组织工程技术在尿道重建中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.025

摘要/Abstract

摘要：

背景：多种疾病或创伤可导致尿道组织的缺损或狭窄，需用其他组织来修复与重建。传统应用包皮、口腔黏膜，或者其他自体移植物修复会带来较多并发症，而组织工程的兴起为尿道修复与重建开辟了新的治疗思路。
目的：总结并探讨组织工程支架材料的选择、种子细胞的选择，以及目前组织工程在尿道修复中的临床应用情况。
方法：由第一作者应用计算机检索PubMed数据库及万方全文数据库1994年1月至2012年5月有关尿道组织工程的文章，英文检索词为“Tissue engineering, urethra, scaffold materials, stem cells，Vascularization”，中文检索词为“组织工程；尿道；支架材料；干细胞”。排除重复性研究，共保留57篇文献进行综述。选择文章内容主要为组织工程支架在尿道修复中的应用情况，同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。
结果与结论：目前组织工程研究的主要目标仍旧是以下几点：选择最佳支架、最佳干细胞来源，促进移植物新生血管和神经长入。泌尿系统组织工程已经报道，在临床上，使用复合或者不复合种子细胞的脱细胞支架可以重建尿道。虽然在大规模应用于临床前，还需要进一步的研究和创新，有理由期待组织工程会在尿道疾病中发挥越来越大的作用。

关键词: 组织构建, 组织构建学术探讨, 尿道, 支架材料, 干细胞, 血管化, 脂肪干细胞, 骨髓间充质干细胞, 临床应用, 综述

Abstract:

BACKGROUND: Many congenital and acquired anomalies can lead to a defect or stenosis of the urinary tract that ultimately need to be rebuilt. Past surgical repair often utilizes skin, oral mucosa or autologous graft, which may lead to many postoperative complications. The development of tissue engineering technology has opened up a new treatment approach for urethral repair and reconstruction.
OBJECTIVE: To summarize the current development of scaffold materials, cell sources, and the clinical applications of tissue engineering technology in urethral repair and reconstruction.
METHODS: A computer-based online search of literatures related to urethral tissue engineering from January 1994 to may 2012 was performed by the first author in PubMed database and Wanfang database using the key words of “tissue engineering, urethra, scaffold materials, stem cells, vascularization” in English and in Chinese. Literatures published in the authorized journals or recently were preferred. A total of 57 literatures were chosen in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The main goals underlying the most current research in tissue engineering remain the following: the determination of the optimal scaffold for cell seeding, the best source of stem cells, and the promotion of neovascularization and nerve regeneration into the implant. Studies addressing urethral tissue engineering have demonstrated that acellular scaffolds with or with no seed cells can be used for urethral reconstructions in clinical trials. While continued development and additional innovation are necessary before potential broad applications are realized, there is cautious optimism that tissue engineering technology will play an increasing role in the management of urethral diseases.

Key words: tissue construction, tissue construction academic discussion, urethra, scaffolds, stem cells, vascularization, adipose stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, clinical applications, review

中图分类号:

R318

吕向国，徐月敏. 组织工程技术在尿道重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(11): 2067-2074.

Lü Xiang-guo, Xu Yue-min. Tissue engineering technology in urethral reconstruction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(11): 2067-2074.

图/表（结果） 1

2.1 修复尿道的支架材料 在组织工程领域，理想的生物支架材料应具备：①良好的生物相容性：即无毒性和无抗原性。②可降解性和可降解速率可控性。③良好的结构相容性：有一定空隙率为细胞黏附和一定机械强度支撑尿道。

2.1.1 天然提取物天然提取物作为支架材料的研究和应用一直比较少，构成蚕丝的丝素蛋白近年来受到人们的重视。丝素蛋白无毒，无抗原性，具有良好的生物相容性和三维结构，有利于细胞黏附，并促进内皮细胞生长，分化及血管化形成^[9]。刘春晓等^[10]用丝素蛋白膜修复1.5 cm的兔尿道缺损获得较好效果，提示丝素蛋白膜能够诱导尿道黏膜上皮细胞及尿道平滑肌的生长，具有促进尿道缺损修复的能力。

2.1.2 细胞外基质衍生物脱细胞基质支架是来源于动物和人体的天然组织。通过物理和化学的方法使这些组织脱细胞，仅保留组织基本的结构元素，包括胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白。脱细胞基质最大的优点为含有一些内在生长因子，例如成纤维细胞生长因子，血管内皮生长因子，转化生长因子β1和上皮生长因子，这些生长因子促进细胞的黏附、生长和分化^[11]，其三维结构也适合细胞的黏附、渗透和生长繁殖；这种材料的缺点是随着供体的不同，材料的组成可能会有显著的差别，并且理论上会出现病毒传染的危险。

小肠黏膜下层通过机械性去除猪小肠黏膜层、浆膜层和血管膜后制得，是一种富含胶原的无细胞基质材料，它含有组织再生至关重要的功能性生长因子，免疫原性极低。在20世纪90年代，kikuno等^[12]应用未种植种子细胞的单纯猪小肠黏膜下层作为移植物修复犬动脉和静脉，促使人们期待其在尿道修复中的应用。徐月敏等^[13]采用4层小肠黏膜下层补片修复治疗尿道狭窄患者18例，术后17例排尿通畅，1例尿道下裂患者术后5个月出现轻度尿道狭窄症状，行尿道扩张治疗。结果表明利用小肠黏膜下层修复尿道狭窄具有创伤小、抗感染力强的特点，可作为组织工程尿道修复重建材料修复部分尿道狭窄患者。

膀胱黏膜下层与小肠黏膜下层相类似，为低免疫原性的富含胶原的脱细胞基质，移植时没有排斥反应，且壁薄有利于进行操作，强度充分可进行缝合。Chen等^[14]应用猪的膀胱黏膜下层修复兔的1 cm× 0.7 cm尿道缺损，术后2周组织学检查见基质中有新生血管生长，6个月可见尿道肌束排列接近于正常尿道平滑肌束，说明膀胱黏膜下层有保持尿道功能的特性，用作现成的尿道替代材料具有一定优势。EL-Klassaby等^[15]应用膀胱黏膜下层修复尿道狭窄，28例患者中，除了4例患者在吻合口出现狭窄外，其他患者膀胱镜检查发现新尿道形成，活检标本组织学检查发现典型的尿道上皮。

范应中等^[16]用复合种子细胞的猪尿道脱细胞基质为支架，构建组织工程化尿道修复兔尿道缺损，可形成类似于正常尿道的组织结构。新生成的尿道组织基本接近于正常的尿道组织结构，由此可见脱细胞尿道基质是一种可用于尿道缺损修复的良好材料。

冯超等^[17]检测并比较小肠黏膜下脱细胞基质、膀胱黏膜下脱细胞基质、聚羟乙酸和尿道海绵体脱细胞基质支架材料相关的生物力学性能及组织相容性。线粒体代谢活性法检测结果显示所有支架材料均支持正常的细胞生长代谢，并未发现存在明显的细胞毒性，但尿道海绵体脱细胞基质在力学和组织学的诸多参数上具有一定的优越性。

2.1.3 合成聚合物这种材料的优点是可以调控支架机械性能、降解率、微结构并能按设计要求大规模批量生产，可以避免免疫问题。缺点是材料降解时影响周围环境引起无菌性炎性反应。

Newman等^[18]研究发现聚乳酸羟基乙酸共聚物在组织工程中作为多功能干细胞和调控因子载体具有巨大潜能。聚羟基乙酸降解4-8周，聚乳酸则可存在2年才被降解。于是根据两者的构建比例达到理想的降解速率。聚乳酸-羟基乙酸共聚物是第1批被美国FDA批准的用于临床的生物可降解材料，它具有良好的生物相容性和生物可降解性，且无严重毒性作用，被广泛应用于组织工程研究中，尤其以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(80∶20)应用最为广泛。

Sharma等^[19]研究报道了一种新型的可生物降解的聚合物——聚(1，8-辛二醇柠檬酸)。这种聚合物具有许多可以为组织工程应用的有利特点，如其免疫原性极低，异物反应少见，它可以通过化学方法修改，允许缓慢释放生长因子，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生因子和胰岛素样生长因子。

静电纺丝技术是近年来公认的制备组织工程支架的理想方法，王晓庆等^[20]以聚乳酸羟基乙酸共聚物为原料，采用静电纺丝工艺制备并通过戊二醛交联的可降解尿道支架可完全满足尿道组织工程支架对材料力学、空间结构及降解时间的要求。和其他材料相比，静电纳米纤维显示出比较优越的可行性，这可能是因为其模仿细胞外基质结构，具有较高的表面积/体积比^[21]。通过不同的表面改性，如等离子体处理、湿化学法、表面接枝聚合，支架可以最大化的物理吸附多样的生物活性分子，包括抗癌药物、酶、细胞因子、多糖^[22]。

选择好支架后，为允许支架应用到临床，它们必须以无菌生产方式生产或经过消毒。Selim等^[23]研究γ射线辐照、聚丙烯酸、乙醇3种消毒方法对静电纺丝聚乳酸羟基乙酸共聚物支架的物理和机械特性的影响。结果显示所有的消毒方法都会导致支架的强度和弹性减少，特别是乙醇处理过的支架变得很脆，聚丙烯酸和γ射线照射似乎是合适的消毒聚乳酸羟基乙酸共聚物支架方法。研究还显示不论灭菌方法或是种子细胞的类型，种植细胞前后支架收缩和支架的力学性能进一步降低但是会增加支架弹性。总之，这项研究提供了宝贵的信息，支架消毒以及加入这些细胞对支架的影响，未来都将是可预见的。这意味着，可以操纵这些变量，实现组织工程化组织与天然组织相媲美的性能。

2.2 种子细胞 尿道壁为黏膜层、黏膜下层和肌肉层所组成。而其中尿道上皮细胞和尿道平滑肌细胞是起关键作用的细胞，因此用于构建组织工程化尿道的种子细胞也围绕着获得或替代这两种细胞展开。

2.2.1 上皮组织种子细胞尿道上皮细胞以往是通过活检获取，但最近，Fossum等^[24]应用从膀胱灌洗液中获得的尿路上皮细胞在实验室扩增治疗尿道下裂患者，并取得成功。但这种方法获取到的尿道上皮细胞量少，不易培养，容易老化且很难传代。Cliento等^[25]开创了人移行上皮细胞培养扩增方法并报告采集1 cm×1 cm的尿路上皮可在8周内将细胞扩增到 4 202 cm²。

组织工程化尿道上皮直接选择尿路上皮细胞，虽能保证上皮细胞同源性，但缺点是取材困难、培养繁琐；包皮表皮细胞来源丰富，包皮取材较为容易、且不影响尿道正常结构，体外易于扩增，有利于其在临床的运用^[26]。Fu等^[27]利用兔自体包皮表皮细胞复合管型膀胱黏膜下脱细胞基质修复兔尿道缺损，获得成功，表明包皮表皮细胞作为种子细胞复合管状脱细胞胶原基质可以成功地用于构建组织工程化尿道，并可以转化为移行上皮细胞。

最近研究发现口腔黏膜细胞与尿道黏膜上皮同属于上皮组织中的被覆上皮，两者都具有防御功能，而且口腔黏膜细胞取材方便，创伤小，体外易于培养扩增。取口腔黏膜的上皮细胞作为细胞主体，在体外进行培养增殖后，与细胞支架复合，应用于缺损尿道的修复，以解决长段尿道狭窄修复的难题，为组织工程化尿道修复在人体的运用创造了可行性和便利^[28-29]。

2.2.2 可分化为上皮细胞或平滑肌细胞的干细胞相比成熟体细胞，干细胞更适合组织工程，因为分化成熟的细胞不容易生长延伸^[30]。当前对胚胎干细胞和多能干细胞关注的比较多，许多研究者报道了从骨髓、羊水和脂肪组织衍生的多能干细胞进行组织工程化，并且获得了很好的结果^[31-32]。

Shokeir等^[33]认为胚胎干细胞是组织再生的强有力的来源，但是这牵涉到伦理方面的问题。因此未来努力的方向有两个：第一，发展重组技术，努力获得胚胎干细胞的特性而不危害胚胎；第二，寻找另外一种表达相同特性的细胞。但是这会有带来疾病传播和免疫排斥的危害。而自体干细胞没有伦理和免疫排斥的担忧，使其成为胚胎干细胞最佳的替代细胞。

近年研究发现骨髓间充质干细胞有惊人的可塑性，其具有自我更新的能力并能分化形成最终成熟效应细胞。虽然骨髓间充质干细胞在骨髓中含量并不多，仅仅占长骨的有核细胞的0.001%-0.010%，但相对来说比较容易分离和培养^[34]。

鉴于骨髓间充质干细胞不能无限制的获取，且会造成取材部位的损伤。Lin等^[35]认为脂肪组织是获取干细胞的好资源，因为脂肪组织源性干细胞来源广泛，获取容易被人接受，而且从1 g脂肪组织提取干细胞的量要比从1 g骨髓中提取的多，黏附基质能力和生长分化能力与骨髓间充质干细胞基本相同，这都预示着其有广阔的应用前景。研究还表明，将复合脂肪干细胞的支架回植体内修复尿道缺损，脂肪干细胞能显著促进血管的形成、生长^[36]。

在最近的研究中，Zhang等^[37]证实在膀胱洗涤液中，尿源性干细胞能够被分离、提取、生长并分化成膀胱上皮细胞和平滑肌细胞。Wu等^[38]体外分离培养尿源性干细胞，诱导分化分为尿道上皮细胞和尿道平滑肌细胞，并将其接种到改良的多孔小肠黏膜下层支架上，植入裸鼠1个月后，移植物细胞表面表达尿路上皮细胞和平滑肌细胞标记物，说明尿源性干细胞可以作为组织工程技术尿道重建的种子细胞。

2.3 移植物构建 细胞与生物支架材料的复合培养是构建组织工程泌尿道组织的重要步骤。Zhang等^[39]介绍了5种不同的种子细胞的培养方法：①将上皮细胞单独种植于小肠黏膜下层的黏膜表面。②将平滑肌细胞单独种植于小肠黏膜下层的黏膜表面。③将平滑肌细胞单独种植于小肠黏膜下层的黏膜表面1 h后再将上皮细胞种植进行分层联合培养。④将平滑肌细胞种植于小肠黏膜下层浆膜表面24 h后将膀胱上皮细胞种植于黏膜表面进行三明治样培养。⑤将上皮细胞和平滑肌细胞混合后种植于小肠黏膜下层黏膜表面联合培养。组织学、细胞形态学显示：单独种植种子细胞的两组仅有很少的细胞渗透入基质；而共同培养的三组存在明显渗透入基质的平滑肌细胞，还形成了有规律的假复层泌尿道上皮和多层平滑肌，最后一组虽然有平滑肌细胞渗入基质但是形成的组织结构没有规律。这说明种子细胞在共同培养时存在重要的细胞-细胞间以及细胞-基质间的相互作用，种子细胞的共同培养更有利于组织工程化尿道的构建。冯超等^[40]研究表明采用振荡法将种子细胞种植到支架上可构建具有良好立体结构的尿道组织。Gu等^[41]最近介绍了一种构建管状尿道移植物的新方法。将硅胶管植入兔腹腔并封闭，2周后取出硅胶管获得管型组织，组织学分析显示：该管型组织从外到内分别由间皮细胞、胶原束和成肌纤维细胞组成，将覆盖在管外的组织外翻，创建管状新尿道，这样间皮细胞就形成了管腔面。实验组切除阴茎尿道段大约1.5 cm并将移植物吻合修补此缺陷。对照组采用没有移植物的直接端端吻合。6个月尿道造影显示，实验组的所有动物狭窄解除，而所有对照组又发生狭窄。说明腹膜腔间皮细胞和成肌纤维细胞作为种子细胞修复尿道缺损的可能。作为替代材料，它制作简单且不危害正常组织，有可能是未来制作尿道修复材料的方法。

而将组织工程化尿道移植到缺损处时常采用两种技术，一种为直接体内技术，即将种子细胞种植到支架后直接植入体内。操作过程简单，不需要特定的培养装置和培养环境，完全依赖于体内环境促进组织再生和成熟；另一种为体外技术，将种子细胞种植到支架后经体外长时间培养，生物材料逐渐降解，细胞不断分泌特异性细胞外基质，最终在体外形成特定组织，再修复相应组织缺损。这种方法构建的组织形成和成熟过程基本上在体外完成，便于观察和评价。相关影响因素也容易分析和控制，并可实现产业化。两种方法各有优缺点。但是有研究显示尿道中的细胞毒素化合物会杀死种子细胞，因此还需要进一步的研究来检测种植后种子细胞的命运(比如存活，增殖，迁移或者分化)^[42]。

2.4 组织工程化尿道临床应用 目前脱细胞基质生物支架已经成功应用于临床治疗，而种植细胞生物支架模型正处于从基础研究向临床应用转化的关键阶段^[43]，目前对于脱细胞甚质研究最多的为小肠黏膜下脱细胞基质、真皮脱细胞基质和膀胱脱细胞基质，并应用于临床尿道修复，已取得较好效果。

徐月敏等^[13]用小肠黏膜下脱细胞基质修复前尿道狭窄，采用4层小肠黏膜下脱细胞基质补片修复治疗尿道狭窄患者18例。术后17例排尿通畅，术后14周尿道镜检查小肠黏膜下脱细胞基质已降解，修复段尿道与周围组织间限消失，黏膜光洁完整，管腔无明显狭窄；植入小肠黏膜下脱细胞基质部位活检显示黏膜表层为上皮细胞。1例尿道下裂患者术后5个月出现轻度尿道狭窄症状，行尿道扩张治疗。结果表明利用小肠黏膜下脱细胞基质修复尿道狭窄具有创伤小、抗感染力强的特点，可作为组织工程尿道修复重建材料修复部分尿道狭窄患者。Palminteri^等[44]认为小肠黏膜下脱细胞基质不适用于海绵体广泛纤维化或者伴有苔藓样硬化病变的尿道狭窄患者。小肠黏膜下脱细胞基质适用指征为尿道狭窄段海绵体纤维化局限的患者，因健康的海绵体组织在促进小肠黏膜下脱细胞基质尿路上皮再生方面起非常关键的作用。

El-Kassaby等^[45]用膀胱脱细胞基质和患者的膀胱黏膜移植物治疗复杂性尿道狭窄进行了比较，他得出结论：虽然用脱细胞膀胱基质治疗的成功率要比用膀胱黏膜移植物低，但是确实是一个不错的选择，而且支架上种植细胞后效果会更好。

Bhargava等^[46]用组织工程化颊黏膜为5例硬化性苔癣病致尿道狭窄患者进行尿道重建，每个患者取0.5 cm颊黏膜，将角质化细胞和成纤维细胞分别培养，然后种植到自体去上皮细胞的真皮上。经过32-37个月随访，3例成功；由于纤维化组织的异常增生，1例做了移植部位尿道全切，1例做了部分切除，这种方法降低了对供体颊黏膜的数量要求。

相对于脱细胞基质支架在临床上的应用来说，人工合成材料应用到临床上的偏少。Raya-Rivera等^[47]最近报道了一项研究，5例患有尿道缺损儿童，应用组织工程管状尿道进行尿道重建。将平滑肌细胞和上皮细胞种植到聚乙醇酸支架构建尿道移植物，然后切除瘢痕组织后通过会阴切口植入。移植3个月后，4名患者新尿道活检显示出现正常组织结构。

对于一个患者来说，是否应用组织工程移植物要根据移植部位的并发症的严重程度以及是否有充足的捐献组织。这其中长段复杂性尿路狭窄迫切需要组织工程移植，因为此病所需大片的自体移植物，会造成很多的并发症。研究者们一直在寻找理想的支架，种植上正确的种子细胞，这种支架应该促进细胞的黏附、生长、移植和分化并且具有理想的生物力学性能。

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引言

尿道损伤、狭窄、先天性尿道缺损等尿道疾病的治疗历来是泌尿外科的难题之一，这些疾病往往利用皮肤，口腔黏膜或肠自体移植物或异种移植物材料取代缺损的组织^[1-2]，但是取材后所带来的供体部位的并发症以及供体材料的有限性却一直无法得到解决。目前这种“以牺牲健康组织去修复病损组织”的治疗模式已经受到严峻挑战^[3]，而组织工程的兴起为尿道的修复与重建开辟了新的治疗思路。

“组织工程”一词是美国国家科学基金会于1987年正式提出和确定的，组织工程学也首次以一门新学科的形式得到权威性的确立。组织工程是各学科间的领域，它是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官结构、功能的生物活性替代物的一门科学^[4]。组织工程是一个很有前途的技术，构建可以恢复、维持或改善机体功能的生物替代品。人体组织工程化产物(将自体体细胞或成体干细胞种植或者不种植到生物相容性材料上)是修复缺乏供移植的组织和器官的新思路并且为重建手术提供新的选择^[5]。理想的组织工程化尿道是将体外培养扩增的正常细胞(种子细胞)吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的基质(生物支架)上形成复合物，将此复合物植入尿道缺损的部位，细胞在基质降解吸收的过程中分泌新的细胞外基质，形成具有正常形态和功能的尿道组织，从而达到修复和重建的目的^[6]。

目前，国内外应用组织工程进行尿道重建的研究热点集中在生物支架材料的开发、理想的种子细胞的找寻以及在支架上接种细胞构建仿真尿道的血管化等方面^[7-8]，以期利用这些材料修复和修补尿道缺损。这篇文章重点关注支架材料的选择，细胞来源的选择，以及组织工程目前在尿道疾病临床修复中的应用和未来的发展前景。

材料方法

讨论

尿道修复材料经历了自体组织材料、人工合成材料、组织工程材料的发展过程。一系列动物实验和少数临床应用研究成果显示了该技术在泌尿道修复重建中的有效性及可行性^[48-49]。尽管如此，目前将基础研究广泛用于临床仍有很大的差距。

影响尿道修复重建最常见的难题是瘢痕形成，导致尿道狭窄、愈合差。移植物内有足够多的血管形成可以避免组织纤维化，减少瘢痕形成等问题。所以说尿道修复能否成功与组织工程化尿道的血管化程度密切相关。一般来说，组织工程化尿道血管化依赖宿主本身血管的长入，这个阶段耗时长且不一定能够得到健全的血管网，而一支血管只能供给200 μm半径内的组织，因而体积较大的移植物容易缺血坏死^[50]，在生物工程组织实验中，证实血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子(基本的成纤维细胞生长因子)有利于新生血管形成^[51]，改善局部组织灌注；其他方法如将血管内皮细胞植入支架材料也产生了比较理想的结果^[52-53]。

为了实现组织工程的潜力，必须进一步研究种子细胞如何参与再生过程以及影响它们再生机制以更好地在体内外大量扩增，支架材料的消毒方法的选择和制作工艺改良^[23]，以及移植后血管再生的机制，探索出更好的方法促进新生神经血管长入，抗瘢痕形成^[54-55]，增加手术成功率，近年来，有研究将组织工程与基因工程结合起来，在种子细胞内导入特定基因，使其具备分泌某种生长因子的能力，或者将某种生长因子与支架材料耦合，从而促进组织再生^[56-57]；当然除了技术上的因素，组织工程化尿道的成本效益也是一个需要研究人员考虑的因素。随着上述问题的解决，组织工程在尿道修复重建中的应用将越来越广。

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