with diabetes. J Diabetes Complications. 2011;25(3):175-182.
[3] 许金秀,耿风芹,王光亚,等.抑郁症与2型糖尿病患者下肢血管病变关系的探讨[J].中国医药导刊,2014,15(3):387-388.
[4] Makine C, Kar?ida? C, Kadio?lu P, et al. Symptoms of depression and diabetes-specific emotional distress are associated with a negative appraisal of insulin therapy in insulin-naïve patients with Type 2 diabetes mellitus. A study from the European Depression in Diabetes [EDID] Research Consortium. Diabet Med. 2009;26(1):28-33.
[5] Zebrack JS, Anderson JL. Role of inflammation in cardiovascular disease: how to use C-reactive protein in clinical practice. Prog Cardiovasc Nurs. 2002;17(4):174-185.
[6] 邱明才,春梅.糖尿病并发症发病过程中的补体活化作用[J].中华内分泌代谢杂志,2006,22(3):303-305.
[7] 李芳平,宁艳辉.2型糖尿病下肢血管病变炎症因子及丹参的干预作用[J].中西医结合心脑血管病杂志,2007,5(12):1177-1178．
[8] 南登崐.康复医学[M].北京:人民卫生出版社,1994.
[9] Sosnowski C, Pasierski T, Janeczko-Sosnowska E, et al. Femoral rather than carotid artery ultrasound imaging predicts extent and severity of coronary artery disease. Kardiol Pol. 2007;65(7):760-768.
[10] 贾安奎,刘彦轩,仲华,等. 2型糖尿病患者血小板-白细胞聚集体与微血管病变部位及区域数量的关系[J].中国糖尿病杂志,2014, 22(4):347-349.
[11] 胡春秀,李力.基因印迹与胚胎生长发育[J].第三军医大学学报, 2000,22(8):810-812.
[12] 马绍杰,王颖,金秀平,等.血清瘦素与2型糖尿病下肢大血管病变的关系探讨[J].中国心血管研究杂志,2004,2(8):613-614.
[13] 谢晓敏,刘惠莉,于丽萍,等.2型糖尿病下肢血管病变患者中瘦素、白介素-6，C反应蛋白的改变[J].第四军医大学学报,2007, 28(4): 338-341.
[14] Bordier L, Le Berre JP, Garcia C, et al. Influence of blood pressure level on urinary albumin excretion rate and erythropoietin production in diabetic patients. Arch Mal Coeur Vaiss. 2006;99(7-8):701-704.
[15] 侯莉.2型糖尿病患者血清PECAM-1和MIF水平变化相关机制及作用[J].镇江:江苏大学,2013.
[16] Tepper OM, Galiano RD, Kalka C, et al. Endothelial progenitor cells: the promise of vascular stem cells for plastic surgery. Plast Reconstr Surg. 2003;111(2):846-854.
[17] 邢帅,陈剑秋.干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血性疾病的研究进展[J].国际检验医学杂志,2012,33(1):56-58.
[18] 周晨光,宫经新,马跃,等.糖尿病对内皮祖细胞移植促血管新生作用的影响[J].中国组织工程研究,2013,17(6):1044-1048.
[19] 高登鹏.不同糖环境对FGL2基因沉默后的大鼠心肌微血管内皮细胞全基因表达谱的影响[D].南昌:南昌大学,2013.
[20] 樊明世,杨晓凤,吴雁翔,等.人脐带间充质干细胞移植改善糖尿病兔下肢缺血[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(1): 33-36.
[21] 刘艳枚.人VEGF基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病后肢缺血研究[D].遵义:遵义医学院,2012.
[22] 毛红,赵湜,王红祥,等.自体外周血干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变与糖尿病足效果:89例自身对照观察[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(21):4197-4200.
[23] 陈明卫,李燕萍,唐益忠,等.不同来源和移植途径的自体干细胞治疗糖尿病缺血性下肢血管病变的随机对照研究[J].中华临床医师杂志:电子版,2013(14):6418-6423.
[24] 高雪,叶吉云,曾希云,等.干细胞重建糖尿病足缺血态组织血流[J].昆明医科大学学报,2012,33(10):57-60.
[25] 李华,陈旭艳,冯亮华,等.自体外周血干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血效果观察[J].中国综合临床,2011,27(9):958-961.
[26] 阚艳敏,马琳,李静,等.糖尿病肾病患者外周大动脉的弹性变化[J].浙江临床医学,2014,16(4):638-639.
[27] 周飞,张小芬.脐血干细胞移植的研究及临床应用[J].医学综述, 2006,12(19):1183-1185.
[28] 于凤泉,李群,李富元,等.血管重建治疗糖尿病缺血性血管病变对血管内皮生长因子及内皮素的影响[J].中国现代医药杂志,2014, 16(1):48-50.
[29] 杨耀国.人脐带血干细胞移植治疗糖尿病鼠下肢缺血的研究[D].北京:北京协和医学院,中国医学科学院,2009.
[30] Tateno K, Minamino T, Toko H, et al. Critical roles of muscle-secreted angiogenic factors in therapeutic neovascularization. Circ Res. 2006;98(9):1194-1202.
[31] 章涛,刘艳枚,张潜,等.血管内皮生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病后肢缺血[J].解剖学杂志,2013,36(5): 901-905.
[32] 王伏生,梁宏莉,姜鸿南,等.血管生长因子基因裸质粒DNA转染自体外周血干细胞联合移植治疗下肢缺血性疾病[J].临床医药实践, 2011,20(1):8-11.

引言

近年来随着人口老龄化的进程及人们饮食结构的变化，尤其是糖尿病发病率的快速增长，以糖尿病足和血栓闭塞性脉管炎为主的下肢缺血性疾病的发病率逐渐上升，下肢血管病变也越来越引起人们的重视。糖尿病下肢血管病变是个复杂的病理生理过程，与多种因素相关，单因素分析显示年龄、收缩压、餐后2 h血糖、低密度脂蛋白胆固醇、三酰甘油、胰岛素抵抗指数及糖化血红蛋白与2型糖尿病合并下肢血管病变有关；多因素分析显示年龄、总胆固醇及合并神经病变是引起2型糖尿病下肢血管病变的独立危险因素^[1]。大多数患者发病时无症状或无典型症状，下肢病变多累及小腿动脉，经常有部分患者缺乏远段动脉流出道，解决远端流出道不理想的问题为血管外科基本课题之一。

目前对糖尿病下肢血管病变还缺乏有效的治疗方法，超声多普勒检查能较早地发现病变，而踝臂指数也是下肢血管病变的一种方便可行和可靠的检测指标^[2-3]。近年来干细胞移植治疗糖尿病并发症在动物模型及临床上均取得了一定的成果，其中应用较多的有胚胎干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞，其治疗糖尿病下肢血管病变的机制主要与其参与新生血管形成、启动和分泌相关因子、免疫调节以及干细胞的增殖和分化能力等有关。自体干细胞在一定诱导条件下可分化成为血管性内皮细胞，可促进局部血管组织再生，生成新的毛细血管网，建立丰富的侧支循环，形成远端肢体的流出道，改善糖尿病下肢血管病变。文章通过总结干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变的相关文献，寻找糖尿病下肢血管病变的机制及治疗方案。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：