聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.019

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (12): 1920-1925.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.019

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聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性

张弢^1，2，何志旭^3，4，叶川^3，5，刘杰麟^3，6，马敏先^7，8，孙博⁵，王梅⁷，杨华⁵

¹贵阳医学院，贵州省贵阳市 550004；²解放军117医院骨科，浙江省杭州市 310013；贵阳医学院，³组织工程与干细胞实验中心，⁴儿科教研室，⁶免疫学教研室，⁷口腔医学院，贵州省贵阳市 550004；贵阳医学院附属医院，⁵骨科，⁸口腔科，贵州省贵阳市 550004

修回日期:2014-01-20 出版日期:2014-03-19 发布日期:2014-03-19
通讯作者: 杨华，主任医师，贵阳医学院附属医院骨科，贵州省贵阳市550004
作者简介:张弢，男，1988年生，黑龙江省甘南县人，汉族，贵阳医学院骨外科学在读硕士，主要从事骨髓间充质干细胞移植与器官纺织研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81360232)；贵州省卫生厅资助项目(gzwkj2010-1-042)；贵州省国际科技合作项目(黔科合外G字2010-7)；贵州省科技厅社发联合基金项目(黔科合20103166)

In vitro biocompatibility of polyhydroxybutyrate-co-volerate membrane with human bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Tao^{1, 2}, He Zhi-xu^{3, 4}, Ye Chuan^{3, 5}, Liu Jie-lin^{3, 6}, Ma Min-xian^{7, 8}, Sun Bo⁵, Wang Mei⁷, Yang Hua⁵

¹Guiyang Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ²Department of Orthopedics, the117th Hospital of PLA, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China;³the Center of Stem Cells and Tissue Engineering Research, ⁴Department of Pediatrics, ⁶Department of Immunology, Guiyang Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ⁵Department of Orthopedics, ⁸Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Guiyang Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ⁷School of Stomatology, Guiyang Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Revised:2014-01-20 Online:2014-03-19 Published:2014-03-19
Contact: Yang Hua, Chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guiyang Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Zhang Tao, Studying for master’s degree, Guiyang Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Department of Orthopedics, the 117th Hospital of PLA, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360232; the Project of Guizhou Health Bureau, No. (gzwkj2010-1-042; International Science and Technology Cooperation Project of Guizhou Province, No. 2010-7; the Joint Social Development Foundation of Science and Technology Bureau of Guizhou Province, No. 20103166

摘要/Abstract

摘要：

背景：聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物是近年来受到重视的聚羟基脂肪酸族组织工程支架材料，具有免疫排斥反应低、生物相容性好和降解产物无毒副作用的优点。
目的：观察聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜材料与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性。
方法：将第3代人骨髓间充质干细胞种植于聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上作为实验组，培养板单纯培养细胞作为对照组，计算1，2，4 h两组贴壁细胞的数量，得出细胞贴壁率。MTT比色法观察2，4，6，8 d两组细胞的增殖情况。采用Hoechst33258荧光法，检测3，6，9，12 d两组细胞内的DNA含量。将人骨髓间充质干细胞接种聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜材料上5 d后，电镜扫描观察细胞在材料上的生长情况。
结果与结论：共培养1 h时，实验组的细胞贴壁率低于对照组；其他时间段两组之间细胞贴壁率差异无显著意义。两组各时点间的细胞增殖差异无显著意义。两组各时间点细胞内DNA含量差异无显著意义。扫描电镜观察人骨髓间充质干细胞在聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上生长良好，形态呈梭形，细胞间连接紧密，分泌较多细胞基质。证明聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜材料与人骨髓间充质干细胞有良好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物, 人骨髓间充质干细胞, 生物相容性, 组织工程, 细胞贴壁率, 细胞增殖, 体外, DNA含量, 高分子, 材料活性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Polyhydroxybutyrate-co-volerate (PHBV) is a noticeable tissue engineering material of polyhydroxyalkanoates family. It has the properties of low immune rejection response and good biocompatibility, and its degradation products are non-toxic.
OBJECTIVE: To investigate the biocompatibility of PHBV membrane material and human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.
METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3 were seeded upon PHBV membrane as experimental group and upon conventional culture plates as control group. Then we calculated the adherent cell number of two groups at 1, 2 and 4 hours and got the cell adherent rate. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide assay was used at days 2, 4, 6, 8 to observe the cell proliferation of two groups. Fluorimetric method with the fluorescent dye Hoechst 33258 was used to detect the DNA content of cells at days 3, 6, 9 and 12 in both groups. After cells were seeded upon PHBV membrane for 5 days, the cell growth upon the material was examined under a scanning electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: When the cells were cultured for 1 hour, the adherent rate in the experimental group was lower than that in the control group; but there were no significant differences between two groups at the other two periods. No difference was found in the cell proliferation and the DNA content between the two groups. Human bone marrow mesenchymal stem cells seeded upon PHBV membrane for 5 days grew well with spindle morphology and the intercellular connections were tight and more extracellular matrices were observed by scanning electron microscopy. Taken together, PHBV membrane material shows a good biocompatibility with human bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, stem cells, 3-hydroxybutyric acid, histocompatibility

中图分类号:

R318

张弢，何志旭，叶川，刘杰麟，马敏先，孙博，王梅，杨华. 聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(12): 1920-1925.

Zhang Tao, He Zhi-xu, Ye Chuan, Liu Jie-lin, Ma Min-xian, Sun Bo, Wang Mei, Yang Hua. In vitro biocompatibility of polyhydroxybutyrate-co-volerate membrane with human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(12): 1920-1925.

图/表（结果） 3

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引言

组织工程学是近几年形成的新科学，能使缺损的组织和器官得以重塑和再建，其过程是在组织缺损部位填充身体可以吸收的材料，可以是水凝胶或多孔支架，也可以载有本体细胞或生长因子，在材料逐渐被体内吸收的同时，细胞增殖，新组织形成，从而修复组织缺损。其中可吸收性支架材料是组织工程领域的核心部分，它是种子细胞的载体和组织再生的模板，引导组织器官再生和控制微观结构是组织工程能否实现临床转化的关键因素。现有支架材料包括天然和人工合成两大类，其中高分子具有性能可控、无免疫排斥反应及生物相容性好等优点。聚碳酸酯家族是一类从细菌中分离出来，由原核生物在碳、氮营养失衡的情况下，作为碳源和能源储存而合成的多聚酯，分为聚羟基丁酸酯、聚-4-羟基丁酸、聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物、聚羟基丁酸己酸酯、聚3-羟基辛酸酯几种类型^[1]。聚羟基丁酸酯在体内降解有水解和生物降解两种形式，最终形成CO₂和H₂O，但由于单纯的聚羟基丁酸酯易碎、遇热不稳定、降解速度慢、酸性降解产物影响细胞生长等缺点限制了它的广泛使用。而将聚羟基戊酸引入聚羟基丁酸酯主链形成聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物可改善上述聚羟基丁酸酯的缺点，故近年来聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物在组织工程中的应用引起越来越多的关注。

聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物生物相容性、生物可降解性、刺激性和免疫原性都表现出较佳的理化性质，很接近理想的材料^[1-3]。周栋等^[4]以聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物为支架构建组织工程心脏瓣膜，发现种子细胞不仅可以在聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物上生长，而且可以合成血管活性物质，初步提示应用聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物及其方法构建组织工程心脏瓣膜是可行的。唐倩等^[5]的研究发现聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜不仅可在体内缓慢降解，而且膜覆盖组术后第2周即可见新骨形成，12周时骨缺损区已完全为新骨充填，骨再生量明显优于对照组，所以聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜能引导骨组织再生，有可能成为一种较理想的引导骨组织再生的天然膜材料。另外由于聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物生产成本较低，它在制药业中是一个良好的用来研究药物装载纳米颗粒的材料^[6]。

骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能、纯度高、易于获得等优点^[7-9]，被认为是组织工程中理想的种子细胞^[10-12]。实验探讨聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性，为二者进一步的研究和可能的临床转化提供数据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：体外观察性实验。

时间及地点：实验于2012年3月至2013年10月在贵阳医学院组织工程与干细胞中心实验室完成。

材料：聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜由清华大学高分子所提供，将材料剪裁成适当大小的圆形。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的原代、传代及多项分化诱导培养：在5例骨折不愈合患者取髂骨植骨前抽取髂骨骨髓20 mL(所有供者对实验均知情同意^[13])，放入肝素化的50 mL容积离心管，实验室中加入低糖DMEM 20 mL混匀，1 500 r/min×5 min离心(离心半径为13.5 cm)，后去上清液，PBS重悬细胞，洗涤，1 500 r/min离心漂洗1次，5倍量红细胞裂解液轻微震荡裂解红细胞，10 min后1 500 r/min离心漂洗2次，去上清，PBS重悬后离心洗涤 2次，加入含体积分数10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L的低糖DMEM培养基重悬细胞，在37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下培养，每3 d更换1次培养基。当细胞生长达90%融合时，加入0.05%胰蛋白酶/ 0.53 mmol/LEDTA混合液传代培养^[14]。干细胞为多功能分化细胞，可诱导成软骨细胞和成骨细胞，所以为了鉴定培养的细胞为骨髓间充质干细胞，将第3代骨髓间充质干细胞向软骨细胞和成骨细胞方向诱导，并进行相关的免疫组织化学染色，来证明所培养的细胞为骨髓间充质干细胞^[15-17](图1)。

细胞黏附率：将聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜材料剪切成24孔板孔底大小，高压蒸汽灭菌后置入24孔板，DMEM完全培养基浸湿备用。将第3代骨髓间充质干细胞用完全培养基重悬，实验组将1×10⁶个细胞种植于每孔中的聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上，于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下培养。对照组不置入材料，将细胞直接接种于24板内。分别在接种后1，2，4 h时各取8孔吸出悬浮的细胞，PBS漂洗，胰酶消化贴壁细胞，计数贴壁细胞数，计算贴壁率。

细胞增殖(MTT比色法)：实验组将5×10⁵个第3代骨髓间充质干细胞种植于聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上，于24孔板中常规培养；对照组不放入材料，直接将细胞接种于24孔板内。于第2，4，6，8天两组各取8孔，将完全培养基换成无血清培养基后培养12 h，每孔加入5 g/L的MTT 80 µL，继续培养4 h，吸去上清，每孔加入720 µL DMSO，振荡15 min，酶联免疫检测仪上波长490 nm检测各孔吸光度值(A值)。

细胞DNA含量测定：采用Hoechst33258荧光法检测细胞内的DNA含量。实验组将1×10⁶个第3代骨髓间充质干细胞种植于24孔板内的聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上；对照组不放入材料，直接将细胞接种于24孔板内。取培养3，6，9，12天的两组细胞，每组每个时间点8个复孔，取裂解液100 μL加入900 μL Hoechst33258荧光染液，混匀后放置10 min。将样品放入荧光分光光度计中，在激发波长356 nm、发射波长492 nm下测定荧光强度，以小牛胸腺DNA为标准品参照，得出细胞内DNA浓度。

扫描电镜观察：取培养第5天的细胞/材料复合物1块，培养第5天的空白材料1块，常规经2.5%戊二醛固定、丙酮脱水、临界点干燥、喷金等处理后在扫描电镜下观察。

主要观察指标：两组贴细胞贴壁率、增殖、细胞内的DNA含量，以及细胞在材料上的生长情况。

统计学分析：实验数据以x(_)±s表示，用SPSS 12.0统计学软件进行统计学处理，配对t 检验比较细胞增殖和DNA含量，卡方检验比较细胞吸附率，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

组织工程的载体为可吸收材料，其为细胞生长提供依附的支架^[18-19]。理想的组织工程支架应具有以下特性^[20-21]：①良好的生物相容性：支架材料应无毒、无致畸作用。②适宜的生物降解性：支架材料应为可降解材料，且材料的降解率应与组织细胞生长率相适应，降解时间应能根据组织生长特性进行有效调控。③有效的表面活性：有利于细胞黏附，为细胞在其表面生长、增殖和分泌细胞外基质提供良好的微环境，能激活细胞特异基因表达，维持正常的细胞表型表达。④具有一定的可塑性：便于加工成所需的形状，并有一定的机械强度，植入体内一定时间内仍可保持其形状，从而使形成的组织具有所需的外形。目前的材料分为人工合成材料和天然生物材料两大类，但还没有符合所有标准的材料出现，多种材料正处于生物检测阶段^[22-23]。

聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物是聚碳酸酯家族中的第3代可降解材料，其是由原核生物在碳、氮营养失衡的情况下作为碳源和能源储存而合成的热塑性聚酯，不仅具有化学合成高分子材料相似的性质，而且在生物相容性、生物可降解性、刺激性和免疫原性都表现出较佳的理化性质，因此聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物在创伤敷料、药物控释载体等方面有着很好的应用前景^[24]。

章柏平等^[24]观察可塑性纳米羟基磷灰石/聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物-聚乙二醇[nanohydroxyapatite/poly (3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate)-polyethylene glycol,

nano-HA/PHBV-PEG]载硫酸庆大霉素(gentamicin,GM)局部药物释放系统对骨髓炎的治疗作用，实验制备兔胫骨近端骨髓炎模型，于胫骨近端骨窗内注入金黄色葡萄球菌后2周，行病灶清除。Ⅰ组植入1 mL可塑性nano-HA/PHBV-

PEG-GM局部药物释放系统；Ⅱ组植入可塑性nano-HA/PHBV-PEG 1 mL及23.2 mg硫酸庆大霉素粉；Ⅲ组植入1 mL可塑性nano-HA/PHBV-PEG并肌注硫酸庆大霉素5 d，共23.2 mg；Ⅳ组植入1 mL可塑性nano-HA/ PHBV-PEG；Ⅴ组无任何植入，术后8周进行放射学、组织学、细菌学检查。结果显示Ⅰ组细菌计数及改良X射线Norden 骨髓炎评分极低，明显小于其他各组(P < 0.01)，其组织学观察无明显骨髓炎表现；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组细菌计数逐渐增大，差异有显著性意义(P < 0.01)，但3组间改良X射线Norden 骨髓炎评分差异无显著性意义(P > 0.05)，组织学观察骨髓炎表现也无本质差别；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组细菌计数及改良X射线Norden 骨髓炎评分均较高，明显大于Ⅴ组(P < 0.01或0.05)，其组织学显示出严重骨髓炎表现。结果提示在病灶清除后，一期将可塑性nano-HA/PHBV-PEG-DDS植入残留的感染性骨缺损，能快速有效地治疗骨髓炎。随着组织工程领域的发展，聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物作为组织工程可吸收支架材料的应用前景也受到关注。体外实验中观察到鼠成骨细胞可在聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物多孔泡沫上增殖，培养60 d时成骨细胞仍能完整表达其表型，并在聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物支架内生成大量磷酸钙盐，其成分和骨的主要无机成分羟基磷灰石相似，表明培养在聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物三维支架上的骨细胞保持了其正常的生理功能，已具有骨样组织的初步特征^[25]；Liu等^[26]用人脂肪间充质干细胞与聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物三维材料构建组织工程软骨，16周时在裸鼠皮下形成了类软骨组织，材料和细胞间有大量糖胺多糖等细胞外基质沉积，分子生物学和力学测试均接近于正常软骨，提示聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物是构建形态和功能都符合要求的组织工程化软骨的选择之一。

细胞黏附率是用来评价细胞对生物材料表面活性的主要指标之一，一般采用短期内细胞在材料表面的细胞计数来测定。实验数据显示人骨髓间充质干细胞种植于聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜后的最初1 h黏附率低于对照组，而在第2，4小时则没有区别，这可能与聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物的表面活性有关，虽然细胞最终仍能完成贴壁，适应材料后迅速生长增殖，但如果能改善聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜吸附率和亲水性等表面活性，一开始就优化其表面活性，对促进骨髓间充质干细胞这一类贴壁生长的细胞来说非常重要^[27-36]。Morent等^[27]报道用富含氮氧的血浆修饰聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜，可以显著改善其亲水性。Lao等^[28]通过接枝的方法，将甲基丙烯酸-羟基乙酯接枝到聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物上后，其亲水性提高130%以上。另外通过精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽多肽的修饰也可明显改善聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜表面活性^[29]。说明聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物的表面修饰是改善聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物表面活性的有效方法之一。

细胞在材料上的生长情况是评估材料生物相容性的重要指标。实验中人骨髓间充质干细胞接种至聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上后，采用与细胞生长呈正相关的MTT法进行检测，观察到细胞在第2天时增殖速度低于对照组，这可能和前述的细胞吸附率有关，聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物吸附率低意味着最初的贴壁细胞少，增殖细胞在数量上就少，但4 d以后两组增殖率已没有区别，说明骨髓间充质干细胞能在聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上迅速生长和增殖，同时通过定量测定细胞内DNA含量发现，接种至聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上生长的细胞内DNA的含量与正常对照无差异，且细胞材料复合物的扫描电镜观察亦显示，细胞在聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物上生长时能大量分泌基质。因此可以认为，聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜不影响种植其上人骨髓间充质干细胞的增殖。

众多研究证明骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞，能向中胚层和神经外胚层组织细胞分化，在不同的诱导条件下可以长期保持向多种结缔组织及部分源于外胚层的组织分化的能力，形成骨、软骨、骨骼肌、韧带、真皮、脂肪、骨髓基质和神经等组织，故骨髓间充质干细胞可以作为组织工程中理想的种子细胞^[37]，实验也验证了人骨髓来源的间充质干细胞与聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物复合构建工程化组织的可行性。

实验通过接种于聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物前后人骨髓间充质干细胞黏附、生长、增殖、代谢合成等一系列的研究，显示了聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物具有较好的生物相容性，但其细胞吸附率可能需要通过化学修饰的方式来改善。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性

In vitro biocompatibility of polyhydroxybutyrate-co-volerate membrane with human bone marrow mesenchymal stem cells

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