改进型颈动脉注射法递送新型基因运载体包裹绿色荧光示踪蛋白

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.020

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (12): 1926-1931.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.020

• 材料力学及表面改性 material mechanics and surface modification • 上一篇下一篇

改进型颈动脉注射法递送新型基因运载体包裹绿色荧光示踪蛋白

王珏¹，王竞男¹，邓宇斌¹，杨立群²

1中山大学附属第一医院转化医学中心，广东省广州市 510080
2中山大学化学与化学工程学院高分子研究所，广东省广州市 510275

修回日期:2014-02-12 出版日期:2014-03-19 发布日期:2014-03-19
通讯作者: 邓宇斌，教授，博士生导师，中山大学附属第一医院转化医学中心，广东省广州市 510080
作者简介:王珏，女，1988年生，江西省南昌市人，汉族，中山大学在读硕士，主要从事干细胞移植治疗神经损伤方面的研究。
基金资助:
广东省教育部产学研结合项目(2012B091100457)

Delivery of DMAPA-Amp wrapped green fluorescent protein by modified carotid injection

Wang Jue¹, Wang Jing-nan¹, Deng Yu-bin¹, Yang Li-qun²

1Research Center of Translational Medicine, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
2Institute of Polymer Science, School of Chemistry and Chemical Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, Guangdong Province, China

Revised:2014-02-12 Online:2014-03-19 Published:2014-03-19
Contact: Deng Yu-bin, Professor, Doctoral supervisor, Research Center of Translational Medicine, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Wang Jue, Studying for master’s degree, Research Center of Translational Medicine, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the Ministry of Education of Guangdong Province University-Industry Cooperation Project, No. 2012B091100457

摘要/Abstract

摘要：

背景：超支化支链淀粉衍生物作为非病毒基因载体具有低毒性、转染率好的特点，但如何高效递送其进入机体内使有治疗作用基因成功表达的方式仍在探索中。
目的：探讨包裹绿色荧光蛋白的新型基因运载载体经改进颈动脉注射法到达大鼠脑缺血损伤区的表达情况。
方法：取雄性SD大鼠制作大脑中动脉梗死模型，24 h后随机分为2组，对照组以尾静脉注射包裹绿色荧光蛋白的超支化支链淀粉衍生物，实验组以改进型颈内动脉注射包裹绿色荧光蛋白的超支化支链淀粉衍生物。7 d后处死大鼠，取出脑组织，qPCR和Western blot检测大鼠脑组织中绿色荧光蛋白的基因和蛋白水平，免疫荧光法观察脑组织冰冻切片中血管内壁附近绿色荧光蛋白的表达。
结果与结论：qPCR和Western blot检测结果均显示实验组大鼠脑组织中绿色荧光蛋白的表达量显著高于对照组(P < 0.05)，免疫荧光观察结果显示绿色荧光蛋白在实验组血管内壁附近的表达高于对照组。在SD大鼠大脑中动脉梗死模型中，相比尾静脉注射法，改进型颈动脉注射法可显著促进脑缺血损伤区的超支化支链淀粉衍生物及绿色荧光蛋白在脑组织中表达的量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 纳米材料, 基因运载载体, 支链淀粉衍生物, 颈动脉注射, 尾静脉注射, 绿色荧光蛋白, 基因转染, 脑卒中

Abstract:

BACKGROUND: Hyperbranched cationic amylopectin is a kind of nonviral gene vectors with low toxicity and good transfection efficiency. However, searching for more efficient methods to delivery it into the body and making the genes expressed are being explored.
OBJECTIVE: To study the expression of DMAPA-Amp wrapped green fluorescent protein (GFP) transferred by modified carotid injection into cerebral ischemic area.
METHODS: Male Sprague-Dawley rats subjected to middle cerebral artery infarction were randomly divided into two groups after 24 hours: experimental group (injected with GFP entrapped DMAPA-Amp via the internal carotid artery) and control group (injected with GFP entrapped DMAPA-Amp via the tail vein). These rats were put to death and their brain tissue was removed after 7 days. The expression of GFP was detected by quantitative PCR and western blot assay, and immunofluorescence staining was performed to detect the expression of GFP located near cerebrovascular endothelial cells by frozen section.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the expression of GFP was much higher in the experimental group detected by quantitative PCR and western blot (P < 0.05). Additionally, the expression of GFP located near cerebrovascular endothelial cells by frozen section was also higher than that in the control group. Modified carotid injection could significantly promote the expression of hyperbranched cationic amylopectin derivates and GFP in the brain tissue of Sprague-Dawley rats undergoing middle cerebral artery infarction compared with tail vein injection, which indicates DMAPA-Amp and modified carotid injection may cast new lights on the therapy for angiogenesis of ischemic stroke.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, carotid arteries, injections, intra-arterial, green fluorescent proteins, transfection

中图分类号:

R318

王珏，王竞男，邓宇斌，杨立群 . 改进型颈动脉注射法递送新型基因运载体包裹绿色荧光示踪蛋白[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(12): 1926-1931.

Wang Jue, Wang Jing-nan, Deng Yu-bin, Yang Li-qun. Delivery of DMAPA-Amp wrapped green fluorescent protein by modified carotid injection[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(12): 1926-1931.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 24只大鼠全部进入结果分析，无脱失。

2.2 超支化支链淀粉衍生物安全性的大体评价 将包裹有绿色荧光蛋白的超支化支链淀粉衍生物溶液以370 mg/L的浓度缓慢注入大脑中动脉梗死模型大鼠的颈内动脉，24 h后大鼠状态良好，除有脑梗死后的爬行时向右侧转圈及提尾倒立时右侧肢屈曲等特征外，超支化支链淀粉衍生物未对大鼠产生严重的不良反应，见图1D。

2.3 绿色荧光蛋白在脑组织内基因水平的对比 超支化支链淀粉衍生物处理7 d后，提取组织RNA，对照组大鼠的脑组织内有微弱的绿色荧光蛋白表达；实验组绿色荧光蛋白的表达量显著高于对照组(P < 0.05)，提示在SD大鼠大脑中动脉梗死时，颈动脉注射法能将更多携带有绿色荧光蛋白的超支化支链淀粉衍生物递送至脑组织内，见图2A。

2.4 绿色荧光蛋白在脑组织内蛋白水平的对比 大鼠大脑中动脉梗死模型在超支化支链淀粉衍生物处理7 d后，提取组织蛋白进行Western blot检测后可见，实验组大鼠脑组织内绿色荧光蛋白的蛋白表达量显著高于对照组(P < 0.05)，提示在大鼠的大脑中动脉梗死后，颈动脉注射法相较于尾静脉注射法而言，能使更多携带有绿色荧光蛋白的超支化支链淀粉衍生物进入脑组织，同时超支化支链淀粉衍生物进一步将绿色荧光蛋白转染入细胞，实现蛋白的表达，见图2B。

2.5 脑组织中绿色荧光蛋白的荧光定位 实验组注射溶液7 d后，大脑中动脉梗死大鼠的脑血管损伤区有明显的绿色荧光蛋白表达，绿色荧光定位于血管内壁附近；而对照组整个脑组织切片内几乎没有绿色荧光蛋白的表达，见图3。

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引言

缺血性脑卒中又称脑梗死，是指局部脑组织因血液循环障碍，缺血、缺氧而发生的软化坏死，它导致脑损伤的机制十分复杂，包括细胞凋亡、炎症反应、血管内皮损伤等各个方面^[1-3]。恢复缺血脑组织的供血供氧，促进神经功能的恢复是缺血性脑卒中一直以来的治疗目标，但目前常用的治疗方法，如溶栓药、抗凝药、氧自由基清除药等存在显著的治疗缺陷，即治疗时间窗比较狭窄，多数存在明显的外排作用，会产生耐药性，对长期的神经功能恢复并不理想^[4-6]。寻找能有效改善缺血脑血管内皮细胞受损状态、消除脑缺血的始动因素、促进脑卒中血管新生的药物和方法，是目前治疗缺血性脑卒中的首要任务之一。

由于脑损伤时期血脑屏障有一定程度的受损开放，因此通过静脉输注药物或移植细胞来治疗脑卒中相关疾病已经有广泛的研究，且取得了一定的治疗效果：早在2001年，美国科学家Chen等^[7]就曾将人脐血干细胞通过尾静脉注射至脑缺血损伤模型的Wistar大鼠，之后经行为学检测发现其和未注射脐血干细胞的大鼠相比，行为功能学方面的不足有明显的改善。Lee等^[8]则报道了其所在团队在给脑缺血大鼠静脉注射褪黑素后，可降低大脑内细胞的炎症反应，进一步改善缺血后皮质细胞和纹状体神经元的生存状态。但一方面普通的药物和细胞缺乏对缺血损伤区的特异性针对作用，不能从根本上解决脑血管内皮细胞的受损状态；另一方面静脉滴注经过全身血液循环造成了药物或(和)细胞的大量损失，不仅无法提高脑部的血药或(和)细胞浓度，而且还容易使外来物质在肝肾等组织器官滞留，引起不利于机体健康的毒性反应。臧莉等^[9]在观察颈动脉注射磷酸川芎嗪注射液治疗脑梗死的临床疗效中就发现，对比静脉滴注磷酸川芎嗪的传统方法，颈动脉注射法能提高脑部磷酸川芎嗪的浓度，更有利于降低患者的神经功能缺损积分，缩小梗死面积。此外，意大利神经科学研究人员在2004至2008年期间对54例急性脑梗死患者进行随访研究，并进行了相关统计学分析，得出结论：急性脑梗死后迅速采用动脉注射药物的治疗方法比静脉注射药物更加安全可行^[10]。

本课题组和合作团队长期致力于基因转染材料的相关研究，前期已成功合成新型纳米基因载体-超支化支链淀粉衍生物(DMAPA-Amp)，并完成了细胞毒性及体外细胞转染率等的相关检测。通过MTT毒性实验观察超支化支链淀粉衍生物对人胚肾293T细胞系与人肺癌细胞A549细胞系的毒性作用，流式细胞仪和倒置荧光显微镜观察转染效果及其影响因素，证明超支化支链淀粉衍生物是一种低毒性、高转染率的阳离子聚合物非病毒基因载体，具有较强的DNA结合及保护能力，便于进行靶向性及生物适用性改性^[11-13]。同时，根据近年来国内外对于动静脉注射药物和细胞的疗效报道，课题组推测颈动脉注射法可能比传统的大鼠尾静脉注射法更有利于提高材料分子在脑内的浓度。因此，实验拟通过应用改良型颈动脉注射法将包裹绿色荧光蛋白的超支化支链淀粉衍生物递送至大脑中动脉梗死模型大鼠的脑缺血损伤区，运用蛋白质印迹法(Western blot)、实时荧光定量核酸扩增检测(QPCR)等分子生物学相关实验技术，确定绿色荧光蛋白能更好地在脑组织表达，为进一步递送治疗脑缺血损伤的目的基因、促进脑卒中缺血损伤的修复提供一定的前期理论依据。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年4至9月在中山大学附属第一医院转化医学中心实验室完成。

材料：

实验动物：SPF级健康雄性SD大鼠24只，体质量250-300 g，由中山大学实验动物中心生产供应部提供，合格证号：SYXK(粤)2012-0081。

主要仪器：高速冷冻离心机(Eppendorf)，组织匀浆机(IKA)，冰冻切片机(Shandon Cryotome FSE)，荧光显微镜(OLYPUMS)，Western blot系统(Bio-Rad)。

实验方法：

动物模型的制作：模型制作参考Longa等^[14]方法，SD大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后仰卧位固定于手术操作台面，暴露颈部皮肤，逐层分离颈部肌肉及血管，找到搏动的颈总动脉，向上分离出颈内动脉和颈外动脉。血管分叉处下方备线，先后结扎颈外动脉、颈总动脉近心端，立即在颈外动脉上离分叉处约8 mm处剪口，将直径为0.234 mm的线栓向远心端送入，线栓约送入感到有阻力时[(18.0±0.5) mm]停止插入。标记并固定外露的线栓，结扎颈内动脉，逐层关闭切口，给予抗生素处理并保温。大鼠清醒后可出现左侧Honer征、爬行时向左侧转圈及提尾倒立时左前肢屈曲，表示模型制作成功(图1A，B)。

实验动物分组及添加处理因素：将大脑中动脉梗死模型制作成功的大鼠随机分为2组，每组12只，24 h后重新麻醉并打开切口，根据手术后标记的线栓找到颈总动脉。完全拔去线栓并结扎颈总动脉上的剪口，待颈总动脉重新充盈后，在血管分叉与线栓剪口之间插入安全留置针，抽去留置针内部金属针头，固定外层透明软针头，缓慢推入液体(图1C)。对照组由尾静脉注射超支化支链淀粉衍生物溶液，实验组由颈内动脉注射超支化支链淀粉衍生物溶液各260 µL(质量浓度均为370 mg/L)。颈总动脉下方备线，抽出软针头并结扎颈总动脉。

大鼠饲养及灌注取脑：术后动物注意保暖以维持体温，可给予抗生素防止伤口感染。7 d后2组大鼠分别随机取6只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，先后用生理盐水和40 g/L多聚甲醛进行全身灌注以固定脑组织。打开大鼠颅腔小心取出完整脑组织，沿冠状面切去视交叉以前部分，保留视交叉以后部分制作冰冻切片。剩余的12只大鼠直接处死取出脑组织，生理盐水清洗表面血迹后也保留视交叉以后部分抽提组织蛋白和RNA。

脑组织的RNA抽提与qPCR检测：未经灌注直接取出的大鼠脑组织洗净后快速冻于液氮中。冰上操作，快速取出脑组织放入加有TRIzol试剂的离心管中，匀浆后冰上裂解15 min，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，离心半径为 6 cm。取上清液室温放置5 min充分裂解，依次加入氯仿、无水乙醇和体积分数75%乙醇处理后得到干燥的RNA，DEPC水溶解后测A值并计算浓度。反转录后取cDNA做PCR检测，为减少组间差异，每一标本均设3个复孔，在95 ℃变性1 min后，共进行45个循环扩增，每一循环包括 95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s，读板。随后，以0.17 ℃/s变化速度，从65-95 ℃每隔2 s记录1次荧光值，获得熔解曲线。观察扩增动力学曲线和熔解曲线，应用相对定量公式：2^-^ΔΔCt×100%，计算得出绿色荧光蛋白相对于GAPDH的量。qPCR引物序列：绿色荧光蛋白，Forward: 5’-TGA ACC GCA TCG AGC TGA AGG G-3’，Reverse: 5’ -TCC AGC AGG ACC ATG TGA TCG C-3’，63 ℃；GAPDH，Forward: 5’TTG TGC AGT GCC AGC CTC G-3’，Reverse: 5’ - TGC CGT TGA ACT TGC CGT G-3’，63 ℃。

脑组织的蛋白抽提与Western blot检测：未经灌注直接取出的大鼠脑组织取出后称质量，加入裂解液进行匀浆后转入EP管中，加入蛋白酶抑制剂，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min离心15 min(离心半径为6 cm)，取上清液并用BCA法测定蛋白含量。取脑组织匀浆蛋白50 μg与1/4体积的缓冲液混合均匀，水浴锅煮沸10 min，经12% SDS- PAGE电泳分离蛋白质，转移至PVDF膜上。5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入小鼠抗大鼠GFP抗体、兔抗大鼠GAPDH抗体4 ℃摇床孵育过夜，1×TBST洗膜3次后HRP标记的二抗室温孵育1 h，1×TBST洗膜3次。暗室内于PVDF膜上滴加发光液，压片盒胶片曝光，扫描图片并分析。重复实验多于3次。

制作脑组织冰冻切片与免疫荧光法观察：灌注后取出的脑组织于冰冻切片机上进行OCT包埋，以15 μm厚度切片后贴于防脱硅化玻片上，室温自然干燥。0.3%的Triton X-100进行细胞透化处理10 min后PBS洗片，用含5%BSA的PBS室温封闭切片30 min，加入小鼠抗大鼠GFP抗体，湿盒内4 ℃孵育过夜。PBS洗片3次，每次10 min，加入FITC标记的羊抗小鼠的IgG二抗，室温孵育1 h，PBS洗片3次，每次15 min。2.5 mg/L的Hoechst33342室温孵育15 min，PBS洗片3次，每次15 min。晾干后抗荧光淬灭封片剂封固，荧光显微镜下观察多个视野绿色荧光蛋白表达情况并分析。

主要观察指标：①两组大鼠存活的情况。②脑组织内绿色荧光蛋白的蛋白表达对比。③大鼠脑组织绿色荧光蛋白的qPCR检测。④两组大鼠脑组织冰冻切片的免疫荧光观察。

统计学分析：实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。各组数据以x(_)±s表示。组间差异比较行方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

随着老龄化时代的到来，饮食习惯的改变及确诊率的提高，脑卒中已成为当前中国致死和致残的第二大疾病，其生存期风险率高达8%-10%^[15-17]。其中缺血性脑卒中几乎占据了脑卒中患者总数的80%，而目前对缺血性脑卒中的治疗效果并不理想，因缺血性脑卒中所致的死亡和功能缺陷造成个人、家庭、社会的沉重负担^[18]。因此，进一步探讨缺血性脑卒中导致脑损伤的具体机制，消除脑缺血的始动因素、促进受损脑血管再生修复对从根本上治疗缺血性脑卒中具有重要的理论意义和临床应用价值。

本课题组在前期研究中发现，低氧诱导因子1α可以通过VEGF/PI3K/Akt/Fox01信号通路途径有效保护低氧导致凋亡的PC12细胞，发挥良好的神经保护作用^[19-20]。动物实验进一步证实，在脑缺血的大鼠，低氧诱导因子1α修饰的骨髓间充质干细胞能促进细胞的增殖，减少细胞凋亡，从而促进大鼠脑损伤的修复^[21-22]。但静脉注射骨髓间充质干细胞移植治疗的方式存在着细胞损失、组织形容性等问题。因此，作者认为用当前广泛研究的低毒、高转染率新型非病毒基因载体-超支化支链淀粉衍生物，包裹目的基因(低氧诱导因子1α)，经颈动脉注射法递送至脑组织损伤区，能更好有针对性地减少脑血管内皮细胞凋亡，促进受损脑组织修复。

壳聚糖作为生物材料中一种研究较早的基因载体，已经完成了各种性能的检测并运用于体外研究^[23-24]。但其基因转染率较低、靶向性也不太理想，极大地限制了在临床上的应用^[25-26]。本课题组利用多糖生物相容性好、易降解、无毒等特点，在研究壳聚糖的基础上，以具有超支化结构的天然多糖-支链淀粉为原料，合成了带胺基基团的超支化支链淀粉衍生物，并在不同细胞体系中研究了其基因转染性能及生物相容性，体外实验已证实其是一种低毒、高转染率的新型基因载体^[11-13]。而本实验证实，注射一定量的超支化支链淀粉衍生物进入大鼠体内并不会对其产生致死性的危害，且超支化支链淀粉衍生物能发挥良好的基因载体作用，将绿色荧光蛋白转入在体细胞并成功在大鼠脑组织中表达，进一步证实超支化支链淀粉衍生物这一纳米基因载体具有较好的转染效果及低毒性，是一种非常有前景的非病毒基因载体。

此外，常规药物或细胞治疗脑梗死的方式多为静脉注射，然而在脑损伤时期血脑屏障有一定程度受损开放^[27]，可以允许部分外来物质通过血脑屏障进入脑组织。但由于经过全身血液循环及机体的代谢造成了药物/细胞的大量损失，无法维持足够的血药浓度而发挥效应，而且容易引起外来物质在肝肾等组织器官的滞留，相比之下，颈动脉注射法不存在这方面的缺陷，且已经得到了良好的应用^[28-30]。临床应用颈动脉注射法推送药物治疗脑梗死的实践证实，无论是溶栓还是抗凝，其与静脉滴注的用药方式相比，都具有疗效好、操作简单、出血等不良反应少的明显优势。
实验旨在探讨递送基因载体时，颈动脉注射法是不是也优于静脉注射。应用改良型的颈动脉注射法，采用安全留置管的外层软管注入超支化支链淀粉衍生物溶液以减少对颈动脉造成的损伤，无论是基因还是蛋白水平的检测均显示，经颈动脉注射的大鼠脑组织内绿色荧光蛋白表达量显著高于尾静脉注射组；脑组织冰冻切片免疫荧光观察还可见脑血管周围区明显的绿色荧光表达。这些结果表明，颈动脉注射法在递送纳米基因载体至脑组织缺血损伤区上比尾静脉注射法更优越，递送的有效物质量更大，最终实现绿色荧光蛋白的转录与表达量也明显高于对照组。由此可见，应用新型本课题组合成的新型纳米基因载体超支化支链淀粉衍生物，能成功将外源性基因转入大脑中动脉梗死模型大鼠脑组织内并表达。同时，颈动脉注射法递送纳米材料同传统递送药物的方式一样，比静脉注射法更有优势。结合已有的研究基础，进一步将包裹有低氧诱导因子1α的超支化支链淀粉衍生物靶向导入脑缺血损伤区的研究正在进行中。

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改进型颈动脉注射法递送新型基因运载体包裹绿色荧光示踪蛋白

Delivery of DMAPA-Amp wrapped green fluorescent protein by modified carotid injection

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[4]	黄茂茂, 胡月, 王彬川, 张驰, 谢羽婕, 王剑雄, 汪丽, 胥方元. 缺血性脑卒中康复近10年国际文献计量学及可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3725-3733.
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[6]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[7]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
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[9]	鲍赛荣, 张其明, 杨杏萍, 刘春龙. 体外冲击波对脑卒中患者桡侧和尺侧腕屈肌肌肉张力、刚度及弹性的即刻影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 228-231.
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[12]	严浩, 齐志明. 纳米材料人工韧带骨连接及在抗粘连领域的研究与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2605-2611.
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[15]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.