小干扰RNA抑制卵巢癌模型裸鼠移植瘤葡萄糖调节蛋白94的表达及意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.019

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (18): 2897-2902.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.019

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

小干扰RNA抑制卵巢癌模型裸鼠移植瘤葡萄糖调节蛋白94的表达及意义

张丽颖¹，徐爱丽¹，李佩玲¹，艾丽敏²

1哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科，黑龙江省哈尔滨市 150086；2哈尔滨市93220部队门诊部，黑龙江省哈尔滨市 150001

收稿日期:2014-03-10 出版日期:2014-04-30 发布日期:2014-04-30
作者简介:张丽颖，女，1978 年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，2001年哈尔滨医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事妇科肿瘤方面的研究。
基金资助:
黑龙江省青年科学基金(QC2009C82)；黑龙江省博士后科研启动金资助(LBH-Q11051)；黑龙江省卫生厅科研课题(2007-320)

Small interfering RNA inhibits glucose regulated protein 94 expression in transplantable models of human ovarian carcinoma in nude mice

Zhang Li-ying¹, Xu Ai-li¹, Li Pei-ling¹, Ai Li-min²

1Department of Gynecology and Obstetrics, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China; 2Clinic of Harbin 93220 Army, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China

Received:2014-03-10 Online:2014-04-30 Published:2014-04-30
About author:Zhang Li-ying, M.D., Associate chief physician, Department of Gynecology and Obstetrics, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
Supported by:
Youth Science Foundation of Heilongjiang Province, No. QC2009C82; Postdoctoral Research Start-up Foundation of Heilongjiang Province, No. LBH-Q11051; grants of Health Ministry of Heilongjiang Province, No. 2007-320

摘要/Abstract

摘要：

背景：一些实验在模型鼠移植瘤中葡萄糖调节蛋白94被敲除后，细胞黏附中断，刺激肝起源细胞增殖，进而促进肝肿瘤的发生，推测葡萄糖调节蛋白94在肝癌中起到保护作用。
目的：应用小干扰RNA技术抑制裸鼠卵巢癌模型皮下移植瘤内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白94的基因表达，探讨移植瘤中葡萄糖调节蛋白94基因及蛋白表达的变化对移植瘤生长的影响。
方法：从GeneBank中选取人类葡萄糖调节蛋白94基因序列，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子U6 的真核表达载体psiSTRIKETM/葡萄糖调节蛋白94。建立人卵巢癌HO-8910细胞株裸鼠皮下接种模型，并将真核表达载体转染入裸鼠移植瘤体内，观察肿瘤生长情况。卵巢癌裸鼠模型经过不同给药方案干预后分为特异性小干扰RNA组，非特异性小干扰RNA组和生理盐水对照组， RT-PCR和免疫组化SP法检测葡萄糖调节蛋白94 mRNA和蛋白在肿瘤内的表达情况，并观察模型裸鼠的移植瘤生长情况。
结果与结论：成功构建RNA干扰质粒载体，所有裸鼠模型均接种成功，5 d后即可见皮下肿瘤形成，14 d左右肿瘤直径达7-10 mm。转染质粒完毕后抑瘤率为65.1%，与非特异性小干扰RNA组和生理盐水对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.01)。psiSTRIKETM/GRP94治疗后瘤体内葡萄糖调节蛋白94 mRNA和蛋白显著下调(P < 0.01)。说明靶向葡萄糖调节蛋白94 mRNA的小干扰RNA可显著抑制人卵巢癌裸鼠移植瘤的生长，其机制可能是诱导葡萄糖调节蛋白94 mRNA和蛋白表达下调所致。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 模型构建, 卵巢癌, 细胞株, GRP94, 小干扰RNA, 肿瘤移植, 基因载体

Abstract:

BACKGROUND: After glucose regulated protein 94 (GRP94) was knockout in model mice of transplanted tumor, cellular adhesion is terminated, thus stimulating the proliferation of liver-derived cells and promoting the development of liver cancer. We speculate that GRP94 plays a protective role against liver cancer.
OBJECTIVE: To investigate the expression of endoplasmic reticulum molecular chaperone GRP94 mRNA and protein with small interfering RNA technique in nude mice model of transplantable human ovarian carcinoma, and to explore the effect of GRP94 mRNA and protein expression on the growth of transplanted tumor.
METHODS: The gene sequences of human GRP94 were obtained from Gene Bank. psiSTRIKETM/GRP94 was constructed, which is eukaryotic expression vector controlled by the U6 promoter of human RNA polymerase Ⅲ. The transplantable model of human ovarian carcinoma in nude mice was established using human ovarian cancer HO-8910 cell line. The eukaryotic expression vector was transfected into the transplanted tumors in nude mice, and the growth of the tumor was observed. The nude mice models were divided into three groups, specific small interfering RNA group, non-specific small interfering RNA group and saline control group. The volumes of the subcutaneous tumor were determined. RT-PCR and immunohistochemistry were used to detect the mRNA and protein expression of GRP94 respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The recombinant plasmid of RNA interference specific for GRP94 was successfully constructed. The subcutaneous tumors appeared in all the nude mice 5 days after transplantation. The diameter of subcutaneous tumors was 7-10 mm 14 days after transplantation. The growth of subcutaneous tumors in nude mice with interference specific for GRP94 treatment was significantly decreased as compared with non-specific small interfering RNA group and control group (P < 0.05). The proliferation activity was inhibited by 65.1%. The expression of GRP94 mRNA and protein was significantly down-regulated after treatment of psiSTRIKETM/GRP94 (P < 0.01). The transfection of psiSTRIKETM/GRP94 could significantly induce inhibitory effects on the growth of ovarian carcinoma in nude mice, and the underlying mechanism is associated with the down-regulated expression of GRP94 mRNA and protein.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: RNA, small interfering, ovarian neoplasms, neoplasm transplantation, oncogenes, plant tumor-inducing plasmids

中图分类号:

R318

张丽颖，徐爱丽，李佩玲，艾丽敏. 小干扰RNA抑制卵巢癌模型裸鼠移植瘤葡萄糖调节蛋白94的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(18): 2897-2902.

Zhang Li-ying, Xu Ai-li, Li Pei-ling, Ai Li-min . Small interfering RNA inhibits glucose regulated protein 94 expression in transplantable models of human ovarian carcinoma in nude mice [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(18): 2897-2902.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量及建模成功率将符合条件的24只裸鼠随机均分为3组，每组8只，裸鼠皮下成瘤率为100%，实验过程中无动物死亡，均纳入结果分析。

M 1 2

2.2 重组质粒的鉴定结果 psiSTRIKE^TM载体包含一个Pst Ⅰ位点，重组质粒将会形成第2个Pst Ⅰ位点，经过限制性Pst Ⅰ内切酶消化后，成功的重组质粒将会产生2个DNA片断。靶向GRP94重组质粒psiSTRIKE^TM用限制性Pst Ⅰ内切酶酶切后，可清楚地看到重组载体被切为2个片断，证明重组质粒构建成功(图1)。

2.3 人卵巢癌裸鼠动物模型的观察所有裸鼠均接种成功，5 d后可见皮下肿瘤形成，并随时间延长不断增大，接种14 d左右肿瘤直径达7-10 mm。第15天起瘤内多点注射干预后，非特异性小干扰RNA组和生理盐水对照组裸鼠肿瘤持续生长，体积明显增大；而特异性小干扰RNA组肿瘤生长缓慢。特异性小干扰RNA组移植瘤生长速度显著低于非特异性小干扰RNA组和生理盐水对照组(P < 0.05)，而非特异性小干扰RNA组和生理盐水对照组移植瘤体积增长速度比较差异无显著性意义(P > 0.05，表1)。

3组移植瘤的生长曲线见图2。psiSTRIKETM/GRP94组的抑瘤率达65.1%，与非特异小干扰RNA质粒对照组7.7%和生理盐水对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.01)。移植瘤随时间延长体积增长，早期为椭圆形，表面光滑，后期为不规则形，表面呈结节状(图3A)。质粒治疗后，切除移植瘤为结节状瘤块，与皮肤无粘连，边界清楚，表面血运丰富，切面呈鱼肉样，部分瘤有坏死破溃(图3B)。

2.4 GRP94 mRNA 的检测结果 RT-PCR结果显示非特异性小干扰RNA组(0.87±0.46)与生理盐水对照组(0.89± 0.38)比较未见显著性差别；而特异性小干扰RNA组GRP94mRNA表达显著降低(0.34±0.21)，与其他2组比较差异有显著性意义(图4)。

2.5 GRP94 蛋白的检测结果经psiSTRIKE^TM/GRP94质粒治疗后，与比较，特异性小干扰RNA组瘤体内GRP94蛋白的表达显著下降，见表2，图5。

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引言

应激反应是机体的重要保护措施，如果肿瘤一旦形成，应激反应就会变成肿瘤的保护机制。这种保护机制对于肿瘤细胞的抗免疫原性、抗化疗药物性、抗凋亡性有重要作用，也是目前肿瘤化疗、基因治疗、免疫治疗效果不佳的重要原因之一。应激反应主要以两种形式存在，热休克蛋白介导的细胞质内的应激反应及葡萄糖调节蛋白(glucose regulative proteins，GRPs)介导的细胞核内的内质网应激。而GRP94是内质网应激中的关键因子之一。

GRPs类在某些肿瘤细胞中呈高表达趋势，对于肿瘤细胞的抗化疗药物性、抗原表达有重要意义^[1-2]。在GRPs种族中，GRP94在多种肿瘤细胞中呈过表达趋势，在肿瘤发生发展过程中起重要辅助作用^[3]。RNA干扰是指双链RNA引起的mRNA水平互补序列基因表达的关闭，即序列特异性转录后基因沉寂，是生物体进化过程中抵御外来基因和病毒感染的进化保守机制。此现象是一种在进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，是一种序列特异性的转录后基因沉默(PTGS)，是一种在进化上高度保守的机制。RNA干扰可以高效、特异的阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型的过程，是基因沉默的理想工具，可以直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的^[4-5]。

实验是通过小干扰RNA抑制GRP94的表达并研究其对裸鼠卵巢癌模型皮下移植瘤的治疗作用及瘤组织中GRP94 mRNA 和蛋白的表达变化，旨在从分子水平探讨其治疗作用的可能机制，为小干扰RNA技术在肿瘤治疗中的应用奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
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材料方法

设计：动物实验观察。

时间及地点：实验于2013年6至11月在哈尔滨医科大学公卫学院动物实验中心完成。

材料：

实验动物：雌性BALB/C裸鼠24只，4-6周龄，体质量16-19 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号码：SCXK(沪)2012-0002。裸鼠在SPF条件下饲养，自由摄入无菌水和灭菌标准饲料。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

细胞株：人卵巢癌细胞株HO-8910为哈医大二院实验中心冻存，用RPMI-1640(Gibco)含体积分数10%胎牛血清的培养基于37 ℃、体积分数5%的CO₂条件下常规培养。

其他试剂：siSTRIKE^TMU6载体、限制性内切酶Pst Ⅰ、质粒小量提取试剂盒、RT-PCR试剂盒(Promega)；Lipofectamne^TM 2000 转染试剂、总RNA 提取试剂盒(Invitrogen)；SP试剂盒(美国Maxim公司，博士德公司) ；山羊抗人GRP94抗体(Santa Cruz，C-19)；兔抗山羊IgG(北京中山)。

方法：

构建质粒：选择GenBank中人类GRP94基因编码区序列作为分析序列，依据小干扰RNA表达载体siSTRIKE^TMU6的要求，采用Promega 公司网站提供的小干扰RNA Target Designer-Version 1.51设计软件设计出一对GRP94基因发卡寡核苷酸序列，序列符合小干扰RNA表达载体siSTRIKE^TMU6的要求：经BLAST数据库分析，与其他分子无同源序列；G+C含量接近50%；不含TTT或GGG序列。每对符合上述要求的60 nt的单链寡核苷酸，每条单链寡核苷酸内都包含两段20 nt的寡核苷酸，互为反转重复序列，中间以CTTCCTGTCA间隔，使寡核苷酸内部可形成发夹结构。两对寡核苷酸的核心序列反向互补，两端分别带有pstⅠ酶切位点，3’末端有转录终止信号DNA序列片断TTTTT。

序列特异性小干扰RNA的两条链分别为：5’-ACC GAG GAA GAA GAA GAA GAA ATT CAA GAG ATT TCT TCT TCT TCT TCC TCT TTT TC -3’；5’-TGC AGA AAA AGA GGA AGA AGA AGA AGA AAT CTC TTG AAT TTC TTC TTC TTC TTC CT -3’。

序列非特异性小干扰RNA的两条链分别为：5’-ACC GGG AAA GAA GAA GAA GAA ATT CAA GAG ATT TCT TCT TCT TCT TCC TCT TTT TC -3’；5’-TGC AGA AAA AGG GAA AGA AGA AGA AGA AAT CTC TTG AAT TTC TTC TTC TTC TTC CT -3’。

经退火形成双链，与载体连接，转化大肠杆菌JM109，抗性筛选，经pst Ⅰ酶切鉴定正确的重组质粒命名为psiSTRIKETM/GRP94及psiSTRIKETM/NC-GRP94。

动物模型的建立：在裸鼠右侧腿部皮下接种卵巢癌HO-8910细胞悬液0.2 mL(细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹)。观察接种部位液体吸收、肿瘤生长过程及裸鼠状况，待肿瘤直径达7-10 mm时分组实验。

模型裸鼠的质粒干预：将符合条件的24只裸鼠模型随机均分为3组(n=8)，特异性小干扰RNA组：瘤体内多点注射psiSTRIKETM/GRP94，20 μg/只(20 μg质粒加30 μL转染试剂加300 μL无血清1640培养液)；非特异性小干扰RNA组为非特异小干扰RNA质粒对照组，瘤体内多点注射非特异小干扰RNA质粒载体(剂量同特异性小干扰RNA组)；生理盐水对照组：瘤体内多点注射生理盐水，0.3 mL/只。从移植第15天起，2 d注射1次，共5次。每3 d测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积(V=ab²×π/6，a为长径，b为短径)，进而计算肿瘤抑制率(1-实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%。

RT-PCR检测目的基因的表达：每组分离肿瘤组织，将切下的瘤组织至于液氮中，采用常规RT-PCR方法检测治疗后GRP94 mRNA在移植瘤中的表达变化。GRP94扩增片断长度为496 bp，GRP94上游引物为：5’ACT GTT GAG GAG CCC ATG GAG G 3’；下游引物为：5’GCT GAA GAG TCT CGC GGG AAA C 3’，β-actin扩增片断长度为320 bp，上游引物为：5’ CTG CAA TCC GAA AGA AGC TG 3’；下游引物为：5’ ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG 3’。循环参数如下：94 ℃预变性 5 min，94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，最后72 ℃延伸 10 min。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳中分析结果。

免疫组化检测目的蛋白的表达：每组分离肿瘤组织，取瘤组织40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，常规SP法，DAB显色，苏木精-伊红复染，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察治疗后GRP94蛋白在移植瘤中的表达变化。判定标准：GRP94主要表达在细胞质内，呈棕黄色颗粒。每个视野至少观察100个细胞，依染色强度分级：+++：深棕色，++：浅棕色，+：黄色，-：未着色。

主要观察指标：观察模型裸鼠移植瘤不同组别中GRP94的表达变化，及移植瘤的生长情况。

统计学分析：所有数据均用SPSS 11.0统计软件分析结果。GRP94 mRNA相对表达量用x(_)±s表示，两组之间GRP94 mRNA水平比较采用t 检验；GRP94蛋白表达水平用非参数Ridit检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

在已有的文献中证实GRP94在内质网应激过程中起主导作用，因此抑制GRP94的表达或许会成为肿瘤治疗的新策略。在肿瘤获得抗药性中，GRP94也起到一定的作用。其不仅具有保护线粒体膜的稳定性的能力，而且还能维持钙的内稳态，在应激状态下，线粒体钙超载的减少能使活性氧(ROS)产物、氧化应激和质膜破坏减少，从而起到抗药性的作用^[6]。尚有学者认为GRP94可能是一种细胞表面受体并与信号传导有关^[7]。GRP94结合于ER中包含肿瘤相关抗原的多肽，在细胞溶解时，GRP94-多肽复合物通过CD91被特异性的APCs捕捉，然后递呈到MHC-1。多肽交叉递呈CD8⁺ T细胞启动肿瘤介导的毒性细胞反应(CLT)^[8-9]。有GRP94相伴的蛋白碎片有效的抗原来源，可以传导到APCs并介导CD8⁺ T细胞反应^[10]。因此，GRP94可以制作成疫苗处理各种不同类型的肿瘤患者。GRP94在肿瘤排斥中的作用是通过激活内在免疫系统实现的。GRP94绑定于静止APCs上的清除剂和Toll蛋白样受体，激活NF-kB信号系统并诱发细胞因子释放。然后，自然杀伤细胞激活并杀死肿瘤细胞，肿瘤特异性抗原释放并诱导CTL^[11]。但是，近来的研究发现只有部分GRP94片段可以与多肽相结合，并且只有部分的GRP94绑定蛋白支持以上观点^[12]。有学者利用这个理论，通过放射或基因手段影响肿瘤细胞，使其过表达一种作为疫苗的分泌形式的GRP94，达到治疗目的^[13-14]。Chen等^[15]研究发现，在小鼠中GRP94被敲除后，使细胞黏附中断，刺激肝起源细胞增殖，进而促进肝肿瘤的发生，推测GRP94在肝癌中起到保护作用。因此GRP94在肝癌中的作用有待于进一步探讨。Langer等^[16]证明GRP94 参与了食管腺癌的发生。GRP94在某些前列腺癌组织中表达高于正常组织，可以选择性的抑制肿瘤细胞的GRP94表达以达到基因治疗目的^[17]。Pan等^[18]研究证实在胰腺癌中，沉默GRP94的表达能促进胰腺癌细胞的凋亡。GRP94 还被证明与p185/erbB2 有关，形成GRP94-p185复合体，p185/erbB2通常表达于乳腺癌，并且预示预后较差^[19]。在大鼠食管腺癌和人类食管腺癌及贲门癌的研究中，GRP94显著升高^[20]。GRP94的研究证实其可以广泛应用于肿瘤化疗、免疫治疗和基因治疗。在其他方法(包括外科手术)不能很好解决肿瘤及其转移问题的现状下，GRP94的研究或许能为肿瘤防治带来一线曙光。

小干扰RNA技术具有高效性、高特异性，表达效果突破细胞界限、激发包括干扰素在内的多种非特异性抗肿瘤反应以及可以传递给子代等诸多优点^[21]，因此，理论上针对癌细胞特异的GRP94基因的小干扰RNA治疗具有更广阔的前景。RNAi的最主要的特点在于其作用的高度特异性，小干扰RNA 任何碱基改变都可能会显著降低封闭靶基因的效果。在利用载体表达的小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)来封闭人MCF-7细胞的CDHl基因的实验研究中^[22]，shRNA上仅一对碱基的突变就不能抑制CDHl基因的表达。高特异性的特点是由小干扰RNA 与目的RNA 特异性互补所保证的。Semizarov等^[23]的研究结果表明，针对同一作用区的不同小干扰RNA对目的基因施加影响后，目的基因表现出几乎相同的表达特征，可是针对不同作用区的小干扰RNA对目的基因表达的影响各不相同。而Jackson等^[24]和Chi等^[25]通过对特异小干扰RNA干扰后基因组的表达变化进行分析，同样证明了RNA干扰的高度特异性。RNA干扰具有高度特异性的特点决定了其成为鉴定基因功能^[26-27]，基因组分析^[28-29]，植物抗病毒研究^[30-31]，人类多种疾病治疗研究等的有力工具^[32-33]。

本实验中，将卵巢癌细胞HO-8910移植接种于裸鼠，成功建立了人卵巢癌细胞裸鼠移植模型。在接种5 d，可见裸鼠皮下均有肿瘤形成，且在接种14 d肿瘤直径达 7-10 mm。实验将构建的psiSTRIKE^TM/GRP94真核表达质粒通过转染试剂包裹后导入裸鼠瘤体内，将质粒有效转入癌组织并在癌细胞中表达。靶向GRP94 mRNA的小干扰RNA转染瘤组织后明显抑制移植瘤细胞的生长，移植瘤体积明显缩小，肿瘤细胞坏死明显，抑瘤率达65.1%。而非特异小干扰RNA转染组和生理盐水对照组细胞生长良好，坏死区少见。这进一步证实特异性小干扰RNA对移植瘤具有显著的治疗作用。经psiSTRIKE^TM/GRP94质粒治疗后，与非特异性小干扰RNA组和生理盐水对照组比较，特异性小干扰RNA组瘤体内GRP94 mRNA 和蛋白的表达显著下降，细胞生长缓慢，提示小干扰RNA抑制GRP94基因在调节DNA合成及细胞增生中可能起了重要作用。应用RNA干扰技术降低GRP94的表达，进而抑制肿瘤细胞生长可能是治疗恶性肿瘤的一个有效手段，但尚有待于进一步的研究。

小干扰RNA抑制卵巢癌模型裸鼠移植瘤葡萄糖调节蛋白94的表达及意义

Small interfering RNA inhibits glucose regulated protein 94 expression in transplantable models of human ovarian carcinoma in nude mice

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