大鼠成骨细胞与壳聚糖/羟基磷灰石复合支架降解产物的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：人们对壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架在体内的降解过程并非十分清楚，而且有关其降解产物对成骨细胞的影响研究也较少。
目的：分析大鼠成骨细胞与壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架降解产物的生物相容性。
方法：将培养的第2代大鼠成骨细胞分别在壳聚糖/羟基磷灰石复合支架降解产物浸提液和含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，培养第2，4，6，8，10天分别对两组细胞做MTT细胞计数，采用联合会推荐法测定细胞碱性磷酸酶活性，采用BCA蛋白定量法测定总蛋白。
结果与结论：在壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架降解产物浸提液中培养的大鼠成骨细胞增殖速度、细胞碱性磷酸酶活性、细胞总蛋白合成及碱性磷酸酶与总蛋白的比值明显高于在体积分数为10%胎牛血清DMEM培养液中培养的细胞(P < 0.05)。表明壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架的降解产物不仅可促进大鼠成骨细胞的黏附、生长和增殖，还可增强其骨化功能，具有较好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 羟基磷灰石, 壳聚糖, 大鼠成骨细胞, 复合支架, 细胞相容性, 降解产物, 相容性研究

Abstract:

BACKGROUND: The in vivo degradation process of chitosan/hydroxyapatite composite porous scaffolds is not very clear. Research on the effects of rat osteoblasts and degradation products is less.
OBJECTIVE: To analyze the biocompatiblity of rat osteoblasts with degradation products of chitosan/hydroxyapatite composite porous scaffolds.
METHODS: The second generation of cultured rat osteoblasts were respectively cultured in the extract of degradation products of chitosan/hydroxyapatite composite scaffolds (experimental group) and Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% fetal bovine serum (control group). At 2, 4, 6, 8, 10 days of culture, cell counting was measured by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. Alkaline phosphatase activity was measured by the recommended method of determination of the Federation, and total protein was determined by BCA method.
RESULTS AND CONCLUSION: The proliferation speed, alkaline phosphatase activity, total cellular protein synthesis and ratio of alkaline phosphatase to total protein in rat osteoblasts cultured in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). This experiment showed that the degradation products of chitosan/hydroxyapatite composite porous scaffolds cannot only promote rat osteoblast adhesion, growth and proliferation, but also enhance its ossification function, with good biocompatibility.

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Key words: biocompatible materials, durapatite, chitosan, osteoblasts

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

近几年来，随着人类医学的飞速发展，人们利用各种方法对现有的骨组织工程技术医用支架进行修饰，出现了各种新型骨组织修复材料。天然骨基质主要是由无机结构和生物大分子有机结合在一起的复合体^[1]。大量研究表明，理想的支架材料是与天然骨基质具有相似结构、组成成分及生物学反应的复合支架材料，应满足以下几点：模拟骨组织的成分、性质和结构满足植入组织部位的力学要求；具有较好的骨传导性，有利于临近骨组织的生长替代；具有良好的生物学相容性，不引起组织局部排斥反应，无细胞毒性；具有可降解性，可逐渐被自体骨组织所替代；具有孔架结构，适当的孔径与孔隙率利于组织物质交换，可为细胞生长提供足够的空间；可作为调节生物活性因子释放的载体^[2]。

羟基磷灰石是天然骨中的主要无机成分，具有良好生物相容性、骨传导性、生物可降解性，由于其较好的生物相容性、无毒、质量轻、无致敏性及有利于血管长入的特性已被广泛应用于临床。目前在临床眼科方面，由于各种原因导致眼内容物被剜除及眼球摘除后引起的最常见并发症是眼窝凹陷，不仅影响美观，还会造成义眼的滑脱等问题，羟基磷灰石被作为义眼座广泛应用于临床眼科^[3-4]。在临床骨科方面，羟基磷灰石作为关节假体表面的涂层有利于骨组织长入空隙内，达到生物学固定的目的，还可减少关节置换后假体松动或脱出等并发症，避免了短期内的假体翻修，减少了患者的痛苦和经济负担^[5-6]。羟基磷灰石在口腔科中也展现出其特有的优势，在颌面部骨质缺损的治疗中发挥着重要作用^[7]。

壳聚糖具有良好的抗菌性、生物相容性及生物可降解性。壳聚糖在临床上应用广泛，由于其广谱抗菌作用强，对真菌及细菌均有不同程度的抑制作用，同时还具有镇痛、止血、促进上皮细胞生长、抑制成纤维细胞生长、抑制瘢痕组织生长作用，已被应用于医用敷料和医用抗菌生物膜中。壳聚糖还可用在周围神经缺损修复中，其复合导管理化性质及生物学特性符合临床要求；有实验表明，在膝关节硬化患者术后应用壳聚糖可预防关节再粘连的发生；在高脂血症患者中，壳聚糖还可在一定程度上降低胆固醇、低密度脂蛋白及三酰甘油，并且对肝功能无明显损害^[8-9]。另外，有研究表明壳聚糖作为药物缓释载体材料可促进抗肿瘤药物发挥作用，还可作为儿茶酚胺及某些抗病毒药物的缓释载体，因此壳聚糖在药物缓释载体方面也具有较好的临床应用前景^[10]。羟基磷灰石脆性大、不易塑形，壳聚糖强度低，在湿态环境下损耗过快，将羟基磷灰石和壳聚糖复合得到的支架材料，综合了二者的生物活性，更加适合作为骨组织工程中的骨修复材料^[11]。但其在体内降解过程并非十分清楚，而且其降解产物对成骨细胞的影响研究也较少，故实验从此处入手研究。

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材料方法

设计：体外细胞实验。

时间及地点：于2013年5至9月在山西医科大学解剖实验室和山西医科大学第二医院骨科实验室完成。

材料：

实验动物：新生24 h内的Wistar大鼠，雌雄不拘，由扬州大学比较医学中心提供，许可证号：SCXK(苏) 2012-0004。实验过程对动物的处置符合医学伦理学的标准。

实验方法：

大鼠成骨细胞的分离培养^[12-13]：将大鼠乙醚麻醉，用体积分数75%乙醇消毒表面，并在无菌条件下分离颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织；用含双抗的冷PBS反复吹打，清洗二三次，将其剪成小于1 mm³的组织块，将组织移入2 mL离心管中；往离心管中加3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置入37 ℃恒温摇床中，振荡消化20 min；血清终止消化，4 ℃静置5 min，弃上清，加入0.2% 胶原酶Ⅰ，置入37 ℃恒温摇床中，振荡消化60 min；加入生长培养基终止消化，反复吹打后通过200目滤网过滤去除骨碎片。收集滤液，1 200 r/min离心8 min，弃上清，用DMEM完全培养基重新悬浮细胞，放入37 ℃、体积分数5% CO₂细胞培养箱。培养2 d后换液，以后每隔二三天换1次液。

大鼠成骨细胞的鉴定：在倒置相差显微镜下观察大鼠成骨细胞形态与生长情况^[12]。苏木精-伊红染色观察大鼠成骨细胞形态，碱性磷酸酶染色鉴定大鼠成骨细胞并观察拍照，胞浆中出现块状沉淀或者黑色颗粒为阳性^[12]。

壳聚糖/羟基磷灰石复合支架的制备：称取1 g羟基磷灰石，用2%乙酸溶解，将壳聚糖慢慢加入，搅拌溶解；缓缓向溶液中加入NaOH溶液，至沉淀不再析出，沉淀即为多孔生物支架。支架形态见图1。

复合支架的降解及降解产物的提取：将多孔生物支架用去离子水清洗3次；除去水分后用体积分数75%的乙醇溶液浸泡1 h，三蒸水反复冲洗，除去水分后在密闭环境中用高效紫外灯照射1 h；将灭菌后的材料用PBS浸泡30 min，除去多余液体；60 ℃真空干燥12 h；无菌条件下将支架转入可密闭的容器，按支架质量与灭菌的PBS比例为1 g/30 mL浸泡于密闭容器中；37 ℃恒温振荡3个月。

大鼠成骨细胞与壳聚糖/羟基磷灰石复合支架降解产物的相容性：以1×10⁸L^-¹的细胞浓度将第2代大鼠成骨细胞接种于96孔板，每孔200 μL，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，待细胞贴壁后进行后续实验；实验分实验组和对照组各10个孔，对照组加入10 μL DMEM高糖完全培养基，实验组加入10 μL 3个月后更换出的PBS浸出液， 37 ℃恒温密闭培养，分别于第2，4，6，8，10天各取2孔做MTT(取平均值)，绘制出细胞增殖曲线，用碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求测定碱性磷酸酶活性，用BCA蛋白定量测定总蛋白，计算单位总蛋白的碱性磷酸酶含量，将得到的结果用Wilcoxon配对法秩和检验进行评价。

主要观察指标：实验组及对照组的细胞增殖、碱性磷酸酶活性指标及总蛋白测定结果。

统计方法分析：采用SPSS 16.0统计软件包进行Wilcoxon配对法秩和检验。

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讨论

在当今社会中，随着科技的飞速发展，自然灾害、各种交通事故、工伤的频繁发生及骨肿瘤切除、骨折不愈合或延迟愈合、骨的先天疾病、感染等各种因素导致的骨质缺损，在临床上是较常见的疾病。骨组织在维持机体结构及功能中具有重要作用^[14]。目前在组织工程领域中能够作为替代骨组织的材料有：①自体骨：是人体自身组织，不会引起自身的免疫排异反应，可以为成骨细胞提供黏附、增殖的理想材料，但其来源有限，以及取骨区并发症较多(如取骨区伤口感染、疼痛等)限制了其在临床上的应用。②同种异体骨：为经过科学处理过的外来组织，来源较多，不会给患者带来过多的伤害及痛苦，但毕竟对患者机体而言是异物，或多或少会存在排异反应，而且在某种程度上存在着传播HIV、梅毒、肝炎等疾病的风险^[15]。③异种骨：异种骨的植入为不同种属骨移植，价格便宜，来源相对广泛，但种属之间抗原差异较大，存在免疫排斥反应^[16]。 ④人工骨生物支架：价格较便宜，来源广泛，还能避免传播疾病。它作为骨的替代材料在组织工程领域中被广泛应用研究^[17]，目前已成为临床医学及生物学研究的重点。

目前在组织工程领域中，人工骨生物支架制备的方法和过程在国内基本成熟，人工生物支架主要分为复合材料和天然生物衍生材料，如：聚乙酸、磷酸三钙、聚乳酸等。目前的研究表明，以上几种材料都有自己的优缺点：如聚乙酸和聚乳酸，降解后产生的酸性代谢物会降低其周围组织的pH值，会对周围组织及细胞的生长、增殖产生影响，也会引起周围组织纤维化和机体免疫反应，尽管有较好的生物可降解性、生物相容性和可吸收性，但可塑性较差且成本也比较高，限制其大规模应用于实验及临床研究。因此实验采用壳聚糖/羟基磷灰石制成复合支架材料。

羟基磷灰石是人和动物骨骼中的主要无机成分，具有良好生物相容性、骨传导性及生物可降解性，由于其较好的生物相容性、无毒、无致敏性及有利于血管长入等特性，已被广泛应用于临床眼科(羟基磷灰石被作为义眼座支撑预防眼窝凹陷，避免义眼的滑脱等)，临床骨科(羟基磷灰石作为关节假体表面的涂层可使假体达到达到生物学固定，减少假体松动或脱出等并发症，减少了患者的痛苦和经济负担)及临床口腔科(羟基磷灰石在颌面部骨质缺损的治疗中发挥着重要作用)^[3-7]。但其脆性大、不易塑形。

壳聚糖具有良好的抗菌性、生物可降解性及生物相容性，其分解产物为对人体无毒的氨基葡萄糖，可以完全被人体吸收，由于壳聚糖特有的抗菌作用、镇痛、止血、抑制细菌微生物生长、促进上皮细胞生长的同时抑制成纤维细胞生长、减少瘢痕组织生成、良好的生物相容性及生物可降解性，已被应用于医用敷料和医用抗菌生物膜中。在周围神经缺损修复，膝关节硬化患者术后预防关节再粘连，降低高脂血症患者血脂都有一定作用。此外壳聚糖在药物缓释载体方面也具有较好的临床应用前景^[8-10]。但其强度低，潮湿环境损耗快。羟基磷灰石和壳聚糖复合得到的支架材料既具有羟基磷灰石的强度和硬度，又具有壳聚糖的柔韧性^[11]。Bauer等^[18]指出，骨移植替代的一项基本指标是具备骨传导作用，因为具备骨传导的物质可以作为类骨质沉积与新生骨的生长的基质和支架。理想的人工骨支架材料还需具有以下特点：较好的生物相容性；适宜的孔径，以保证成骨细胞的黏附与增殖，以及营养物质的运输；一定的机械强度^[19-20]。正常密质骨的弯曲强度在110-200 MPa之间，弯曲模量在10-20 GPa之间；松质骨的弯曲强度为20 MPa左右，弯曲模量一般为2 GPa左右，压缩强度在一般为17 MPa左右^[21]。张利等^[22]通过共沉淀法制备的壳聚糖/羟基磷灰石复合生物支架压缩强度可达 120 MPa左右，基本可以满足人工骨支架材料对力学性能的要求。目前认为，小于100 µm的孔径不利于成骨细胞的长入，孔径直径在150-500 µm最适宜矿化成骨^[23]。有文献报道，壳聚糖/羟基磷灰石复合生物支架的平均孔径为 300 µm左右^[24]，因此由于壳聚糖/羟基磷灰石复合生物支架的多孔性质，能够促进新生血管在基质中形成及纤维结缔组织的增生，并能容纳大量的成骨细胞，而且这些相通均匀的孔径在组织修复过程中有利于营养物质的运输，有利于组织的快速长入。近几年来，壳聚糖/羟基磷灰石人工骨生物支架材料的研究和应用受到了较多关注^[25]。评价复合支架材料是否能作为组织工程中骨组织替代材料的一个重要指标，是将种子细胞接种到复合支架材料上还能否维持促进其增殖活性^[26]。有研究表明，将大鼠成骨细胞在壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架表面培养，其增殖速度明显高于无支架材料组大鼠成骨细胞的增殖速度^[27]，壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架与骨髓间充质干细胞共培养有利于骨髓间充质干细胞的增殖和向成骨及软骨细胞的分化^[28]。但这种复合支架材料的体内降解过程并非十分清楚，而且其降解产物对成骨细胞的影响研究也较少，故实验从此处入手研究。

目前，在体外进行细胞复合培养法是评价支架材料生物相容性的一种重要途径。体外培养的大鼠成骨细胞为贴壁生长的成纤维细胞型，可分泌骨基质(其成分主要为Ⅰ型胶原)，并促进骨基质矿化包裹成骨细胞最终成为骨细胞。实验取材来自24 h内出生的Wistar大鼠头盖骨，此种成骨细胞来源为新生细胞，经多年研究发现其表型可限定，在一定程度保留了胚胎细胞的分化表型，已被广泛应用于骨组织工程领域^[27]。实验制备大鼠成骨细胞采用胶原酶消化法，并对其进行培养及鉴定^[12-13]，此种方法实验取材来源广，操作简单，得到的成骨细胞数量较大、纯度高，在一定程度上弥补了组织块法培养周期过长，获得细胞数量较少的缺点^[29]。程浩等^[29]取新出生72 h内SD大鼠乳鼠颅骨，分别以胶原酶消化法、分段胶原酶消化法及组织块法分离成骨细胞，进行细胞形态观察、细胞化学染色、CCK-8法绘制生长曲线及锥虫蓝排斥法计数活细胞率。结果显示分离培养的成骨细胞增殖良好，具备典型成骨细胞特性，细胞化学染色结果明显。胶原酶消化法比分段胶原酶消化法提取的成骨细胞数量多，细胞存活率高(P < 0.05)；且比分段胶原酶消化法操作简单，耗时短。组织块法操作最为简单，对细胞损伤较小，但是细胞数量低、耗时长，很难用于大规模成骨细胞培养。胶原酶消化法是一种方便、高效、理想的原代成骨细胞分离培养方法。对壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架进行降解，将培养好的大鼠成骨细胞分别与体积分数为10%新生胎牛血清的DMEM培养液(对照组)和复合支架降解产物的浸提液(实验组)进行相容培养，证实此种复合多孔支架降解产物与大鼠成骨细胞的生物相容性。实验发现，通过MTT测定大鼠成骨细胞的体外增殖过程，实验组增殖速度明显高于对照组，两组均是在第4-6天里增殖最快，为细胞生长的对数期，生长旺盛，此期前后增殖相对缓慢，这也和大鼠成骨细胞的增殖规律相符^[12]，两组有统计学差别，说明壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架的降解产物能够促进大鼠成骨细胞的增殖、生长，并能保持原有形态。

大鼠成骨细胞与支架材料复合后能否保持或促进其正常的生理功能也是评价材料生物相容性的又一重要依据。碱性磷酸酶在机体各组织中广泛存在，主要为肝脏、骨、肾脏、胎盘、小肠，人体血清中碱性磷酸酶主要由成骨细胞(骨源性)和肝脏(肝源性)合成，成骨细胞合成碱性磷酸酶几乎占到血清总量的50%。碱性磷酸酶作为成骨细胞分泌的一种酶蛋白，是评价成骨细胞分泌功能最常见的指标之一，碱性磷酸酶表达的多或少可间接反映成骨细胞的功能状态及分化程度^[30]；并且碱性磷酸酶在骨的钙化中起到重要作用^[31]，是评价大鼠成骨细胞功能及分化成熟的早期主要指标之一^[13]，实验测定大鼠成骨细胞的碱性磷酸酶活性发现，实验组和对照组碱性磷酸酶活性、总蛋白合成及碱性磷酸酶/总蛋白差异有显著性意义，表明壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架的降解产物可以促进大鼠成骨细胞的骨化功能。

壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架的降解产物不仅促进大鼠成骨细胞的黏附、生长和增殖，还可增强其骨化功能，具有较好的生物相容性，可促进骨组织的改建及完全修复等，有望成为一种新型骨缺损修复材料而被应用于临床。

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壳聚糖具有良好的抗菌性、生物可降解性及生物相容性，其分解产物为对人体无毒的氨基葡萄糖，可以完全被人体吸收，由于壳聚糖特有的抗菌作用、镇痛、止血、抑制细菌微生物生长、促进上皮细胞生长的同时抑制成纤维细胞生长、减少瘢痕组织生成、良好的生物相容性及生物可降解性，已被应用于医用敷料和医用抗菌生物膜中。在周围神经缺损修复，膝关节硬化患者术后预防关节再粘连，降低高脂血症患者血脂都有一定作用。此外壳聚糖在药物缓释载体方面也具有较好的临床应用前景。但其强度低，潮湿环境损耗快。羟基磷灰石和壳聚糖复合得到的支架材料既具有羟基磷灰石的强度和硬度，又具有壳聚糖的柔韧性。Bauer等指出，骨移植替代的一项基本指标是具备骨传导作用，因为具备骨传导的物质可以作为类骨质沉积与新生骨的生长的基质和支架。理想的人工骨支架材料还需具有以下特点：较好的生物相容性；适宜的孔径大小以保证成骨细胞的黏附与增殖，以及营养物质的运输；一定的机械强度。正常密质骨的弯曲强度为1lO-200MPa之间，弯曲模量为1O-20GPa之间；松质骨的弯曲强度为20MPa左右，弯曲模量一般为2GPa左右，压缩强度在一般为17MPa左右。张利等通过共沉淀法制备的壳聚糖/羟基磷灰石复合生物支架压缩强度可达120MPa左右，基本可以满足人工骨支架材料对力学性能的要求。目前认为，小于100µm的孔径不利于成骨细胞的长入，孔径直径在150-500µm最适宜矿化成骨。有文献报道，壳聚糖/羟基磷灰石复合生物支架的平均孔径为300µm左右，因此由于壳聚糖/羟基磷灰石复合生物支架的多孔性质，能够促进新生血管在基质中形成及纤维结缔组织的增生，并能容纳大量的成骨细胞，而且这些相通均匀的孔径在组织修复过程中有利于营养物质的运输，有利于组织的快速长入。近几年来，壳聚糖/羟基磷灰石人工骨生物支架材料的研究和应用受到了较多关注。评价复合支架材料是否能作为组织工程中骨组织替代材料的一个重要指标，是将种子细胞接种到复合支架材料上还能否维持促进其增殖活性。有研究表明，将大鼠成骨细胞在壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架表面培养，其增殖速度明显高于无支架材料组大鼠成骨细胞的增殖速度，壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架与骨髓间充质干细胞共培养有利于骨髓间充质干细胞的增殖和向成骨及软骨细胞的分化。但这种复合支架材料的体内降解过程并非十分清楚，而且其降解产物对成骨细胞的影响研究也较少，故实验从此处入手研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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