脂肪间充质干细胞对J774.1细胞的免疫调控

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.009

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (10): 1532-1538.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.009

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脂肪间充质干细胞对J774.1细胞的免疫调控

白力¹，张伟¹，庞春艳¹，魏斐菲²，王永福¹

¹包头医学院第一附属医院风湿免疫研究所，内蒙古自治区包头市 014000；²包头医学院，内蒙古自治区包头市 014000

出版日期:2014-03-05 发布日期:2014-03-05
通讯作者: 王永福，教授，主任医师，博士，硕士生导师，享受国务院政府特殊津贴专家，包头医学院第一附属医院风湿免疫研究所，内蒙古自治区包头市 014000
作者简介:白力，男，1986年生，内蒙古自治区包头市人，汉族，助教，主要从事脂肪间充质干细胞和表观遗传学方面的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81360464)，项目名称：去乙酰化酶抑剂VPA对脂肪间充质干细胞免疫调控能力的影响；内蒙古包头医学院自治区重大基础研究开放课题；教育部“春晖计划”项目(Z2007-1-01019)；内蒙古青年科技英才支持计划，项目名称：脂肪间充质干细胞对自身免疫性疾病的基础研究工作；内蒙教育厅重点项目(NJZZ12216)，项目名称：脂肪间充质干细胞诱导分化的成骨细胞治疗骨质疏松大鼠的实验研究

Immunoregulation role of adipose mesenchymal stem cells in J774.1 cells

Bai Li¹, Zhang Wei¹, Pang Chun-yan¹, Wei Fei-fei², Wang Yong-fu¹

¹Institute of Rheumatology, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014000, Inner Mongolia Autonomous Region, China;² Baotou Medical College, Baotou 014000, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Online:2014-03-05 Published:2014-03-05
Contact: Wang Yong-fu, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Institute of Rheumatology, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014000, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Bai Li, Assistant teacher, Institute of Rheumatology, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014000, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360464; the Major Basic Research of Inner Mongolia Autonomous Region in Baotou Medical College; “Chunhui Plan” of the Ministry of Education, No. Z2007-1-01019; the Young Talent Supporting Plan of Inner Mongolia Autonomous Region; the Key Program of the Educational Bureau of Inner Mongolia Autonomous Region, No. NJZZ12216

摘要/Abstract

摘要：

背景：近期研究发现脂肪间充质干细胞针对T细胞、B细胞和树突状细胞均有抑制免疫反应的能力，但对于其是否可以对巨噬细胞起到相应的免疫调控能力还不清楚。
目的：观察脂肪间充质干细胞与J774.1细胞共培养后白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达。
方法：将脂肪间充质干细胞按照2×10⁷/孔分别接种于transwell的上层小室和24孔板中，再利用含1 mg/L脂多糖的培养液重悬J774.1细胞，将J774.1细胞接种到含脂肪间充质干细胞的transwell下层小室和24孔板中，同时设立未激活J774.1细胞阴性对照组和脂多糖激活J774.1阳性对照组。培养48 h收集细胞样，提取RNA样本，荧光定量PCR法检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA 水平。
结果与结论：相对于单纯脂多糖激活的阳性对照组J774.1细胞，脂肪间充质干细胞与J774.1细胞的接触型混合培养可以明显降低J774.1细胞的白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达量，而非接触共培养组中，只有白细胞介素6 mRNA水平发生了明显的降低。以上结果表明脂肪间充质干细胞具有抑制脂多糖激活J774.1细胞的免疫反应的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 脂肪间充质干细胞, J774.1细胞, 免疫调控, 混合培养, 荧光定量PCR, 脂多糖, Transwell, 巨噬细胞, 免疫反应, 细胞因子, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have found that adipose mesenchymal stem cells can inhibit immune responses of T cells, B cells and dendritic cells. But it is unclear whether adipose mesenchymal stem cells are able to regulate the immune responses of macrophages.
OBJECTIVE: To observe the expression of interleukin-6 and tumor necrosis factor α in J774.1 cells co-cultured with adipose mesenchymal stem cells co-cultured.
METHODS: Adipose mesenchymal stem cells at a density of 2×10⁷ per well were inoculated into the upper chamber of the transwell and 24-well plates. Then, J774.1 cells were suspended with cell culture medium containing 1 mg/L lipopolysaccharide and planted into the lower chamber of the transwell and 24-well plates containing adipose mesenchymal stem cells as co-culture group. Meanwhile, inactive J774.1 cells to lipopolysaccharide-activat J774.1 cells served as negative and positive control groups, respectively. After 48 hours, the J774.1 cells were collected to extract the RNA samples. Then, mRNA expressions of interleukin-6 and tumor necrosis factor α were measured by real-time quantitative PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the positive control group, direct-contact co-culture of
adipose mesenchymal stem cells and J774.1 cells significantly reduced expressions of interleukin-6 and tumor necrosis factor α in J774.1 cells, but non-contact co-culture only reduced interleukin-6 expression. These findings indicate that adipose mesenchymal stem cells can inhibit the immune response of J774.1 cells activated by lipopolysaccharide.

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Key words: adipose tissue, mesenchymal stem cells, macrophages, coculture techniques, immunomodulation, interleukin-6, tumor necrosis factor-alpha

中图分类号:

R394.2

白力，张伟，庞春艳，魏斐菲，王永福. 脂肪间充质干细胞对J774.1细胞的免疫调控[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1532-1538.

Bai Li, Zhang Wei, Pang Chun-yan, Wei Fei-fei, Wang Yong-fu. Immunoregulation role of adipose mesenchymal stem cells in J774.1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1532-1538.

图/表（结果） 5

2.1 细胞形态学观察 SD大鼠间充质干细胞在接种培养后呈梭形，有很好的增殖能力，在接种后的第3天就可以达到90%的汇合度，并呈漩涡状生长(图1A)。J774.1小鼠巨噬细胞在接种后呈离散状生长，且贴壁性较差，有很好的折光度，增殖能力很强(图1B)。在将脂肪间充质干细胞与J774.1细胞共培养生长后可以发现巨噬细胞的黏附能力增强且不易离散，离散细胞减少(图1C)。

2.2 流式鉴定结果 将脂肪间充质干细胞培养至第3代时进行细胞表面标记物的流式鉴定，结果为CD90⁺\CD44⁺\ CD31^-\CD45^-，符合国际上对脂肪间充质干细胞的流式表面标记物的认定(图2)。

2.3 诱导分化鉴定

成脂诱导分化：将第4代脂肪间充质干细胞(图3A)进行成脂诱导后3 d后可见明显增多的透明的脂滴，在第7天时，脂滴大量出现，用油红O染色成亮红色，见图3B。

成骨诱导分化：将第4代脂肪间充质干细胞进行成骨分化时细胞局部出现聚集现象，7 d 后可以观察到晶莹类似钙结节的物质出现，碱性磷酸酶染色成深紫色，在诱导21 d时细胞周围有明显钙沉积后进行茜素红染色，可见红色的钙结节(图3C-D)。

2.4 共培养后J774.1细胞白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的mRNA表达水平 在进行了接触型共培养和非接触共培养后，脂肪间充质干细胞均可降低脂多糖激活后J774.1细胞的炎性因子白细胞介素6的分泌。但是相对接触培养，利用transwell进行的非接触型共培养降低了脂肪间充质干细胞对J774.1细胞的白细胞介素6的分泌抑制作用，且相对于接触型共培养，这种差异是极其显著的。另一方面，在检测肿瘤坏死因子α的分泌时，发现只有在接触型共培养时，脂肪间充质干细胞才能表现出对脂多糖激活后J774.1细胞的炎性因子肿瘤坏死因子α分泌的显著抑制作用，当利用transwell进行的非接触型共培养时，虽然也出现降低了脂肪间充质干细胞对J774.1细胞的肿瘤坏死因子α的分泌抑制作用，但是相对于脂多糖激活J774.1细胞的对照组，这种差异并不显著。具体结果见图4和表4。

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引言

间充质干细胞是一类具有多潜能性的干细胞^[1] ，按照主要来源可以分为骨髓间充质干细胞、脂肪间充干细胞、脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、造血干细胞等。骨髓间充质干细胞是目前应用较多的种子细胞，但骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；移植给异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤，这都限制了骨髓间充质干细胞临床应用。而脂肪间充质干细胞由于其取材的便捷性以及快速扩增的能力，已经被越来越多的研究者所重视。
近期的研究发现脂肪间充质干细胞在组织器官修复和免疫调节方面有着不错的应用前景^[2] 。脂肪间充质干细胞可以针对多种免疫细胞发挥作用，其中包括通过接触抑制T淋巴细胞的增殖，并抑制由T细胞介导的免疫应答反应^[3-4] ，提高调节性T淋巴细胞的百分比，而调节性T淋巴细胞可以通过分泌γ-干扰素，参与抑制免疫应答反应^[5] 。在自体和异体移植中都可以有效地抑制T细胞的体外增殖过程。进一步的研究发现骨髓间充质干细胞可以将B细胞抑制在G₀/G₁细胞期，但是并不诱导B细胞的凋亡。分析这种抑制机制发现骨髓间充质干细胞可以抑制B细胞的IgM，IgG和IgA分泌并能下调一系列的趋化因子例如CXCL12、CXCR4配体、CXCL13和CXCR5配体^[6] 。
虽然间充质干细胞针对免疫细胞的免疫调控性已经得到了广泛的认同，但是对其调控的具体机制却知之甚少，尤其是在研究脂肪间充质干细胞对巨噬细胞影响和作用机制方面。本实验探讨大鼠脂肪间充质干细胞与单核巨噬细胞J774.1共培养后，对巨噬细胞的影响及作用机制的分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察及机制分析实验。

时间及地点：实验于2012年5月至2013年8月在包头医学院第一附属医院风湿免疫研究所完成。

材料：

实验动物及细胞株：SPF级6-8周龄雌性SD大鼠10只，体质量180-220 g，实验过程中对动物的处理符合包头医学院第一附属医院的医学伦理标准。J774.1细胞购置于上海轩研生物科技有限公司。

实验方法：

SD大鼠脂肪间充质干细胞的分离纯化：取6-8周SD大鼠，脱颈处死，用体积分数为75%乙醇消毒，取腹股沟部及肾下1 g脂肪组织。用含高浓度抗生素血清培养基溶液清洗3次，去除肉眼可见的血管及其他组织，用PBS(-)反复冲洗3次。用剪刀将脂肪组织剪成大约1 mm³小块，置0.2%Ⅰ型胶原酶中，37 ℃消化30 min。用100 mm细胞筛过滤以除去组织块，用PBS(-)洗涤2次5 min，260×g离心，以完全除去胶原酶。再用0.83% NH₄Cl重悬细胞沉淀物并孵育以除去剩余的血细胞，用PBS(-)洗涤2次5 min，260×g离心，以完全除去0.83% NH₄Cl。最后用DMEM/F12+体积分数为5%胎牛血清+1%双抗培养基在培养箱中培养，4 h后换液以除去未贴壁的细胞，连续培养7 d后传代到第2代冻存。

流式鉴定第3代细胞表面标记物：取第3代细胞消化计数后分装在5个Eppendof管中，调整细胞浓度为1×10⁹L^-¹的单细胞悬液。第1管为阴性对照，加入异硫氰酸荧光素标记的IgGlmAb(IgGl-FITC)和藻红蛋白标记的IgGlmAb (IgG1-PE)各5 μL，其余4管分别加入CD45-FITC和CD90-FITC各1 μL，CD29-PE 25 μL，CD34-PE 20 μL，避光、4 ℃孵育30 min。用细胞染色缓冲液洗涤2遍，加入 250 μL细胞染色缓冲液和40 g/L多聚甲醛250 μL固定，流式细胞术检测。

成骨成脂诱导： ①待第4代细胞汇合度为70%后，换为成骨诱导培养基，持续培养3周。诱导培养基成分：含高糖的DMEM +50 mg/L ascorbic acid +100 nmol/L dexamethasone+10 mmol/L β-glycerol phosphate +体积分数为10%胎牛血清。②待第4代细胞汇合度为70%后，换为成脂诱导培养基，用诱导培养基持续培养7 d。诱导培养基成分：含高糖的DMEM +10 μmol/L地塞米松+200 μmol/L indomethacin+10 μmol/L insulin +10 mg/L胰岛素+体积分数为15%胎牛血清。

成脂成骨鉴定： ①油红O染色鉴定成脂诱导：先将油红O 0.5 g 溶于100 mL异丙醇配成浓储液，再将浓储液用蒸馏水按3∶2稀释过滤(通过定性滤纸过滤)后为油红O工作液，吸弃培养液后加入40 g/L多聚甲醛5 min。吸弃固定液，加入油红O工作液染色15 min后水洗1次镜检观察。②碱性磷酸酶染色鉴定早期成骨分化：取诱导到7 d的脂肪间充质干细胞，用PBS(-)洗涤细胞2次，每次1 min，再用 40 g/L多聚甲醛固定30 min。按照说明书配置碱性磷酸酶显色液后，用PBS(-)洗涤细胞2次，每次1 min，随后加入碱性磷酸酶染色液，染色24 h，弃染色液，用PBS(-)洗涤细胞2次，每次1 min。镜下观察，统计阳性率。③茜素红染色鉴定晚期成骨分化：1%茜素红的配制：先配制1%的Tris-Cl溶液100 mL，用0.1%的HCl调pH值为4.2，再加入 1 g的茜素红混匀，4 ℃保存。染色方法时，取诱导到21 d的脂肪间充质干细胞，先弃除细胞培养液上清，用蒸馏水洗2至3次，加入40 g/L的多聚甲醛，固定30 min，弃除固定液，用蒸馏水洗2至3次。再加入1%的茜素红染色液，37 ℃温箱孵育30 min。最后弃除茜素红染色液，用蒸馏水洗2至3次，镜下观察。

混合共培养： ①接触型共培养：首先将第3代次脂肪间充质干细胞培养在60 mm培养皿中，直至汇合度为90%后，用DMEM+体积分数为10%胎牛血清培养液将脂肪间充质干细胞以2×10⁷/孔接种于24孔板中。其次用含1 mg/L脂多糖的DMEM+体积分数为10%胎牛血清培养液重悬J774.1细胞，按照2×10⁷/孔接种于含脂肪间充质干细胞的24孔板中，连续培养48 h收集细胞。②非接触型共培养：首先将第3代脂肪间充质干细胞培养在60 mm培养皿中，直至汇合度为90%后，用DMEM+体积分数为10%胎牛血清培养液将脂肪间充质干细胞以2×10⁷/孔接种于transwell板的上室小室中，再用含1 mg/L脂多糖的DMEM+体积分数为10%胎牛血清培养液重悬J774.1细胞，按照2×10⁷/孔接种于transwell板的下室小室中。待细胞共培养48 h后用镊子取出上室，收集下室中的细胞。

J774.1细胞的总RNA提取及cDNA的反转录：弃除培养液，用PBS清洗1次。每6 mm²生长的培养细胞中加入 1 mL的RNAiso Plus，轻微晃动，确保使裂解液均匀分布于细胞表面，均匀吹打后，将内含细胞的裂解液转移至离心管中，室温静置 5 min后，每个样本加入0.2 mL氯仿，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。室温静置5 min，12 000×g 4 ℃离心15 min后，液体分层，取最上层无色上清于新的EP管中，加入0.2 mL异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10 min后12 000×g 4 ℃离心 10 min。小心弃去上清，加入1 mL体积分数为75%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7 500×g 4 ℃离心5 min后小心弃去上清。打开离心管盖，室温干燥沉淀10 min。加入50 μL的RNase-free水溶解沉淀。取6.5 μL总RNA移入新的EP管中再分别加入5×PrimeScript Buffer 2 μL，1×PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL。配置好反应液后37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s得到cDNA后4 ℃保存。

荧光定量检测J774.1细胞的mRNA水平：将得到的CDNA按如下体系进行配置，引物由上海生工合成，具体引物序列如下：

白细胞介素6F：GTT CTC TGG GAA ATC GTG GA；

白细胞介素6R：TGT ACT CCA GGT AGC TA。

肿瘤坏死因子αF：ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC；

肿瘤坏死因子αR：TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT。

GAPDH-F：TCA CTC AAG ATT GTC AGC AA；

GAPDH-R：AGA TCC ACG ACG GAC ACA TT。

表1-3为反转录的反应液的配制，以及反应条件以及qRT-PCR反应液配制。

在PCR反应中，设立未激活J774.1细胞阴性对照组和脂多糖激活J774.1阳性对照组。qRT-PCR由荧光定量PCR仪自动采集目的基因与内参基因的Ct值。各个基因的基因表达量根据公式计算。

实验组/对照组目的基因相对表达量ΔCt=Ct(实验组/对照组目的基因)-Ct(GAPDH)；

ΔΔCT= 实验组ΔCT-对照组ΔCT；

目的基因实验组和对照组组间的相对表达量(即实验组目的基因相对表达量相对于对照组的倍数)=2^-^ΔΔ^Ct。

主要观察指标：在接触性和非接触型以及对照共培养组中J774.1细胞的白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的mRNA变化水平。

统计学分析：采用GraphPad Prism 5，对荧光定量PCR结果进行组间的T test和one-way anova多组间方差分析，数据以x(_)±s表示，以P < 0.01为差异有显著性意义，P < 0.001为差异有非常显著性意义，P > 0.05为差异无显著性意义。

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讨论

近些年来，间充质干细胞具有的免疫调控能力在基础医学研究领域得到了越来越多的关注，很多研究者都证实了间充质干细胞是通过分泌白细胞介素10^[7] ，转化生长因子β、吲哚胺双加氧酶、肿瘤特异性糖蛋白6和前列腺素E2 实现其炎性抑制作用的^[8-11] 。正是由于间充质干细胞具有这种强烈的免疫调节功能，已经被用于检验是否可以用于对免疫功能紊乱性疾病的治疗，其中包括多发性硬化症、移植物抗宿主病以及糖尿病的治疗等^[12-20] 。更为重要的是，虽然间充质干细胞在治疗自体性免疫疾病等方面的作用已经得到了广泛的认同，但是在机制方面还是存在着很多未知的地方^[21] 。
目前经细胞水平的研究证实，间充质干细胞可以针对多种免疫相关细胞发生免疫调控作用，T细胞是适应性免疫应答的主要执行者，在针对T细胞的作用方面，间充质干细胞可以显著抑制由T细胞介导的免疫应答反应^[22-24] ，具体是通过抑制毒性T细胞的形成，增殖型抗原的表达，以及Th1细胞γ-干扰素的分泌和Th2 细胞白细胞介素2的分泌来达到抑制T细胞介导的免疫应答反应^[25] 。Corcione等^[26]的研究发现，将人间充质干细胞与外周血分离得到的B淋巴细胞进行混合培养，可以将B淋巴细胞阻滞在G₀/G₁期并抑制了B淋巴细胞IgM，IgG和IgA的分泌。另一方面人间充质干细胞通过下调B细胞CXCR4，CXCR5和CCR7的表达，进而影响B细胞的趋药性。但是人间充质干细胞并不能对B细胞的共刺激分子产生影响。这些结论都证明了间充质干细胞可以在由B淋巴细胞介导的免疫反应中，起到免疫调控的作用。
虽然间充质干细胞针对不同种免疫相关细胞的免疫调控作用已经被大家所熟知，但是间充质干细胞针对巨噬细胞的作用影响及机制都还尚未明确。所以将脂肪间充质干细胞与巨噬细胞进行了接触型共培养和非接触型共培养，结果发现在接触型共培养条件下，脂肪间充质干细胞与抑制了巨噬细胞的白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的mRNA表达水平。
白细胞介素6和肿瘤坏死因子α都是主要的炎性因子。其中白细胞介素6是一种具有多功能的细胞因子，它的高表达可以刺激免疫系统对损伤做出反应，并引起自身免疫性疾病的发生^[27] 。在癌症的发病过程中可以诱导M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，最终促进癌症的发病和转移^[28] 。肿瘤坏死因子α是细菌感染、组织损伤以及肿瘤细胞等多种刺激激活巨噬细胞进而产生的一种炎性因子。可溶性的肿瘤坏死因子α能诱导白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8等炎症细胞因子的产生, 在正常的机体防御中, 低浓度的可溶性肿瘤坏死因子α能保护机体免受细菌感染及肿瘤细胞的侵入，在体液免疫反应中起着重要的作用^[29] 。但可溶性肿瘤坏死因子α的过度表达, 也会导致白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8等炎症细胞因子的过度表达，进而引起一系列的炎性感染及自身免疫性疾病。
本实验中发现脂肪间充质干细胞与J774.1细胞共培养后可以抑制炎性因子白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达，这就间接的证实了脂肪间充质干细胞可以用于治疗免疫相关性疾病的结论^[30] 。但是在本实验中还存在一个现象就是利用transwell进行共培养后，发现脂肪间充质干细胞对J774.1细胞的免疫抑制作用减弱。这种非接触抑制减弱的现象已经在间充质干细胞与淋巴细胞的混合反应中得到了证实。Corcione等^[26]和Ozai等^[31]的研究发现将间充质干细胞与T细胞和B细胞进行共培养后接触共培养组对T、B细胞的增殖抑制作用明显强于利用transwell的非接触共培养组。并得出了可能是间充质干细胞释放的一些细胞因子抑制了T、B淋巴细胞的增殖。而单纯利用间充质干细胞培养液上清培养T、B细胞时，这种抑制效果不明显，这说明间充质干细胞的免疫抑制能力可能不是单方面依靠分泌可溶性的细胞因子来实现的，具体的调控方式尚不清楚。这种现象发生的可能的原因是，脂肪间充质干细胞是通过两种方式来抑制巨噬细胞炎性反应的发生，第一种是通过分泌一些细胞因子作用于巨噬细胞表面，进而起到抑制作用，另一种方式是通过细胞接触抑制巨噬细胞的炎性反应。至于间充质干细胞是如何通过细胞接触和分泌细胞因子来抑制巨噬细胞的免疫应答反应，这还需要后续的实验进行必要的研究。

脂肪间充质干细胞对J774.1细胞的免疫调控

Immunoregulation role of adipose mesenchymal stem cells in J774.1 cells

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