豚鼠脂肪间充质干细胞植入耳聋模型修复听力的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.015

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (32): 5173-5177.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.015

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豚鼠脂肪间充质干细胞植入耳聋模型修复听力的作用

王晓燕¹，吉彬¹，李兵兵²，毕晓娟³，刘立中⁴

新疆医科大学第一附属医院，1耳鼻咽喉科，3医学研究中心，4干部保健特诊科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2莆田市第一医院骨科，福建省莆田市 351100

收稿日期:2014-07-05 出版日期:2014-08-06 发布日期:2014-09-18
通讯作者: 刘立中，博士，主任医师，新疆医科大学第一附属医院干部保健特诊科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:王晓燕，女，1985年生，甘肃省张掖市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事耳科组织工程与干细胞治疗方面的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2011211A060)

Hearing restoration in a deaf animal model with transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cells from guinea pigs

Wang Xiao-yan¹, Ji Bin¹, Li Bing-bing², Bi Xiao-juan³, Liu Li-zhong⁴

1Department of Otorhinolaryngology, 3Medical Research Center, 4Department of Cadres, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Orthopedics, the First Hospital of Putian City, Putian 351100, Fujian Province, China

Received:2014-07-05 Online:2014-08-06 Published:2014-09-18
Contact: Liu Li-zhong, M.D., Chief physician, Department of Cadres, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wang Xiao-yan, Studying for master’s degree, Department of Otorhinolaryngology, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211A060

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪间充质干细胞是否是治疗因毛细胞退化、缺失所造成的感音神经性聋的福音呢？
目的：探讨豚鼠脂肪间充质干细胞经耳蜗鼓阶途径植入感音神经性耳聋动物模型后对听力的修复作用。
方法：庆大霉素腹腔注射建立豚鼠感音神经性耳聋动物模型，耳蜗鼓阶途径植入豚鼠脂肪间充质干细胞，分别于植入后1，3周检测听性脑干反应，观察植入脂肪间充质干细胞后耳聋动物听力的变化；并追踪EDU标记的豚鼠脂肪间充质干细胞在耳蜗内的迁移及分布情况。
结果与结论：在植入后1周及3周进行听性脑干反应检测，听力较移植前逐渐好转。植入细胞后1周，细胞大多分布在外淋巴液中，部分迁移至耳蜗柯蒂器贴附于基底膜上，植入细胞后3周，细胞不仅迁移并贴附在Corti器基底膜发挥作用，而且部分迁移到蜗神经，植入时间越长，存活细胞越少。结果表明豚鼠脂肪间充质干细胞通过耳蜗鼓阶途径微孔植入，可以定向迁移并存活最终达到提高听力的目的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 感音神经性耳聋, 脂肪间充质干细胞, 移植, 耳蜗, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Can adipose-derived mesenchymal stem cells be used to treat sensorineural deafness caused by hair cell degeneration and loss?
OBJECTIVE: To investigate the effect of adipose-derived mesenchymal stem cells from guinea pigs transplanted via the scala tympani on the recovery from sensorineural hearing in an animal model.
METHODS: Intraperitoneal injection of gentamicin was performed to prepare sensorineural deafness models in guinea pigs. Then, adipose-derived mesenchymal stem cells from guinea pig were transplanted via the scala tympani. After 1 and 3 weeks, auditory brainstem responses were detected to observe the hearing variation after adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation. Meanwhile, the migration and distribution of EDU-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells in the cochlea were traced.
RESULTS AND CONCLUSION: After 1 and 3 weeks of implantation, the results from auditory brainstem response showed that the hearing was gradually improved. At 1 week of implantation, most of the cells were distributed in the perilymph and some cells migrated to the Corti organ and attached to the basement membrane. At 3 weeks of implantation, cells migrated and attached to the basement membrane of Corti organ, furthermore, some cells migrated to the cochlear nerve. The longer the time of implantation, the less cell survived. The results indicate that adipose-derived mesenchymal stem cells from guinea pig that are transplanted via the scala tympani can directly migrate and survive ultimately to improve the hearing.

全文链接：

Key words: adipose tissue, mesenchymal stem cells, hearing loss, sensorineural, cochlea

中图分类号:

R394.2

王晓燕，吉彬，李兵兵，毕晓娟，刘立中. 豚鼠脂肪间充质干细胞植入耳聋模型修复听力的作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5173-5177.

Wang Xiao-yan, Ji Bin, Li Bing-bing, Bi Xiao-juan, Liu Li-zhong. Hearing restoration in a deaf animal model with transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cells from guinea pigs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5173-5177.

图/表（结果） 2

2.1 豚鼠感音神经性耳聋模型建立情况豚鼠通过腹腔连续注射庆大霉素进行造模，造模过程豚鼠体质量都有不同程度减轻，近1/5豚鼠出现恶心，食欲减退，毛发脱落，耳郭反射消失等症状。其中感音神经性耳聋组死亡2只，因肠胀气和腹泻死亡。感音神经性耳聋植入脂肪间充质干细胞组无死亡。感音神经性耳聋植入生理盐水组死亡2只，1只因前庭功能障碍反应拒食死亡，另1只因右眼感染引起颅内感染，抗生素治疗无效死亡。

2.2 豚鼠脂肪间充质干细胞的形态原代培养一两天时开始贴壁生长，呈梭形、三角形等，四五天为对数生长期，细胞生长迅速，7-9 d细胞汇合达80%-90%，呈旋涡状生长，传至第3代脂肪间充质干细胞较纯，形态及活力良好，可用于细胞植入，见图1。

2.3 EDU标记的脂肪间充质干细胞第3代脂肪间充质干细胞培养至第4天时加EDU标记细胞，48 h后荧光显色，倒置荧光显微镜下观察EDU标记细胞为红色，核染标记为蓝色，细胞标记率> 95%，可用于标记后细胞植入，见图1。

2.4 脂肪间充质干细胞移植前后听力检测结果为了评估豚鼠脂肪间充质干细胞耳蜗植入后对耳聋动物听力的影响，于细胞植入后1周和3周进行听性脑干诱发反应检测。刺激强度从100 dB到10 dB，记录最大、最稳和最后消失的主波Ⅲ波波形及阈值。听力正常的豚鼠可测到稳定的Ⅰ波至Ⅳ波，重复后波形吻合，不是因干扰所造成，听力在30 dB左右，见图2A。感应神经性耳聋动物听性脑干诱发反应检测时90 dB仍未引出说明耳聋模型造模成功，见图2B。耳聋动物植入豚鼠脂肪间充质干细胞术后1周听性脑干诱发反应检测结果显示听力提高约20 dB，Ⅲ波波形稳定，见图2C。3周再次对植入后的动物进行检测，听性脑干诱发反应阈值显示听力较前明显提高，较治疗前听力提高约40 dB，见图2D。

2.5 EDU追踪移植细胞在耳蜗内的分布对耳聋动物植入生理盐水及植入豚鼠脂肪间充质干细胞1，3周进行耳蜗组织冰冻切片EDU荧光追踪，生理盐水组可见细胞核染蓝色，鼓阶及前庭阶结构完整，从底回到顶回，柯蒂器结构完整，未见细胞及组织破坏现象，说明通过鼓阶微孔技术植入对耳蜗的结构无明显影响，见图3A。植入后1周结果显示EDU标记细胞大部分在外淋巴液中，已有一部分迁移至耳蜗柯蒂器贴附于基底膜上，说明移植的细胞能够迁移到受损毛细胞所在位置，而且能够存活替代受损毛细胞发挥作用，见图3B。植入后3周结果显示，大部分位于外淋巴中未贴附的细胞已死亡，贴服存活的细胞能够定向归巢，且部分细胞出现向蜗神经迁移的趋向，说明植入的细胞不仅对受损毛细胞有一定的替代作用，而且有可能对神经修复也具有一定的作用，见图3C。

参考文献

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年3至10月在新疆医科大学第一附属医院动物实验中心完成。

材料：

豚鼠脂肪间充质干细胞植入耳聋模型修复听力实验主要试剂和仪器：
试剂、仪器	来源
L-DMEM、胎牛血清	美国Gibco公司
Ⅰ型胶原酶	Worthington
5-乙羟基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)	Invitrogen
RapidCal.Immuno脱钙液	美国Iymed公司
耳声发射分析仪	丹麦CATELLA公司
听性脑干反应测试仪	美国SYSTEMS公司
倒置显微镜、激光共聚焦显微镜	德国Leica公司
CO₂培养箱	美国Healfore公司

实验动物：由新疆医科大学第一附属医院动物中心提供健康豚鼠50只，体质量200-300 g，雌雄不限，电耳镜检查外耳道通畅，鼓膜完整，对声反射灵敏。

实验方法：

实验分组：对实验动物编号后应用随机数字法随机分为4组：①正常听力组10只，未给于任何干预措施。②感音神经性耳聋组12只，庆大霉素药物致耳聋。③感音神经性耳聋植入生理盐水组14只，耳蜗鼓阶途径植入生理盐水。④感音神经性耳聋植入脂肪间充质干细胞组14只，耳蜗鼓阶微孔植入脂肪间充质干细胞。

豚鼠感音神经性耳聋模型：测量体质量，腹腔注射庆大霉素100 mg/(kg•d)，1次/d，连续15 d，每日测体质量，调整药量，观察豚鼠的生理状况。1周后行听性脑干反应及耳声发射检测，若耳声发射未引出，听性脑干反应检测阈值超过90 dB则造模成功，可用于后期实验。

豚鼠脂肪间充质干细胞的分离及培养：取健康豚鼠腹股沟及双侧附睾处脂肪组织，PBS彻底冲洗，剔除血管和筋膜后剪碎至糊状，用2倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶溶液消化，37 ℃水浴中振荡消化30 min后终止消化，100目筛网过滤，1 500 r/min离心10 min，弃上清及油脂，重悬细胞，按1×10⁹ L^-¹浓度接种细胞，48 h首次换液，每3 d换液1次。细胞培养传至3-5代用于耳蜗植入。

EDU标记脂肪间充质干细胞后耳蜗鼓阶微孔植入：第3代脂肪间充质干细胞培养至第4天处于对数生长期时，配制浓度为20 μmol/L的EDU溶液半量换液，放入37 ℃，体积分数为5%的CO₂培养箱中孵育48 h，收获EDU标记细胞放置冰盒待用，30 min内将收获细胞植入造模成功的动物模型。将豚鼠头部及颈部剃毛，用氯胺酮40 g/kg+地西泮 5 g/kg+阿托品0.05 g/kg腹腔注射麻醉，放置于37 ℃保温毯上以维持体温，碘伏消毒后铺无菌洞巾，耳郭后沟切开皮肤，分离皮下组织及肌肉，直至充分暴露听泡，在显微镜下用耳科磨钻打开听泡，扩大骨孔为3 mm×3 mm，用电钻在耳蜗底转处磨一直径为0.2 mm的小孔，用10 μL的微量注射器取10 μL的细胞悬液包含1×10⁵个脂肪间充质干细胞，在5 min内缓慢注入鼓阶，注射完毕后保留微量注射器在原位2 min，骨蜡封闭骨孔，逐层缝合切口，放入保温箱内待麻醉清醒。为防止内耳感染，肌肉注射头孢唑啉 500 mg/(kg•d)，连续注射5 d。

听性脑干反应：造模前及造模后1周时对实验动物进行听性脑干反应及耳声发射检测，评估有无造模成功。造模成功的实验动物植入脂肪间充质干细胞后1，3周进行听性脑干反应检测。用氯胺酮40 g/kg+地西泮5 g/kg+阿托品0.05 g/kg腹腔注射麻醉，针式电极放置皮下，记录电极放置于双侧外耳道连线的颅顶正中皮下，参考电极放置于左侧耳后皮下，地极放置于对侧耳后皮下，插入式耳机放入外耳道内。刺激声为0.10 ms交替短声刺激，带通滤波100-3 000 Hz，扫描时间10 ms，刺激声重复率10次/s，叠加1 024次，声刺激从100 dB开始，10 dB一档递减，每只豚鼠先测左耳，再测右耳，观察Ⅲ波波形及记录阈值。每分贝重复测2次，取其平均值作为结果。耳蜗组织冰冻切片EDU荧光追踪：每组动物分别在细胞植入后1周和3周各处死一半，豚鼠腹腔过量麻醉处死，快速断头取出听泡，显微镜下打开听泡，暴露耳蜗，40 g/L的多聚甲醛通过圆窗充分灌注耳蜗，置于固定液中4 ℃固定24 h，RapidCal.Immuno脱钙剂脱钙3 d，显微镜下去除多余骨质，修小耳蜗标本，PBS漂洗3遍，置于20%蔗糖内过夜，包埋后行耳蜗中轴快速冰冻切片，片厚约5 μm，切片后用40 g/L多聚甲醛固定5 min，PBS洗3次×5 min，避光配置Clidk-iT反应混合液，配置后15 min内使用，滴加Clidk-iT反应混合液，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗3次× 5 min，滴加5 mg/L的Hoechst33342染核，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗2遍，滴加PBS封固，置于激光共聚焦显微镜下观察，并拍摄结果。

全文链接：

讨论

近年来，干细胞植入治疗毛细胞及螺旋神经节受损是治疗感音神经性耳聋的研究热点，Zhao等^[2]通过研究发现，直接将增强型绿色荧光蛋白标记的胚胎干细胞通过耳蜗鼓阶途径移植到致聋的大鼠耳蜗，分别在不同时间点观察胚胎干细胞迁移到中阶Corti器的位置，部分甚至表达毛细胞特异性标记物肌球蛋白Ⅶa因子，移植的胚胎干细胞在耳蜗至少可存活6周，但却受到致瘤性及伦理问题的限制。Fu 等^[3]将绿色荧光蛋白标记的神经干细胞通过圆窗植入大鼠耳蜗，通过听性脑干反应检测移植前后听力无明显提高，但移植神经干细胞可以在耳蜗内存活并迁移。Kasagi等^[4]将小鼠骨髓间充质干细胞体外用绿色荧光标记，通过外淋巴灌注技术植入后半规管，分别在1周和2周观察植入细胞在耳蜗内存活并发生迁移，听性脑干反应检测听力损失有部分的改善。但神经干细胞和骨髓间充质干细胞的获取难度大，细胞收获率低，不宜做为将来转化医学的首选种子细胞。相比较，脂肪间充质干细胞则可以从手术废弃的脂肪中获取，来源丰富，收获率达2%^[5]，且不存在免疫排斥反应和伦理问题，可作为干细胞植入治疗的首选细胞。

干细胞移植替代治疗要求既要将细胞传递到病变区域，又要减小因治疗带来的损伤，而内耳的结构复杂而精密，且又全部埋藏在骨质内，细胞植入的途径对于治疗的效果至关重要。目前细胞植入途径主要有圆窗膜途径、鼓阶途径、淋巴囊途径、半规管途径、静脉移植途径等^[6-8]，耳蜗圆窗膜径路可以保持耳蜗的自然解剖结构的完整性，注射后无需填补，可自行愈合，但操作技术难度大，易造成圆窗膜的撕裂，引起外淋巴漏而影响听力。而豚鼠作为耳科学研究首选的实验动物，耳蜗鼓阶微孔植入术已经非常成熟，确保了植入干细胞用于治疗感应神经性耳聋的实验数据的可靠性及可行性。耳毒性药物引起的听力损失，是感音神经性耳聋最常见的病因之一，氨基糖苷类药物所致耳聋在聋哑儿童中约占60%，豚鼠对氨基糖苷类药物损害具有典型的病理反应，其听力变化的趋势与人类相似，对于研究人类氨基糖苷类药物致耳聋具有重要的应用价值。

实验结果发现，耳蜗鼓阶微孔植入术是安全而且可靠的将外源性细胞导入耳蜗的途径，使用微量注射器插入鼓阶，促使外淋巴发生移动，增加了耳蜗组织的易感性，使植入细胞能够更有效而广泛的分布在耳蜗组织的各个部分。在植入后1周及3周进行听性脑干反应检测结果显示，听力较移植前逐渐好转，结合快速冰冻切片结果，植入后1周，细胞大多分布在外淋巴液中，部分迁移至耳蜗柯蒂器贴附于基底膜上，使得听力部分恢复，3周后植入细胞不仅迁移并贴附在Corti器基底膜发挥作用，而且部分迁移到蜗神经，对神经的损伤也有一定的修复作用，但随着植入时间的延长，植入细胞在耳蜗内存活减少，影响了植入细胞进一步的发挥作用，对植入细胞的长期疗效无法进行进一步观察。因此对植入细胞定向归巢及植入后长期疗效将有待进一步的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

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