人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增人脐带间充质干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.010

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (10): 1539-1546.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.010

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人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增人脐带间充质干细胞

李炳尧¹，武晓云²，吴岩¹

¹内蒙古医科大学组织胚胎学教研室，内蒙古自治区呼和浩特市 010059；²北京京蒙高科干细胞技术有限公司，北京市 100085

出版日期:2014-03-05 发布日期:2014-03-05
通讯作者: 吴岩，博士，教授，硕士生导师，内蒙古医科大学组织胚胎学教研室，内蒙古自治区呼和浩特市 010059
作者简介:李炳尧，男，1982年生，内蒙古自治区赤峰市人，汉族，内蒙古医科大学在读硕士，主治医师，主要从事间充质干细胞培养、临床应用研究。工作单位为赤峰学院第二附属医院。
基金资助:
内蒙古自治区干细胞科技创新团队资助项目(kjt0020947)

Large-scale expansion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in human platelet lysate as a substitute of fetal bovine serum

Li Bing-yao¹, Wu Xiao-yun², Wu Yan¹

¹Department of Histology and Embryology, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ² Beijing Jingmeng Stem Cell High-Tech Co., Ltd., Beijing 100085, China

Online:2014-03-05 Published:2014-03-05
Contact: Wu Yan, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Histology and Embryology, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Li Bing-yao, Studying for master’s degree, Attending physician, Department of Histology and Embryology, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
Stem Cell Technology Innovation Team Funded Projects in Inner Mongolia Autonomous Region, No. kjt0020947

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前国内外大多数实验仍采用经典的培养基和胎牛血清进行脐带间充质干细胞培养，血清培养潜在的不安全因素限制了未来临床应用的可行性。
目的：以人血小板裂解液替代胎牛血清培养、鉴定人间充质干细胞，以期进一步应用于临床低密度扩增人间充质干细胞。
方法：人血小板裂解液通过反复冻融、离心、过滤、浓缩等方法制备。以IMDM为基础培养基，添加5%浓缩血小板裂解液作为实验组培养基；以添加体积分数10%胎牛血清为对照组培养基。采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞，以3 000/cm²的浓度进行传代培养，待细胞扩增至P5代后，进行细胞形态与直径、免疫表型、成骨成脂分化、克隆形成率等细胞生物学特性检测，并比较两者之间的差别。
结果与结论：人血小板裂解液扩增的脐带间充质干细胞形态细长，有更高的细胞累积群倍数；克隆形成检测结果显示两者形成的克隆效率差异无显著性意义，流式细胞术检测结果显示两者有相似的细胞表型，体外诱导分化显示两者都具有成骨、成脂分化能力，但人血小板裂解液扩增的间充质干细胞成骨分化能力更强。提示人血小板裂解液可以取代胎牛血清用于临床低密度扩增人间充质干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 培养, 间充质干细胞, 血小板裂解液, 细胞培养, 成骨分化, 成脂分化

Abstract:

BACKGROUND: Classic media and fetal bovine serum are commonly used in the culture of umbilical cord mesenchymal stem cells, but the potential risk of serum culture limits its clinical application.
OBJECTIVE: To use human platelet lysate alternative to fetal bovine serum for large-scale production of mesenchymal stem cells for therapeutic applications.
METHODS: Human platelet lysate was prepared by repeated freezing and thawing, centrifugation, filtration, and concentration. Human umbilical cord mesenchymal stem cells were cultured in Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium containing 5% concentrated platelet lysate (experimental group) or 10% fetal bovine serum (control group). After separation and enzymatic digestion, human umbilical cord mesenchymal stem cells were subcultured at a concentration of 3 000/cm² up to the fifth generation. Then, cell morphology and diameter, immune phenotype, osteogenic and adipogenic differentiation, and cloning efficiency were detected and compared between two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: Human umbilical cord mesenchymal stem cells cultivated in human platelet lysate-supplemented media showed a smaller size and more elongated morphology than those in fetal bovine serum-supplemented media. Colony forming unit-fibroblast analyses further showed no significant differences in colony efficiency. Human umbilical cord mesenchymal stem cells cultivated in human platelet
lysate-supplemented media showed an increase of proliferation capacity; whereas, similar immunophenotypes remained in the two groups. In vitro assays revealed intact differentiation potential. Moreover, human umbilical cord mesenchymal stem cells cultivated in human platelet lysate-supplemented media showed a significantly higher capacity to differentiate towards osteocytes, indicating human platelet lysate is an alternative to fetal bovine serum for low-density production of mesenchymal stem cells for therapeutic applications.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, culture media, adipogenesis, actihaemyl

中图分类号:

R394.2

李炳尧，武晓云，吴岩. 人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增人脐带间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1539-1546.

Li Bing-yao, Wu Xiao-yun, Wu Yan. Large-scale expansion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in human platelet lysate as a substitute of fetal bovine serum[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1539-1546.

图/表（结果） 5

2.1 细胞形态观察 经酶消化后将脐带源有核细胞分别接种于含有人血小板裂解液无血清培养基和胎牛血清培养基进行细胞培养，人血小板裂解液无血清培养组细胞于12 h内可见少量细胞贴壁。在倒置显微镜下可见贴壁细胞单个散在或成簇生长，贴壁后增长速度较快，细胞体积增大，长梭形，多边形，细胞集落明显增大、增多。培养1周后细胞达80%-90% 融合，传代后呈成为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长。与体积分数10%胎牛血清培养基接种的间充质干细胞的细胞形态相比，二者形态相似(图1)。

2.2 细胞直径比较 流式细胞仪通过对细胞的前向角散射信号比较2种培养基扩增脐带间充质干细胞的细胞直径，结果显示人血小板裂解液培养基扩增的脐带间充质干细胞的细胞直径小于胎牛血清培养基扩增的脐带间充质干细胞(n=5，t=3.821，P < 0.05，图1)。

2.3 成纤维细胞克隆形成单位检测 成纤维细胞克隆形成单位检测显示人血小板裂解液无血清培养基的成纤维细胞克隆形成单位频率为(81.5±10.5)/10³，与胎牛血清培养基的成纤维细胞克隆形成单位频率(73.5±7.5)/10³相比，差异无显著性意义(n=5，t =1.292，P > 0.05，图2)。

2.4 细胞增殖能力检测结果 计算P1-P5代脐带间充质干细胞的细胞增殖能力检测，结果显示人血小板裂解液无血清培养基扩增的P1-P5代脐带间充质干细胞的细胞增殖能力检测均高于胎牛血清培养基扩增的脐带间充干细胞，但P1-P3代，两者之间差异无显著性意义(t=1.016，P > 0.05；t=1.094，P > 0.05；t=1.576，P > 0.05)；P4-P5代两者比较差异有显著性意义，且P5代差异有非常显著性意义(t=2.441，P < 0.05；t=6.121，P < 0.01，图3)。

2.5 细胞表型检测结果 流式细胞术检测结果显示，人血小板裂解液无血清培养基和对照组胎牛血清培养基扩增的脐带间充干细胞都阳性表达CD13、CD29、CD90、CD105和HLA-ABC，阴性表达CD14、CD19、CD45、CD34和HLA-DR(图4)。

2.6 细胞分化能力检测结果

成骨诱导分化鉴定：人血小板裂解液无血清培养基扩增P5代脐带间充干细胞经成骨诱导3周后，茜素红染色结果结节呈橘红色，边界清晰，提示有矿化基质沉积，染色结果显示血小板裂解液无血清培养基扩增脐带间充干细胞的矿化结节(橘红色颗粒)数量高于胎牛血清培养基扩增的脐带间充质干细胞(图5A，B)。

实时定量PCR结果显示血小板裂解液无血清培养基扩增脐带间充干细胞的成骨分化特异性基因RUNX-2和碱性磷酸酶表达量均高于胎牛血清培养基扩增的脐带间充干细胞，差异有显著性意义(t =4.371，P < 0.05；t=3.358，P < 0.05，图5C)。

成脂诱导分化鉴定：人血小板裂解液无血清培养基扩增P5代脐带间充干细胞经成脂诱导定向诱导培养后1周，小部分细胞内已出现微小明亮的脂滴。随着诱导时间的延长，出现脂滴的细胞增多，细胞由梭形变成椭圆形或多角形。

培养3周后，油红O染色后镜下观察见大量的脂质沉积(图5D，E)，提示细胞已分化成脂肪细胞，染色结果显示人血小板裂解液无血清培养基扩增脐带间充干细胞脂质沉积(红色颗粒)数量低于胎牛血清培养基扩增的脐带间充干细胞，实时定量PCR结果显示人血小板裂解液无血清培养基扩增脐带间充干细胞成脂分化特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ和脂蛋白脂肪酶表达量均低于胎牛血清培养基扩增的脐带间充干细胞，但两者之间比较差异无显著性意义(t=1.141，P > 0.05；t=1.256， P > 0.05，图5F)。

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引言

间充质干细胞是一类具有自我更新、多向分化能力的干细胞，其作为组织工程及组织再生领域极具应用前景的种子细胞来源，受到了越来越广泛的关注^[1] 。间充质干细胞因其免疫原性低，具有炎症趋化、免疫调节、易于转染外源基因、生物安全性较高等优点成为实施细胞治疗的理想细胞，有着广阔的临床应用前景，已成为当今干细胞治疗移植和组织再生工程研究的热点^[2-3] 。
间充质干细胞易于体外分离和扩增，添加一定浓度的胎牛血清培养基被广泛用于间充质干细胞的培养和扩增，但有导致朊病毒或者某些未知动物传染病传播风险，及培养过程中动物源蛋白或肽对间充质干细胞免疫排斥的可能，甚至输注后亦无明显疗效，且市场上部分胎牛血清都含有病毒，因此如何解决体外分离的间充质干细胞非分化性增殖能力低，保证其多向分化及增殖能力尤为关键^[4-8] 。不断探寻和改进间充质干细胞的培养体系，是深入研究和利用间充质干细胞的必要前提，目前对间充质干细胞的培养体系进行了很多研究，包括成人血清、血小板衍生物、血小板裂解液、凝血酶激活血小板释放因子、脐血清等^[9-14] ，血清或血清衍生物来替代培养体系成为新的热点。
脐带是孕妇与胎儿之间的物质交通支，也是分娩后的废弃物，收集脐带对产妇和胎儿均不造成伤害，取材也不受伦理学的困扰。另外从胚胎发育而言，脐带的免疫原性低，可以降低或避免免疫排斥。
因此，实验以机采血小板为原料，通过冻融裂解法来制备人血小板裂解液，在脐带间充质干细胞的体外扩增过程中代替胎牛血清，并对脐带间充质干细胞的增殖及基本的生物学特性进行研究。以期为脐带间充质干细胞的临床应用和实验研究，提供大量、快速、高效获得间充质干细胞的新途径和新方法，为脐带间充质干细胞的临床应用和科研试验奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学水平，体外对比观察实验。

时间及地点：于2012年9月至2013年9月在北京京蒙高科干细胞实验室完成。

材料：北京市血液中心采集新鲜分离的浓缩血小板。脐带取自解放军武警总医院健康足月剖宫产孕妇，年龄22-30岁，术前签署知情同意书。

方法：

人血小板裂解液制备：收集北京市血液中心新鲜采集、经检测达到临床用血标准的多人份机采血小板，筛选出血小板浓度为1.0×10¹² L^-¹。

将所获样本置-80 ℃冰箱过夜后，次日移至37 ℃水浴至融，使血小板裂解并释放生长因子，此冻融裂解过程重复5次将浓缩。于4 ℃以3 500 r/min离心30 min，取上清液，0.22 μm过滤，以5%的浓度添加到含10 U/mL肝素钠的IMDM培养基中获得完全培养基。

人脐带间充质干细胞的原代分离与传代培养：参照Wu等^[15]的方法，脐带取自健康足月剖宫产孕妇，术前签署知情同意书，用含15 mmol/L柠檬酸钠、100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素的150 mL无菌瓶运至实验室；将脐带剪成1.0-2.0 mm³小块，加入0.2%Ⅳ型胶原酶，37 ℃消化 30 min，加入0.125%胰酶0.02%EDTA，37 ℃消化30 min，然后加入适量血清终止胰酶消化，先后用100目及200目的滤网过滤，去除未消化的组织，过夜消化，离心，收集细胞。培养体系为含5%血小板裂解液无血清培养基和体积分数10%胎牛血清培养基，分别设为实验组及对照组，置于含体积分数5%CO₂的37 ℃孵箱中培养。2 d后换液，去除非贴壁细胞，以后每周换液2次。按2 000/cm²的浓度进行传代。对2种培养体系的第5代进行后续检测。

细胞直径检测：取P5代细胞，0.25%胰蛋白酶消化后将其制成细胞浓度为1.0×10⁹ L^-¹细胞悬液，经流式细胞仪检测，比较细胞直径的差别。

细胞克隆形成检测：将P5代脐带间充质干细胞制成的细胞悬液以1 000/孔的浓度接种至六孔板中，于含体积分数5%CO₂的37 ℃孵箱中培养5 d。第5天换液，以后每3 d换液1次。培养后第14天于25倍倒置显微镜下计数成纤维细胞克隆。成纤维样细胞> 50的细胞簇计为1个克隆。用 40 g/L多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色。计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数。

细胞增殖能力检测：将P1-P5代收获的脐带间充质干细胞进行细胞计数，然后计算每一代脐带间充干细胞的细胞群倍数。公式为：

PD表示细胞群倍数，N_h表示细胞的收获数，N_p表示细胞的起始数。细胞累积群倍数为这一代的细胞群倍数加上前一代脐带间充质干细胞的细胞群倍数。

细胞表型检测：光镜下观察细胞形态，流式细胞仪对培养细胞进行表型鉴定。

取人血小板裂解液和胎牛血清培养的P5代接近融合的脐带间充干细胞，用0.05%胰蛋白酶消化，计数后取1×10⁶个细胞，分装8管，每管加入10 μL荧光素标记的小鼠抗人抗CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD166及HLA-DR 单克隆抗体，同型对照管加入鼠IgG-FITC，IgG-PE，IgG-APC，IgG-PerCP，检测管分别加入鼠抗人抗体10 µL，另设2管为空白对照。室温避光反应30 min后，PBS洗涤2次，加入500 µL PBS混匀细胞。流式细胞仪收集数据，分析结果。

细胞分化检测：参照Kishimoto等^[16]方法，分别将人血小板裂解液和胎牛血清培养的P5代脐带间充质干细胞，接种于预铺了Ⅰ型鼠尾胶原的6孔板，每孔细胞数为1×10⁵。每孔分别加入含5%血小板裂解液和胎牛血清完全培养基，待细胞达到50%汇合替换成新的成骨诱导体系(为 DMEM 培养基添加体积分数10%胎牛血清、1 μmol/L 地塞米松、50 mgL 抗坏血酸、0.01 mol/L β-甘油磷酸钠)，对照组为添加体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基。每3 d全量换液。培养第3周，茜素红染色，显微镜下观察胞外钙基质沉积。

将人血小板裂解液和胎牛血清组培养的P5代脐带间充质干细胞，接种于预铺了Ⅰ型鼠尾胶原的6孔板，每孔细胞数为按1×10⁵/孔。每孔分别加入含5%血小板裂解液和胎牛血清完全培养基，待细胞达到80%汇合替换成新的成骨诱导体系(DMEM添加体积分数10%胎牛血清、10 mg/L胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、0.1 mmol/L吲哚美辛)，对照组为添加体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养基。每3 d全量换液。培养第3周，茜素红染色，100 g/L多聚甲醛固定，饱和油红O染液染色，显微镜下观察胞内着色脂滴。

RNA的提取和实时定量PCR检测：分别提取脐带间充质干细胞分化前和分化后细胞总RNA，取1 μg总RNA反转录为cDNA作为实时定量PCR的模板。实时定量PCR检测分化后特异性基因的表达，用β-actin作为内参，所使用引物序列如表1所示。

所有样本的结果以β-actin表达做相对定量分析。数据分析采用△△Ct方法，相对表达量= 2^-^△△^Ct = 2^-⁽^△^Ct^实验组^-^△^Ct^对照组⁾= 2^-^[(^△^Ct^实验组^-^△^Ct^内参⁾^-⁽^△^Ct^对照组^-^△^Ct^内参^)]，数据取3次重复的平均值。

主要观察指标： ①倒置相差显微镜下观察脐带间充质干细胞的形态学变化，流式细胞仪进行细胞表面抗原鉴定。②成纤维细胞克隆形成单位检测成纤维细胞克隆形成。③检测成骨诱导后茜素红染色结果，成脂诱导油红O染色结果。

统计学分析：由第一作者将全部有效数据用Excel 2007工作表建立数据库，实验数据均以x(_)±s表示。用SPSS 17.0软件分析，结果分别进行组间独立t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

现阶段发现脐带来源干细胞来源广泛、便于采集、无异体排斥等优点，是一种新兴的种子细胞^[17-23] ，近年来，国内外学者对人脐带间充质干细胞进行研究并取得了一定成果。脐带间充质干细胞有望取代骨髓间充质干细胞成为组织工程更好的研究对象，脐带间充质干细胞成纤维细胞克隆形成单位培养含量要高于骨髓间充质干细胞^[24-25]。人体细胞治疗所需的细胞数量为1×10⁶/kg，一个50 kg的成人所需输注的细胞量为5×10⁷，但脐带中间充质干细胞含量也较低，每10⁴-10⁵单个核细胞中大约含有1个间充质干细胞^[26] ，故脐带间充质干细胞用于临床治疗时必须经过体外培养扩增才能达到足够的细胞量。
本实验以机采血小板为原料，通过冻融裂解法来制备人血小板裂解液，获得人血小板裂解液，制备过程中未添加其他异源成分，如凝血酶、CaCl₂等激活剂，血小板裂解后不仅释放并保留了存在于血小板内部的生长因子，而且去除了细胞结构并降低了免疫原性。目前研究证实，血小板裂含有多种细胞因子，如表皮生长因子、血小板衍生生长因子AB、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、转化生长因子β1等^[27-29] ，实验研究间充质干细胞的体外扩增培养有赖于细胞因子表皮生长因子、血小板衍生生长因子AB、碱性成纤维细胞生长因子等细胞因子的调节^[30-31] ，这些因子对间充质干细胞的增殖有促进作用。目前国内外已有研究将人血小板裂解液用于体外培养骨髓来源间充质干细胞^[32-33] ，与动物血清相比血小板裂解液培养的骨髓源间充质干细胞的细胞形态，免疫表型，分化能力等基本生物学特性没有影响^[34-35] ，本实验在通过对人血小板裂解液无血清培养基与胎牛血清培养体系下的脐带间充质干细胞的生物学特性进行比较，为进一步构建组织工程研究提供了可利用的条件。
初期阶段，实验设计将人血小板裂解液分别以终浓度2%，5%，10%添加到基础培养基中，采用含有体积分数10%胎牛血清的完全培养基为对照组；实验重复3次，以原代细胞的贴比率、细胞形态与直径、传代细胞增殖能力、特异性细胞表型表达率等生物学特性作为观察指标，比较各组培养基体外培养与扩增脐带间充质干细胞之间的差别，并以此为依据优选出最佳的添加浓度。3次实验结果，各实验组别间细胞形态无差别，与对照组比较更显细小，折光性更好；原代细胞贴壁率方面，以5%和10%为添加浓度的培养基稍优于2%添加组，5%添加组、10%添加组与对照组之间差异并无显著性意义；传代细胞增值能力的比较结果显示，2%添加组细胞无明显增殖，5%添加组、10%添加组对细胞体外增殖能力的影响要优于对照组，但5%添加组与10%添加组之间差异并无显著性意义。流式技术检测细胞表面表型表达水平，5%添加组、10%添加组与对照组之间无明显差别。鉴于此结果，以5%、10%为添加浓度均可用于体外脐带间充质干细胞的培养与扩增，两者之间以及与对照组比较并无明显差别；对于后期阶段的实验设计，作者优选将人血小板裂解液以5%的添加浓度作为实验对象，更深入的研究此培养基对脐带间充质干细胞体外培养与大规模扩增的可行性。
而在本次的实验过程及结果中亦表明，在细胞形态方面，5%添加浓度的人血小板裂解液培养基扩增的脐带间充质干细胞的细胞形态较胎牛血清更显细长，折光性更好，同时流式细胞仪检测结果也显示人血小板裂解液扩增的脐带间充干细胞的细胞直径要小于胎牛血清培养基扩增的脐带间充质干细胞；在此前的报道中也有实验证实过人血小板裂解液扩增的骨髓间充质干细胞的细胞直径小于血清扩增的间充质干细胞^[34，36-37] 。而直径更小的优点是可增加单位面积的间充质干细胞的数量，减少细胞培养耗材的使用量，节省培养成本，也有研究表明直径小的细胞更有利于细胞进入人体后通过各种屏障；通过收集P1-P5脐带间充质干细胞，并计算各代细胞的细胞增殖能力，结果亦显示对于P1-P3代细胞，人血小板裂解液无血清培养基与胎牛血清培养基对细胞增殖能力的影响无显著差别，但P4、P5代细胞的细胞增殖能力检测结果表明，人血小板裂解液无血清培养基有明显的优势用于体外脐带间充质干细胞的大量扩增，这可能与人血小板裂解液富含多种生物活性因子有关，而生物活性因子的存在更有利于体内早期组织的修复。因此全面了解人血小板裂解液对人脐带间充质干细胞的生物学效应，将有助于对组织修复过程中生长因子综合作用的模式或机制的理解，可为将来在体内应用或体外组织工程学框架下构建新型修复材料提供前期探索^[38-49]，体外诱导分化结果同时也显示人血小板裂解液扩增的脐带间充干细胞的成骨分化能力更强，这提示血小板裂解液扩增的脐带间充干细胞可用于骨组织损伤的修复中。
克隆形成率检方面，两者的克隆形成效率差异无显著性意义；且细胞表面特异性表型表达检测两者有相似的细胞表型，两者的P5代细胞均表达黏附分子CD29、CD90，表达CD13，CD105抗原，不表达CD45，CD34等造血细胞相关抗原，也不表达CD19和CD14等抗原，实验组及对照组2种培养体系培养的脐带间充干细胞的上述抗原表达性质无明显差异。
总之，通过临床规模扩增脐带间充质干细胞，对比胎牛血清扩增的间充质干细胞的生物学特性，可以得出结论：人血小板裂解液培养基可以满足脐带间充质干细胞体外培养与扩增的需求，而且较于胎牛血清培养基，人血小板裂解液培养基有明显的优势用于大规模扩增脐带间充干细胞。

人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增人脐带间充质干细胞

Large-scale expansion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in human platelet lysate as a substitute of fetal bovine serum

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