Bio-Gide胶原膜对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.007

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (30): 4797-4803.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.007

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Bio-Gide胶原膜对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

许繁，杨德圣

武警总医院口腔科，北京市 100039

修回日期:2014-05-28 出版日期:2014-07-16 发布日期:2014-08-08
通讯作者: 杨德圣，硕士生导师，主任医师，武警总医院口腔科，北京市100039
作者简介:许繁，女，1987年生，汉族，陕西省礼泉县人，辽宁医学院在读硕士，主要从事口腔临床治疗、修复工作及干细胞实验研究。
基金资助:
中国人民武装警察部队总医院院级一类课题(WZ2012008)，课题名称“兔BMSCs复合Bio-Gide胶原膜培养引导骨组织再生能力的实验研究”

Effect of Bio-Gide collagen membranes on the proliferation and osteogenetic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Xu Fan, Yang De-sheng

Department of Stomatology, General Hospital of the Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039, China

Revised:2014-05-28 Online:2014-07-16 Published:2014-08-08
Contact: Yang De-sheng, Master’s supervisor, Chief physician, Department of Stomatology, General Hospital of the Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039, China
About author:Xu Fan, Studying for master’s degree, Department of Stomatology, General Hospital of the Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039, China
Supported by:
a grant from General Hospital of the Chinese People’s Armed Police Force, No. WZ2012008

摘要/Abstract

摘要：

背景：相关实验表明Bio-Gide胶原膜与细胞有良好的生物相容性，但有关与其复合培养干细胞成骨分化能力的报道少见。
目的：观察Bio-Gide胶原膜对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响。
方法：全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞，将第3代兔骨髓间充质干细胞分别接种于覆盖Bio-Gide胶原膜的培养板(实验组)与单纯培养板(对照组)培养。于培养1，4，7，14 d利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖；成骨分化诱导培养1，4，7，14 d收集细胞培养液上清，检测细胞碱性磷酸酶活性。
结果与结论：两组细胞数量均随着培养时间的增加而不断增加，对照组培养7 d细胞数量明显多于实验组(P < 0.05)，其他时间点组间比较差异无显著性意义。两组细胞碱性磷酸酶活性均随着培养时间的增加而不断增加，实验组成骨诱导14 d细胞碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05)，其他时间点组间比较差异无显著性意义。表明Bio-Gide胶原膜可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 胶原膜, 骨髓间充质干细胞, 复合培养, 细胞增殖, 成骨分化, 骨组织工程, 引导骨组织再生技术

Abstract:

BACKGROUND: Bio-Gide collagen membranes show a good biocompatibility with stem cells. But the research on the osteogenetic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells cultured on the Bio-Gide collagen membranes is rarely reported.
OBJECTIVE: To observe the effect of Bio-Gide collagen membranes on the proliferation and the osteogenetic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from rabbits were isolated and cultured by using the whole bone marrow adherence method in vitro. Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells were selected and seeded on the Bio-Gide collagen membrane pretreated petri dish (experimental group) and simple petri dish (control group). The proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells was detected by Cell Counting Kit-8 at 1, 4, 7, 14 days. The supernatant of the cells cultured in osteogenic differentiation medium were collected to detect the activity of alkaline phosphatase at 1, 4, 7, 14 days.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of bone marrow mesenchymal stem cells in the two groups was increased with the increasing time, and the control group had more cells than the experimental group at 7 days (P < 0.05). There was no significant difference between the two groups at other time points. The alkaline phosphatase activity was increased with the increasing culture time, and the experimental group had a higher activity than the control group at 14 days (P < 0.05). There was no significant difference between the two groups at other time points. Experimental findings indicate that Bio-Gide collagen membranes can promote the proliferation and the osteogenetic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: stem cells, collagen, cell differentiation, bone regeneration

中图分类号:

R318

许繁，杨德圣. Bio-Gide胶原膜对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(30): 4797-4803.

Xu Fan, Yang De-sheng. Effect of Bio-Gide collagen membranes on the proliferation and osteogenetic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(30): 4797-4803.

图/表（结果） 6

2.1 兔骨髓间充质干细胞的分离和培养 原代细胞在接种骨髓腔冲洗液的24 h后从组织块中爬出，倒置显微镜下可见在大量悬浮细胞下有少量呈梭形生长的贴壁细胞，在培养48 h后首次行全量换液去掉未贴壁的悬浮细胞，可见贴壁细胞数量增多且呈现集落样，经传代培养不断提纯贴壁细胞，细胞生长状态良好且分布均匀，倒置显微镜下观察细胞呈旋涡状排列，达到80%-90%融合，见图1，2。

2.2 细胞增殖情况 CCK-8检测细胞吸光度值数据见表1，数据经两独立样本t 检验行统计学分析；以时间、A值为坐标，绘制细胞增殖曲线，见图3。图中可以看出，随着培养时间的增加，两组细胞数量均不断增加，第1-4天细胞处于生长适应期，第1，4天两组细胞数量比较无明显差异(P > 0.05)；第4-7天细胞处于对数生长期，细胞大量增殖，在第7天两组细胞数量比较差异有显著性意义(P < 0.05)，实验组细胞少于对照组；随着培养时间的增加，第7-14天细胞逐渐进入生长平台期，在第14天两组细胞数量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，说明Bio-Gide胶原膜适宜骨髓间充质干细胞的生长，可以作为骨髓间充质干细胞增殖的载体。

2.3 细胞碱性磷酸酶活性 碱性磷酸酶检测数据见表2，数据采用两独立样本t 检验行统计学分析；以时间、A值为坐标，绘制细胞碱性磷酸酶活性图，见图4。如图所示，两组细胞在成骨分化诱导液的诱导下，细胞向成骨方向分化，两组细胞碱性磷酸酶活性随着培养时间的增加不断升高，在成骨分化诱导的第1，4，7天，两组细胞碱性磷酸酶活性比差异无显著性意义(P > 0.05)，但在第14天，实验组细胞碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05)，说明在成骨分化诱导条件下，两组细胞均逐渐具有成骨分化能力，但实验组细胞成骨分化能力更强，说明与Bio-Gide胶原膜复合培养更有利于干细胞的成骨分化，随着培养时间的增加，Bio-Gide胶原膜对经成骨分化诱导干细胞的细胞碱性磷酸酶活性有促进作用。

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引言

引导骨组织再生技术中利用胶原膜作为屏障膜创造了一个相对封闭的组织环境，在软组织与骨缺损之间建立生物屏障，使迁移速率较软组织细胞慢、具有骨组织修复能力的骨细胞优先进入骨缺损腔^[1-2]，为牙种植区骨量不足、牙周病治疗及其他骨缺损的修复、骨折愈合提供新方法。

成骨细胞从骨缺损的骨壁边缘向骨缺损腔迁移，成骨细胞数量少，成骨方向为由缺损腔向软组织的单向成骨，覆盖的单纯胶原膜没有成骨作用^[3]，只是起到机械屏障作用，在新生骨组织完全替代骨缺损腔填充材料前，由于可吸收性胶原膜材料的降解，对软组织长入的阻挡作用减弱，软组织长入占据骨组织修复空间，对骨修复的效果有一定影响。可吸收性胶原膜不需二次手术取出，临床使用越来越普遍，但可吸收性胶原膜在骨组织再生过程中缺乏主动的诱导分化能力和加速生长的作用^[4]，骨组织再生慢。可吸收性胶原膜与屏障时间短、骨修复慢存在矛盾。

胶原是一种人工细胞外基质，它的可塑性、可吸收性、无毒性等特点使其被广泛用作组织工程支架材料，有研究证明，胶原膜的屏障作用可以保证骨断端及缺损腔内的骨生长因子浓度水平，对骨组织增生和分化起着十分重要的作用^[5]。随着胶原膜的迅速发展，商品化膜日益广泛，其中以Bio-Gide胶原膜应用最为广泛^[6]。Bio-Gide胶原膜由猪的Ⅰ型和Ⅲ型胶原构成，与细胞外基质的主要成分相似，Bio-Gide胶原膜在临床上已得到广泛应用，其为组织再生提供空间的屏障膜作用已被充分证实^[7-9]。支架材料对细胞增殖与分化的影响是评价支架材料的两个重要方面，相关实验表明Bio-Gide胶原膜与细胞有良好的生物相容性，细胞可在Bio-Gide胶原膜上黏附、迁移、增殖^[10-12]，但与其复合培养干细胞的成骨分化能力鲜有研究。若将骨髓间充质干细胞/ Bio-Gide胶原膜复合物应用于骨缺损修复，需进一步考察Bio-Gide胶原膜对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。

随着骨组织工程技术的发展，可利用骨髓间充质干细胞的自我更新和诱导分化特性构建种子细胞/支架复合物^[13-16]，将胶原膜与具有成骨能力的细胞复合培养，胶原膜的纤维网状可吸附纤维蛋白，细胞沿着纤维长入网状胶原，起到引导“骨外膜”生长的桥梁作用^[17]，使缺损腔被完整的新生骨壁包绕，在胶原膜降解后，新生骨壁仍可起到阻挡软组织的作用，为骨组织修复提供充足的时间，使成骨方向为骨壁与胶原膜之间的双向成骨，增加骨修复速度。

本实验通过体外分离培养兔骨髓间充质干细胞，以Bio-Gide胶原膜作为细胞支架材料^[6]，将两者复合培养，观察Bio-Gide胶原膜对细胞增殖和成骨分化能力的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2012年11月至2013年11月在中国武警医学实验中心完成。

材料：

实验动物：1月龄新西兰大白兔，雌雄不拘，体质量300-500 g，由解放军军事医学科学院医学动物中心提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001。

主要试剂：FBS、DMEM、胰酶、PBS、青霉素、链霉素(中国武警医学实验中心)；Bio-Gide胶原膜(瑞士 Geistlich公司)；成骨分化诱导培养基(Gyagen RBXMX-90021)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学公司)；碱性磷酸酶ELISA试剂盒(北京方程生物科技有限公司)。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离培养：采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞^[19-21]，将新西兰大白兔以2 mL/kg水合氯醛行腹腔注射麻醉，固定备皮、碘伏消毒，无菌条件下小心分离暴露长骨、离断长骨两端，超净工作台下注射器抽取体积分数10%FBS反复冲洗长骨骨髓腔，直至骨内壁发白，收集冲洗液，1 200 r/min 离心5 min，弃上清。加入含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的体积分数10% FBS培养液，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂孵箱中培养。24 h后行半量换液，48 h后行首次全量换液，以后每 3 d换液。待细胞达到80%-90%汇合时，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2传代，取传至第3代兔骨髓间充质干细胞备用。形态学观察细胞黏附于培养皿上形态呈成纤维样集落形成单位，能自主增殖并具有分化能力，表明成功分离骨髓间充质干细胞。

兔骨髓间充质干细胞与Bio-Gide胶原膜的共培养：在超净工作台中将成品Bio-Gide胶原膜修剪成5 mm×5 mm大小，疏松层朝上置于48孔板底部正中，作为实验组；以不覆盖胶原膜的48孔板培养板为对照，每组3复孔。每孔加入100 μL含双抗的体积分数10% FBS浸泡，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂孵箱中孵育过夜。取第3代浓度为2×10⁸ L^-1的兔骨髓间充质干细胞悬液，将100 μL细胞悬液小心接种于Bio-Gide胶原膜疏松层中心位置及对照组，置入37 ℃孵箱中使细胞黏附；孵育4 h后每孔再次加入 100 μL细胞悬液，使细胞二次沉淀，增加接种的细胞数量，以后每3 d换液；细胞碱性磷酸酶活性检测实验中，在复合培养24 h后，培养基更换为成骨分化诱导培养基，每3 d换液。

CCK-8细胞增殖检测：分别于共培养的第1，4，7，14天进行CCK-8增殖检测，每组检测3个复孔；取出待测孔，更换为100 μL新培养基，加入CCK-8试剂10 μL，充分振荡混匀，空白孔加入等量CCK-8溶液及培养基；避光孵育2 h后以100 μL/孔加入96孔酶标板，注意避免产生气泡；酶标仪测定450 nm处的吸光度值A值，以空白孔调零；以时间、A值为坐标，绘制细胞增殖曲线。

细胞碱性磷酸酶活性检测：分别于成骨分化诱导后培养的第1，4，7，14天进行碱性磷酸酶活性检测，每组检测3个复孔；将待测孔培养基上清收集至1.5 mL EP管，-80 ℃保存标本；待样品收集齐后，常温解冻，低速离心备用，按碱性磷酸酶ELISA试剂盒标准操作处理样本，酶标仪测定450 nm处的吸光度值。

主要观察指标：倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态；CCK-8法检测不同时间细胞增殖，并绘制细胞生长曲线；碱性磷酸酶ELISA检测成骨诱导后不同时间点的细胞碱性磷酸酶活性。

统计学分析：所得实验数据用x(_)±s表示，应用SPSS 17.0统计软件，两组间计量资料比较采用两独立样本t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

口腔颌面部炎症、外伤、肿瘤切除及牙周病等原因常导致骨缺损，其中拔牙后1年内牙槽骨在宽度和高度上可吸收25%，拔牙2年后牙槽骨有明显吸收^[18]，骨缺损修复越来越受到重视。随着干细胞的研究与发展，可利用骨髓间充质干细胞的自我更新和诱导分化特性，局部注射到骨缺损腔修复骨缺损，但单纯细胞移植容易发生细胞流失，缺乏生长及营养代谢交换的立体空间。本实验利用成品胶原膜Bio-Gide胶原膜作为支架材料，研究Bio-Gide胶原膜对复合培养骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响，探讨Bio-Gide胶原膜作为组织工程技术的支架材料的可行性及优势。

3.1 二次接种法 在细胞与支架材料的复合培养中，除了要求支架材料有良好的细胞相容性以外，还需要细胞能更多地接种在支架材料上并能牢固地附着在支架材料上，构建不同的工程化组织，需采用不同的细胞接种方法。

结合骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性与Bio-Gide胶原膜双层结构的特性，本实验为了防止因接种细胞速度过快或者液体量过多，导致细胞从支架材料上溢出，影响支架材料上细胞的接种数量，采用了二次接种法^[19]，又称二次沉淀法，实验中先将部分细胞悬液少量缓慢地滴加到胶原膜上，接种在胶原膜的中心位置，使细胞由胶原膜中心向四周迁移，防止由于接种细胞悬液液体量过大、接种速度过快导致细胞从胶原膜上溢出。第1次接种后放置于孵育箱培养4 h，待细胞充分黏附于胶原膜上后，再次缓慢加入剩下的部分细胞悬液，产生种子细胞的二次沉淀，以增加种子细胞的黏附数量。

胶原膜上黏附的细胞数量多，细胞间细胞外基质及信号通道等相互影响，易于细胞的黏附生长。一次性接种细胞悬液，若液体量少，则细胞密度大，此时的单细胞悬液不易制备，操作上不易将细胞充分混匀和吹打，细胞团块接种到胶原膜上也将不利于细胞的黏附生长；若液体量大，则细胞悬液制备操作方便，但一次性接种会导致细胞悬液

从胶原膜上溢出，细胞贴壁于培养板底部，胶原膜上黏附的细胞数量少，所以本实验采用二次接种法，即保证了单细胞悬液制备过程中细胞的充分混匀，又避免了细胞悬液溢出胶原膜，通过细胞的二次沉淀，提高胶原膜上细胞黏附的数量。

若支架材料为筛网状，接种的细胞有可能从网孔中漏出，Bio-Gide胶原膜致密层的细胞黏附和增殖能力较疏松层弱^[12]，起到屏障作用，实验中将胶原膜疏松层朝上，致密层朝向培养板底部，疏松层利于种子细胞的黏附，致密层防止种子细胞的流失，二次接种法适用于这种底部致密但表层呈网状疏松的支架，通过种子细胞的二次沉淀，增加种子细胞黏附的数量。

3.2 收获细胞的方式 传统收获细胞的方式为胰蛋白酶消化法，通过胰酶对细胞外蛋白的消化，导致细胞间、细胞与培养瓶内壁的连接破坏，细胞相互分离并脱离培养瓶底壁，实现对细胞的收获，但胰酶的消化破坏了细胞外基质。细胞片层技术可以获得完整的细胞外基质^[20]，但该技术在收获细胞时会产生收缩^[21]，这种收缩不仅会导致细胞片层大小的改变，而且会导致细胞片层质量的改变^[20-23]。细胞与胶原膜复合培养成为一体，对于胶原膜的转移可作为直接收获细胞的方法，与传统的胰酶消化法相比，避免了胰酶对细胞外基质成分的破坏，保存了完整的细胞外基质，可为细胞黏附与增殖提供微环境^[18^，^24]。与细胞片层技术相比，胶原膜在收获细胞时可避免产生收缩，保持稳定的面积，并且胶原膜在植入体内时具有阻挡软组织的屏障膜作用，细胞片层不能阻挡软组织的长入，不能给骨组织重建提供充足的时间。

Bio-Gide胶原膜具有交织的网孔结构，体外细胞培养时培养基可通过网孔渗入而营养细胞。Bio-Gide胶原膜具有良好的早期血管化^[25]，其结构可以引导血管，在植入体内后形成均匀一致的穿膜血管，使膜与相邻组织有良好的结合，提供组织愈合稳定的环境。新生血管可以为复合培养的细胞提供代谢需要，新生成骨细胞和骨形成相关细胞因子可以借新生血管迁移，到达骨缺损腔内部，促进新骨形成。

3.3 Bio-Gide胶原膜对骨髓间充质干细胞增殖的影响

Bio-Gide胶原膜的结构与成分：Bio-Gide 胶原膜是由Ⅰ型及Ⅲ型胶原组成的可吸收性膜，由致密层和疏松层双层结构组成，结构有很多特点：具有纤维网状结构，Ⅰ型胶原能为细胞提供酶识别，外源性胶原对细胞分泌新的胶原基质有刺激作用^[26]，Bio-Gide胶原膜中的Ⅰ型胶原作为外源性胶原，对骨髓间充质干细胞的胶原基质有刺激作用，Ⅰ型胶原诱导成纤维细胞样形态和纤维性基质形成^[27]；Bio-Gide胶原膜的胶原成分与细胞外基质的基本成分相似：Bio-Gide胶原膜是天然的猪源性胶原，主要组成成分是胶原蛋白，胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，胶原蛋白特定的排列形式组成细胞外基质的网状结构，起到锚定细胞的作用，提供细胞黏附与增殖的微环境^[18^，^24]。Bio-Gide胶原膜结构及成分上的特点使其与骨髓间充质干细胞有良好的生物相容性。

Bio-Gide胶原膜对细胞增殖的影响：本实验中数据显示，两组细胞数量随着培养时间的增加均不断增加，第1-4天细胞处于生长适应期，第4-7天处于对数生长期，细胞大量增殖，第7-14天逐渐进入生长平台期，在第14天，两组细胞数量无差异(P > 0.05)，说明Bio-Gide胶原膜适宜细胞的生长，可以作为骨髓间充质干细胞增殖的载体，这与Bio-Gide胶原膜的结构与成分密切相关。

在共培养的第7天，对照组细胞数量多于实验组，分析原因为：细胞在支架上的增殖和分化与细胞贴壁和铺展情况密切相关^[28]，Bio-Gide胶原膜的三维立体结构与培养板的光滑平面相比，细胞在培养板上的迁移速度较在Bio-Gide胶原膜上快^[29]，在培养早期对照组细胞数量多。随着培养时间的增加，在共培养的第14天，对照组与实验组细胞数量无差异，分析可能原因为：随着培养时间的增加，对照组的二维结构使细胞铺展的面积有限，由于接触抑制细胞增殖逐渐缓慢甚至死亡，而胶原膜的网状结构可以为细胞增殖和迁移提供三维立体空间^[30]，利于细胞的铺展，胶原膜的胶原成分也为细胞提供人工细胞外基质^[9-10,26-27]，利于细胞的增殖，在这种差异下，随着培养时间的增加，两组细胞数量逐渐接近，第14天两组细胞数量无差异。

3.4 Bio-Gide胶原膜对细胞成骨分化的影响

成骨分化诱导液对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响：骨髓间充质干细胞具有多向分化能力，可向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等方向分化，实验中使用成品成骨分化诱导液使细胞向成骨方向分化，成骨分化诱导液的主要成分是维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠，在体外培养中维生素C是细胞合成胶原的必需物质，可以调控碱性磷酸酶活性，具有促进蛋白质合成的作用^[31-33]；地塞米松通过调控分化细胞的基因表达，提高碱性磷酸酶活性，促进细胞向成骨方向分化^[34-35]；β-甘油磷酸钠提供产生沉淀所需的磷离子成分，促进生理性钙盐的沉积。成骨分化诱导液可诱导干细胞向成骨细胞分化，成骨分化诱导液中的地塞米松在促进干细胞向成骨分化的同时对细胞增殖有抑制作用^[36-37]。在成骨分化诱导过程中，即使细胞数量增加缓慢，但随着成骨分化诱导液对细胞的诱导分化作用，具有成骨分化能力的细胞数目越来越多，细胞碱性磷酸酶是细胞成骨分化的早期重要指标，成骨分化诱导下细胞碱性磷酸酶活性将逐步升高。本实验中，经细胞培养液上清检测其中的碱性磷酸酶活性得出，在成骨分化诱导液的作用下，骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，细胞碱性磷酸酶活性逐渐增加。

Bio-Gide胶原膜对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响：实验中在诱导后的第14天，在相同的成骨分化诱导条件下，两组细胞碱性磷酸酶活性均升高，但实验组较对照组骨髓间充质干细胞具有更高的碱性磷酸酶活性(P < 0.05)，表明Bio-Gide胶原膜对经成骨分化诱导兔骨髓间充质干细胞的成骨分化有促进作用，这与Bio-Gide胶原膜的成分与结构有关。

骨组织的形成是成骨细胞分泌细胞外基质再矿化的过程，正常生理状态下含有充足高质量的细胞外基质，Ⅰ型胶原是健康骨组织中的主要有机成分^[28]，Ⅰ型胶原与成骨细胞复合培养可以增强成骨细胞的成骨能力，还可以激发间充质干细胞向成骨细胞转化^[38]。Wada等^[39]用Ⅰ型胶原作为基质培养骨髓间充质干细胞，观察到其可定向分化为成骨细胞。Ⅰ型胶原的作用在Linsley等^[40]的实验中也被证实，接种在Ⅰ型胶原预涂层的人骨髓间充质干细胞，在加入成骨诱导液培养的第30天，钙沉积染色的表达较其他组高，细胞的成骨分化速度较其他组快，Taguchi等^[41]在鼠上颌骨缺损修复中使用胶原膜，实验表明胶原膜能够促进骨再生的同时参与成骨分化的诱导过程。

Bio-Gide胶原膜中含有Ⅰ型胶原成分，Ⅰ型胶原呈现网状结构，这种网状支架结构为细胞外基质的沉积提供条件^[42]，并为骨钙素提供结合位点^[43]，促进形成稳定性好的骨结构。Suzawa等^[44]认为如果细胞含有胶原成分的细胞外基质，对内源性骨形态发生蛋白的表达有促进作用，尤其是骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白4，从而促进细胞的成骨分化。细胞在支架上的增殖和分化与细胞贴壁和铺展情况密切相关^[28]，而此受到材料本身性质与细胞外基质中含有粘连蛋白、纤粘连蛋白等因素的影响^[45]，Borkenhgen等^[46]研究表明纤粘连蛋白的多个功能结构域中有的可与胶原直接结合，这使得Bio-Gide胶原膜中的Ⅰ型胶原成分在骨髓间充质干细胞向成骨分化诱导的过程中起作用，从而使Bio-Gide胶原膜对骨髓间充质干细胞的成骨分化有促进作用。

实验通过研究Bio-Gide胶原膜对复合培养骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响，证实Bio-Gide胶原膜适宜作为骨髓间充质干细胞生长的载体，其对骨髓间充质干细胞的成骨分化有促进作用，作为考察支架材料的两个重要方面：细胞增殖与细胞分化，Bio-Gide胶原膜均表现出良好的生物相容性，具有促进细胞的成骨分化的优势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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Bio-Gide胶原膜对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

Effect of Bio-Gide collagen membranes on the proliferation and osteogenetic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

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