血管内皮生长因子混合Ⅰ型胶原修饰β-磷酸三钙多孔支架的血管化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.006

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (12): 1839-1845.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.006

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血管内皮生长因子混合Ⅰ型胶原修饰β-磷酸三钙多孔支架的血管化

陆梦漪¹，任毅²，胡万青³，桂源¹，张龙城²

1桂林医学院研究生学院，广西壮族自治区桂林市 541004
2解放军第三O三医院耳鼻咽喉-头颈外科，广西壮族自治区南宁市 530021
3马鞍山市人民医院耳鼻咽喉-头颈外科，安徽省马鞍山市 243000

修回日期:2014-03-03 出版日期:2014-03-19 发布日期:2014-03-19
通讯作者: 张龙城，主任医师，教授，解放军第三O三医院耳鼻咽喉-头颈外科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:陆梦漪，女，1987年生，四川省雅安市人，汉族，桂林医学院在读硕士，主要从事耳科学研究。

Vascularization of vascular endothelial growth factor and collagen I modified beta-tricalcium phosphate porous scaffolds

Lu Meng-yi¹, Ren Yi², Hu Wan-qing³, Gui Yuan¹, Zhang Long-cheng²

1Guilin Medical University Graduate School, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, the 303rd Hospital of PLA, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
3Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Maanshan Municipal People’s Hospital, Maanshan 243000, Anhui Province, China

Revised:2014-03-03 Online:2014-03-19 Published:2014-03-19
Contact: Zhang Long-cheng, Chief physician, Professor, Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, the 303rd Hospital of PLA, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Lu Meng-yi, Studying for master’s degree, Guilin Medical University Graduate School, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前听骨链重建仍是治疗传导性聋的重要方法，多种生物材料被应用于听骨链重建，但都忽略了听骨植入后的血液供应，更未形成真正意义的骨组织。
目的：观察经血管内皮生长因子混合Ⅰ型胶原修饰β-磷酸三钙多孔支架植入豚鼠听泡内的血管化效果。
方法：取豚鼠60只制作听泡内壁黏膜缺损创面，随机分组，实验组听泡内植入经血管内皮生长因子混合Ⅰ型胶原修饰的β-磷酸三钙多孔支架，对照组植入Ⅰ型胶原修饰的β-磷酸三钙多孔支架，空白对照组植入β-磷酸三钙多孔支架，植入后1，2，3，4周扫描电镜观察支架表面情况，苏木精-伊红及免疫组织化学染色观察支架内血管生成情况，甲苯胺蓝染色观察支架内新骨生成。
结果与结论：实验组植入1周后内皮细胞大量生长，血管管腔形成，3周时达血管生长高峰并可见微孔间交通支形成；另两组2周时可见血管管腔形成，但无微孔间交通支形成，且实验组各时间段血管计数均高于对照组和空白对照组(P < 0.05)。3组支架表面及微孔内细胞黏附生长，形态基本一致。植入4周时实验组支架内成骨较其他两组明显。表明经血管内皮生长因子混合Ⅰ型胶原修饰的β-磷酸三钙多孔支架在豚鼠中耳环境中能够有效实现血管化，促进支架内新骨形成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 多孔支架, β-磷酸三钙, 血管内皮生长因子, Ⅰ型胶原, 血管化, 硬组织切片

Abstract:

BACKGROUND: The auditory ossicle chain reconstruction is still an important method to treat conductive deafness. Although a great variety of materials have been applied, the blood supply of otosteon after the implantation is ignored. Moreover, there is no real bone formed.
OBJECTIVE: To observe the angiogenesis of vascular endothelial growth factor and collagen I modified β-tricalcium phosphate porous scaffold which is implanted into the otocyst of guinea pig.
METHODS: Totally 60 guinea pigs were randomly divided into experimental group (vascular endothelial growth factor and collagen I modified β-tricalcium phosphate porous scaffold), collagen I control group (collagen I modified β-tricalcium phosphate porous scaffold) and blank control group (β-tricalcium phosphate porous scaffold). The guinea pigs were executed under anesthesia at weeks 1, 2, 3, 4 respectively. The surface of scaffolds was observed by scanning electron microscopy. The angiogenesis of scaffolds were observed by hematoxylin-eosin staining and CD34 immunohistochemistry staining, and then the microvascular density was counted. The osteogenesis of the scaffolds was observed by toluidine blue staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Endothelial cell proliferation and lumen formation could be observed after 1 week in the experimental group, and the angiogenesis reach the peak after 3 weeks with traffic branches formedbetween micropores. In the other two groups, the lumen formed at 2 weeks but no traffic branches were visible. The sprouting of new blood vessels in the pores were observed more in the experimental group than the other two groups (P < 0.05). The adherence and proliferation of cells could be examined in the surface and pores of the scaffold by scanning electron microscope. After 4 weeks, the osteogenesis could be observed by toluidine blue staining, especially in the experimental group. These findings suggest that the vascular endothelial growth factor and collagen I modified β-tricalcium phosphate porous scaffold can realize an effective vascularization in the environment of guinea pigs’ middle ear. What’s more, the scaffold also can promote bone formation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: tissue scaffolds, ceramics, calcium phosphates, vascular endothelial growth factors, collagen type I, neovascularization, physiologic

中图分类号:

R318

陆梦漪，任毅，胡万青，桂源，张龙城. 血管内皮生长因子混合Ⅰ型胶原修饰β-磷酸三钙多孔支架的血管化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(12): 1839-1845.

Lu Meng-yi, Ren Yi, Hu Wan-qing, Gui Yuan, Zhang Long-cheng . Vascularization of vascular endothelial growth factor and collagen I modified beta-tricalcium phosphate porous scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(12): 1839-1845.

图/表（结果） 5

2.1 β-磷酸三钙多孔支架大体形态及表面扫描电镜观察 植入后1周时，各组支架与听泡内骨壁贴合良好，无明显移位及脱落，听泡内无化脓及肉芽增生，植入物部分表面可见少量黏液覆盖，用枪状镊拨动植入物，植入物可移动。植入后2周，各组听泡内支架固定良好，听泡内无化脓及肉芽增生，植入物表面可见部分粘膜样物覆盖，拨动植入物，可移动。植入后3周，各组听泡内支架固定，听泡内无明显感染，植入物表面可见部分黏膜覆盖，植入物与听泡内骨壁接触面连接较1周和2周时紧密。植入后4周，各组听泡内支架位置固定，听泡内无明显感染，植入物表面可见黏膜覆盖，植入物与听泡内骨壁接触面连接较为紧密，用枪状镊不能轻易拨动。扫描电镜下显示，各组支架在各时间段表面结构基本一致，植入物表面及支架孔隙内可见细胞黏附生长，部分孔隙被纤维样物及细胞团块覆盖(图1)。

2.2 苏木精-伊红染色组织学观察 植入1周后，各组均可见支架微孔内血管内皮细胞与成纤维细胞生长，无明显炎性及排异反应，实验组血管内皮细胞更为密集，局部可见管腔形成，其余组未见明显管腔；植入2周后，各组血管内皮细胞密度进一步增大，实验组可见微孔内血管呈出芽状生长，其余组可见大量血管内皮细胞与成纤维细胞，可观察到管腔形成；植入3周后，实验组血管生长达到高峰，半数以上微孔内可见生成的血管管腔，内皮细胞密集，呈条索状排列，部分微孔之间可观察到微血管交通支形成，对照组与空白对照组均可见部分血管管腔形成，无微孔间交通支；植入4周后，各组仍可见血管管腔，实验组仍可见微孔间血管交通支，但内皮细胞及微血管数目减少(图2)。

2.3 CD34免疫组织化学染色及微血管计数 免疫组织化学染色后可见血管内皮细胞的细胞核及胞膜为棕黄色，微孔内血管腔形成，管壁着色。各组1周时支架微孔内均可见大量血管内皮细胞，实验组可见血管管腔形成；2周时各组微孔内内皮细胞进一步增多，均可见血管管腔；3周时各组血管内皮细胞及血管管腔较2周进一步增多；4周时微孔内血管内皮细胞密度减小(图3)。

2.4 β-磷酸三钙微孔支架的成骨效应 植入后4周实验组可见β-磷酸三钙支架部分降解，与其余两组比较，孔隙边缘着色更明显，支架内可见部分骨生成，孔隙边缘及孔隙间可见新骨形成(图4)。

2.5 统计学分析 实验组各时间段血管计数高于另两组(P < 0.05)，对照组各时间段血管计数与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。绘制各组血管生长趋势线形图(图5)，可见实验组早期血管数目呈增长趋势，在第3周左右达到最高峰，随后出现衰减；其余两组在早期血管数目也有增长，但增长幅度远小于实验组，且出现衰减的时间也早于实验组；空白对照组较对照组衰减更快。

参考文献

[1] Bojrab DI,Causse JB,Battista RA,et al.Ossiculoplasty with composite prostheses: Overview and analysis.Otolaryngol Clin North Am.1994;27(4):759-776.

[2] Seebach C,Henrich D,Kähling C,et al.Endothelial progenitor cells and mesenchymal stem cells seeded onto beta-TCP granules enhance early vascularization and bone healing in a critical-sized bone defect in rats.Tissue Eng Part A.2010;16(6): 1961-1970.

[3] 钱成雄,叶毓粦,吴坤南,等.生物陶瓷(β-TCP人工骨)治疗四肢骨折22例临床研究[J]. 中国当代医药,2010,17(10):37-38.

[4] 陈仁吉,丁雯,穆玥,等.β-磷酸三钙用于牙槽嵴裂骨缺损修复的临床研究[J].北京口腔医学,2012,20(3):154-157.

[5] Shinohara T,Gyo K,Saiki T,et al.Ossiculoplasty using hydroxyapatite prostheses: long-term results.Clin Otolaryngol Allied Sci.2000;25(4):287-292.

[6] Chen J,Yang L,Guo L,et al.Sodium hyaluronate as a drug-release system for VEGF 165 improves graft revascularization in anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model. Exp Ther Med.2012;4(3):430-434.

[7] Weidner N,Folkman J,Pozza F,et al.Tumor angiogenesis:a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma. J Natl Cancer Inst. 1992; 84(24):1875-1887.

[8] Brackmann DE,Sheehy JL.Tympanoplasty: ToRps and PoRps.Laryngoscope. 1979;89(1):108-114.

[9] Okuda T,Ioku K,Yonezawa I,et al.The effect of the microstructure of beta-tricalcium phosphate on the metabolism of subsequently formed bone tissue. Biomaterials. 2007;28(16):2612-2621.

[10] Han XY,Zhang FQ,Fu YF,et al.Fabrication and physical properties of porous individual beta-TCP scaffold to reconstruct residual alveolar ridge in dog. Shanghai Kou Qiang Yi Xue.2008;17(1):51-54.

[11] Castilho M,Moseke C,Ewald A,et al.Direct 3D powder printing of biphasic calcium phosphate scaffolds for substitution of complex bone defects. Biofabrication. 2014;6(1):015006.

[12] Doyle H,Lohfeld S,McHugh P.Predicting the Elastic Properties of Selective Laser Sintered PCL/β-TCP Bone Scaffold Materials Using Computational Modelling. Ann Biomed Eng. 2014;42(3):661-677.

[13] Kang Y,Scully A,Young DA,et al.Enhanced mechanical performance and biological evaluation of a PLGA coated beta-TCP composite scaffold for load-bearing applications. Eur Polym J.2011;47(8):1569-1577.

[14] Lou CW,Yao CH,Chen YS,et al.PLA/beta-TCP Complex Tubes: The Mechanical Properties and Applications of Artificial Bone.J Biomater Sci Polym Ed.2011.

[15] Lindhorst D,Tavassol F,Von See C,et al.Effects of VEGF loading on scaffold-confined vascularization.J Biomed Mater Res A.2010;95(3):783-792.

[16] Crouzier T, Sailhan F, Becquart P,et al.The performance of BMP-2 loaded TCP/HAP porous ceramics with a polyelectrolyte multilayer film coating. Biomaterials. 2011;32(30):7543-7554.

[17] Omata K,Matsuno T,Asano K,et al.Enhanced bone regeneration by gelatin-beta-tricalcium phosphate composites enabling controlled release of bFGF. J Tissue Eng Regen Med.2012.

[18] Bai Y,Leng Y,Yin G,et al.Effects of combinations of BMP-2 with FGF-2 and/or VEGF on HUVECs angiogenesis in vitro and CAM angiogenesis in vivo. Cell Tissue Res. 2014. [Epub ahead of print]

[19] Nillesen ST,Geutjes PJ,Wismans R,et al.Increased angiogenesis and blood vessel maturation in acellular collagen-heparin scaffolds containing both FGF2 and VEGF. Biomaterials.2007;28(6):1123-1131.

[20] Kang Y,Kim S,Bishop J,et al.The osteogenic differentiation of human bone marrow MSCs on HUVEC-derived ECM and beta-TCP scaffold.Biomaterials.2012;33(29):6998-7007.

[21] Todo M,Arahira T.In vitro bone formation by mesenchymal stem cells with 3D collagen/beta-TCP composite scaffold.Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc.2013;2013: 409-412.

[22] Sakakibara Y,Nishimura K,Tambara K,et al.Prevascularization with gelatin microspheres containing basic fibroblast growth factor enhances the benefits of cardiomyocyte transplantation.J Thorac Cardiovasc Surg.2002;124(1):50-56.

[23] Springer ML,Chen AS,Kraft PE,et al.VEGF gene delivery to muscle: potential role for vasculogenesis in adults.Mol Cell. 1998;2(5):549-558.

[24] Peng LH,Wei W,Qi XT,et al.Epidermal Stem Cells Manipulated by pDNA-VEGF165/CYD-PEI Nanoparticles Loaded Gelatin/beta-TCP Matrix as a Therapeutic Agent and Gene Delivery Vehicle for Wound Healing. Mol Pharm. 2013; 10(8):3090-3102.

[25] Yang P,Huang X,Wang C,et al.Repair of bone defects using a new biomimetic construction fabricated by adipose-derived stem cells, collagen I, and porous beta-tricalcium phosphate scaffolds. Exp Biol Med (Maywood). 2013;238(12):1331-1343.

[26] Schonfeldt C,Bossmann K.Eine methacrylatein bettung zur histologischen untersuchung entalkter wieauch unentkalkter praparate von zahnen mit ungebendem parodont. Dtsch Zahnatztel Z.1982;35(1):79-89.

[27] 李林.多孔生物陶瓷支架的组织学性能和力学性能表征[D].西南交通大学,2013.

[28] 孟志兵,唐月军,郭军,等.纳米增韧HA-ZrO_2生物陶瓷与骨缺损断面的结合性能观察[J].口腔颌面外科杂志,2013, 23(4):253-256.

引言

20世纪50年代初，Wullstein与Zollner首次共同提出了鼓室成形并进行了听骨链的重建^[1]。至此，听骨链重建仍是治疗先天性与继发性传导性耳聋的重要方法。目前临床上常用的听骨链重建材料有自体骨、钛假体及羟基磷灰石等。磷酸三钙与羟基磷灰石一样也属于钙磷酸盐陶瓷，它是一种骨再生材料，当其植入机体后，材料表面的钙离子与磷离子可形成与骨成分类似的磷酸钙盐，因此具备良好的生物相容性与骨诱导性。磷酸三钙有α与β两种形式，但β-磷酸三钙更易塑形，且在力学强度上优于α-磷酸三钙，其在机体内环境和常温下具有动态热稳定性，降解更快。 β-磷酸三钙作为一种可完全降解的生物陶瓷，在水溶液或体液中的溶解度是羟基磷灰石的10-15倍，其降解率远大于羟基磷灰石，在机体内可逐渐被降解，随之被新生组织替代，这一特性更利于植入后细胞响应，血管形成，而它的降解产物Ca与P可再形成新骨。

目前β-磷酸三钙已被广泛应用于组织工程研究及临床中。Seebach等^[2]用种植了内皮祖细胞和间充质干细胞的β-磷酸三钙颗粒植入CSD无胸腺大鼠体内1，4，8周，结果显示支架早期血管化显著提高，在4周时可见骨形成显著增加，移植8周后可观察到大量骨桥形成。可见内皮祖细胞和间充质干细胞协同增强了β-磷酸三钙颗粒的成骨及血管化效应，促进骨愈合及修复重塑过程。在临床中其主要被应用于骨科、口腔科、颌面外科等领域。钱成雄等^[3]采用β-磷酸三钙人工骨治疗四肢骨折患者，术后随访3-20个月，X射线检查及血液检验证实β-磷酸三钙可促进新骨生长及骨折愈合，其降解过程对机体无不良反应。陈仁吉等^[4]采用β-磷酸三钙颗粒修复牙槽嵴裂，结果显示人工β-磷酸三钙颗粒材料与自体骨的成骨效应无明显差异，可作为自体骨的替代材料。在听骨链重建方面，羟基磷灰石已成为目前临床上运用最多的听骨贋复物材料之一，但植入后的排出率仍在2.6%-16%^[5]，究其根本是由于该材料植入听骨后无血液供应，更未形成真正意义的骨组织。

血管内皮生长因子是目前已知最强的促血管生成因子，在骨修复重建中有显著作用。胶原是目前运用较广泛的生长因子缓释材料，它能让外源性生长因子在机体内缓慢释放，延长其作用时间^[6]。实验将血管内皮生长因子、Ⅰ型胶原与β-磷酸三钙结合起来，运用经血管内皮生长因子混合Ⅰ型胶原修饰的β-磷酸三钙多孔支架在豚鼠听泡内构建血管化，同时检测其成骨效应，为寻找更好的听骨贋复物复合材料做一初步探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：随机分组，动物实验观察。

时间及地点：于2012年12月至2013年9月在广西医科大学实验中心，解放军第三O三医院耳鼻咽喉-头颈外科实验室及病理科完成。

材料：

实验动物：二三月龄健康杂色豚鼠60只，雌雄不拘，体质量200-300 g，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK桂2009-0004。

支架材料：β-磷酸三钙多孔支架材料由四川大学生物材料工程研究中心制作，圆柱状，高2.5-3.0 mm，直径为2.5-3.0 mm，微孔孔径为100-300 μm。

实验方法：

血管内皮生长因子与Ⅰ型胶原复合涂层的制备：在超净工作台中将20 μg冻干人重组血管内皮生长因子165溶于4 mL无菌PBS中，再与0.2%I型胶原按等体积1∶1混合备用。

β-磷酸三钙多孔支架的修饰：将β-磷酸三钙多孔支架用无水乙醇处理1 h后用三蒸水处理36 h，每6 h换液1次，取出后用滤纸吸干表面水分。将每20个多孔β-磷酸三钙支架分别浸入Ⅰ型胶原与血管内皮生长因子混合液、0.2% Ⅰ型胶原、PBS中1 min制备血管内皮生长因子混合Ⅰ型胶原修饰的β-磷酸三钙多孔支架、Ⅰ型胶原修饰的β-磷酸三钙多孔支架及β-磷酸三钙多孔支架，自然风干24 h后再重复1次上述步骤。制备的支架植入前等离子消毒。

动物实验与分组：严格按无菌原则操作，称60只豚鼠体质量，用1%戊巴比妥钠按4 mL/kg腹腔注射麻醉，耳后脱毛，消毒、铺巾后做左侧耳后切口，钝性分离肌肉组织，暴露左耳听泡骨壁，耳科磨钻钻开听泡骨壁薄弱处，扩大骨壁开口至直径约为3.5 mm。用弯耳针搔刮听泡内壁黏膜，造成听泡内壁黏膜缺损创面，随机分为3组，每组20只，实验组听泡缺损创面植入血管内皮生长因子混合Ⅰ型胶原修饰的β-磷酸三钙多孔支架，对照组听泡缺损创面植入Ⅰ型胶原修饰的β-磷酸三钙多孔支架，空白对照组听泡缺损创面植入未经修饰的β-磷酸三钙多孔支架。将支架材料底部紧贴内壁缺损黏膜表面，塞入明胶海绵进行固定。用骨蜡封填破损的听泡骨壁，缝合皮下组织及皮肤。每组分别于植入后1，2，3，4周处死实验动物，每组每周处死5只，断头取出带有植入物的听泡。

大体形态及接触面扫描电镜观察：打开听泡一侧骨壁，首先观察植入物及听泡内大体形态与表面情况。取出听泡内植入物，100 g/L戊二醛固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷金后扫描电镜下观察植入物表面情况。

硬组织切片制作：取出标本后，用40 g/L多聚甲醛固定，真空自动脱水，浸润合成树脂包埋，分别使用低强度光源、高强度蓝光及过氧化苯甲酰聚合，机械钳固定后金刚石刀片切割标本，真空吸附固定后微磨抛光，光固化10 min，最终切磨成厚度 <10 μm的硬组织切片。

硬组织切片苏木精-伊红染色：丙酮-乙醇(1∶1)清洁载片表面，在苏木精中着色20 min，1%醋酸冲洗数秒，自来水冲洗10 min，在伊红中着色5 min，自来水冲洗，在体积分数80%乙醇中分化片刻，体积分数90%乙醇中快速蘸数秒，在二甲苯中快速蘸一下，盖上盖玻片，光镜下观察微孔内血管生成情况。

CD34免疫组化染色与微血管计数：用丙酮-乙醇 (1∶1)擦拭载片表面数分钟清除表面树脂，滴加体积分数0.3%过氧化氢溶液后在室温下静置10 min，PBS清洗3次，0.4%胃蛋白酶修复5 min，PBS清洗3次后滴加Ⅰ抗，室温静置2 h，PBS清洗3次，加入Ⅱ抗，室温孵育2 h，PBS清洗3次，DAB显色10 min，PBS清洗3次终止反应，梯度乙醇脱水后封固。

光镜下观察微血管及血管内皮细胞生长情况，并参照Weidner等^[7]的血管计数法进行微血管计数，每一个标本在10×低倍镜下选取3个微血管数较多的区域，再在40×高倍镜下行血管计数，最后取平均值得出该标本新生血管数。

甲苯胺蓝染色：由于骨生成的时间较血管生成晚，一些豚鼠听泡内成骨方面的研究多在1个月后检测到结果，因此选取植入4周为检测点，更大可能地检测到支架成骨效应。再继续深入探讨该因子的成骨效应时还将延长检测时间。丙酮-乙醇(1∶1)清洁载片，在体积分数为30%的过氧化氢溶液中摇动5 min，自来水充分冲洗数分钟，甲苯胺蓝染色剂着色15 min，自来水冲洗数分钟，梯度乙醇脱水后干燥载片，封固并光镜下观察β-磷酸三钙多孔支架成骨情况。

主要观察指标：各组支架表面情况，支架内血管生成情况及新骨生成。

统计学分析：运用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。用一般线性模型的重复测量方差分析对数据进行分析，用Multivariate过程实现组间的两两比较。结果以x(_)±s表示。组间比较检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

20世纪70年代，Brackmann等^[8]将多孔聚乙烯结合自体软骨运用于听骨链重建，至今听骨贋复物被广泛应用于临床已有近40年的历史，近年来随着组织工程技术及耳显微外科的快速发展，涌现出许多听骨贋复物材料，如金属材料、高分子材料及生物陶瓷材料。不论是何种材料的听骨贋复物，都应当具备良好的生物相容性及长期稳定性，应确保对人体无不良反应，无排斥反应，具备与骨相当的硬度，易成型。同时还应具有声音传导性与长期稳定性，不易脱出和吸收。β-磷酸三钙与羟基磷灰石这一类Ca-P陶瓷属于表面活性生物陶瓷，植入机体后其表面的钙离子与磷离子最终会形成磷酸钙盐，这是一种类骨磷灰石，因此具备良好的生物相容性与骨诱导性，这类陶瓷能够吸附生长因子，为骨组织生长提供空间支持，为骨缺损修复或作为涂层材料。β-磷酸三钙具有降解快、易塑形的优点，通过控制其多孔结构能够获得满意的降解性能，这一特点更加利于新生骨和血管长入。Okuda等^[9]将多孔β-磷酸三钙杆状颗粒与羟基磷灰石植入家兔股骨中，结果显示β-磷酸三钙材料可吸收，而羟基磷灰石不可吸收，植入第12周后，β-磷酸三钙植入组有令人满意的新骨形成，植入第24周时β-磷酸三钙材料基本降解。β-磷酸三钙主要通过体液介导溶解与细胞介导降解。目前多孔β-磷酸三钙支架已被广泛运用于骨修复及血管化研究中^[10]。但β-磷酸三钙也存在一些缺点，如其机械强度与耐冲击力较弱，具有一定的脆性。

近年来，研究者们越来越多的将β-磷酸三钙与其他材料进行复合，从而改变β-磷酸三钙的这一特性。如羟基磷灰石/β-磷酸三钙双相磷酸钙陶瓷增加了支架的机械强度。Castilho等^[11]将羟基磷灰石/β-磷酸三钙双相陶瓷通过3D打印技术运用于复杂骨缺损的修复。也有研究者将β-磷酸三钙与一些可降解类聚酯纤维制作成复合支架以增加其韧性^[12-14]。

另外，随着组织工程学的发展，生长因子及联合细胞培养的应用逐渐成为生物陶瓷支架血管化与成骨研究的一个重要方面。血管内皮生长因子是目前已知最强的内皮细胞有丝分裂原，如今已被广泛应用于生物陶瓷支架血管化研究中。Lindhorst等^[15]将载入血管内皮生长因子的β-磷酸三钙及多孔聚乙烯支架植入小鼠背部，研究其血管化效应，结果显示载入血管内皮生长因子的β-磷酸三钙支架在同等条件下较多孔聚乙烯支架更能促进血管生成。其他生长因子，如骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β等也被运用于生物陶瓷支架的血管化与骨化研究中^[16-17]。有许多研究表明多生长因子的综合运用较单一因子的运用有着更佳的血管化和成骨效应^[18-19]。目前，联合细胞培养的运用也成为生物陶瓷支架的研究热点。例如有研究证明以人脐静脉内皮细胞为基质的β-磷酸三钙支架能够促进人骨髓干细胞的骨向分化^[20]。此外，干细胞因其良好的分化增殖特性也被广泛关注，Todo等^[21]研究了载入间充质干细胞的三维胶原蛋白/β-磷酸三钙复合支架骨形成，结果显示这种支架的弹性得到了增加，且能促进细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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实验结果表明植入物植入一段时间后，新生血管会出现不同程度的衰减，实验组在第4周开始出现较明显的血管减少，这与生长因子无法保持长期持续稳定释放有着一定的关系。血管内皮生长因子等生长因子在无任何保护或调控的情况下会在机体中迅速代谢^[22]，而生长因子大量释放则会生成大量畸形且无功能的血管^[23]。生长因子的缓释在生物陶瓷支架血管化与骨化过程中十分关键，它直接影响支架血管化与骨生成的最终结果。研究者们在缓释方法上做了大量研究，目前的主要方法是用一些可降材料对支架复合体进行包裹或涂层，这些材料

有胶原蛋白、透明质酸钠、明胶等^[6,24-25]。它们与支架复合后，均不同程度延长了因子的作用时间，增强了支架的生物学效应。实验中空白对照组比对照组衰减更快，这或与Ⅰ型胶原的保护作用有关。虽然目前已有众多缓释方法，但缓释效果仍难以控制，在今后的研究中，是否能找到一种更长期高效的缓释方法，以满足生长因子作用到支架完全降解且被自体组织替代，仍需要不断的研究和探索。

在结果检测方面，实验在组织学检测上采用硬组织切片。不脱钙硬组织切片技术于1982年被提出^[26]，至今已经得到了大量的改良与发展，它能够不破坏支架与骨组织的结构和成分，保持植入体与骨界面的结构，组织形态学观察时组织结构与成分不失真，可直观反映接触面生长结合情况。目前硬组织切片技术已被广泛应用于各种仿生支架的研究中^[27-28]。生物陶瓷支架在普通石蜡切片过程中易变形、碎裂，硬组织切片技术可避免这一缺点。然而硬组织切片相对较厚，易掉片，残留树脂易影响组织着色且成本较普通石蜡切片高，因此在组织学染色上并无明显优势，但其在保持支架与骨组织结构完整性上有着不可替代的优势。相信随着硬组织切片技术的不断改进，染色等问题在不久的将来都能逐一得以解决。

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20世纪70年代，Brackmann等将多孔聚乙烯结合自体软骨运用于听骨链重建，至今听骨贋复物被广泛应用于临床已有近40年的历史，近年来随着组织工程技术及耳显微外科的快速发展，涌现出许多听骨贋复物材料，如金属材料、高分子材料及生物陶瓷材料。不论是何种材料的听骨贋复物，都应当具备良好的生物相容性及长期稳定性，应确保对人体无不良反应，无排斥反应，具备与骨相当的硬度，易成型。同时还应具有声音传导性与长期稳定性，不易脱出和吸收。β-磷酸三钙与羟基磷灰石这一类Ca-P陶瓷属于表面活性生物陶瓷，植入机体后其表面的钙离子与磷离子最终会形成磷酸钙盐，这是一种类骨磷灰石，因此具备良好的生物相容性与骨诱导性，这类陶瓷能够吸附生长因子，为骨组织生长提供空间支持，为骨缺损修复或作为涂层材料。β-磷酸三钙具有降解快、易塑形的优点，通过控制其多孔结构能够获得满意的降解性能，这一特点更加利于新生骨和血管长入。Okuda等将多孔β-磷酸三钙杆状颗粒与羟基磷灰石植入家兔股骨中，结果显示β-磷酸三钙材料可吸收，而羟基磷灰石不可吸收，植入第12周后，β-磷酸三钙植入组有令人满意的新骨形成，植入第24周时β-磷酸三钙材料基本降解。β-磷酸三钙主要通过体液介导溶解与细胞介导降解。目前多孔β-磷酸三钙支架已被广泛运用于骨修复及血管化研究中。但β-磷酸三钙也存在一些缺点，如其机械强度与耐冲击力较弱，具有一定的脆性。近年来，研究者们越来越多的将β-磷酸三钙与其他材料进行复合，从而改变β-磷酸三钙的这一特性。如羟基磷灰石/β-磷酸三钙双相磷酸钙陶瓷增加了支架的机械强度。Castilho等将羟基磷灰石/β-磷酸三钙双相陶瓷通过3D打印技术运用于复杂骨缺损的修复。也有研究者将β-磷酸三钙与一些可降解类聚酯纤维制作成复合支架以增加其韧性。

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血管内皮生长因子混合Ⅰ型胶原修饰β-磷酸三钙多孔支架的血管化

Vascularization of vascular endothelial growth factor and collagen I modified beta-tricalcium phosphate porous scaffolds

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[1]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[2]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[3]	徐晓明, 陈艳, 宋倩, 袁露, 顾加明, 张丽娟, 耿洁, 董坚. 人胎盘间充质干细胞凝胶促进SD大鼠放射性皮肤损伤的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3976-3980.
[4]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.
[5]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[6]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[7]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[8]	张辉, 王少华, 王茜, 王辉, 甘洪全, 崔逸爽, 李琪佳, 王志强. RGD多肽修饰多孔钽可激活MG63细胞整合素/黏着斑激酶信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2535-2540.
[9]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[10]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[11]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[12]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[13]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.
[14]	贾巍, 张满栋, 陈维毅, 王晨艳, 郭媛. 股骨假体材料对人工膝关节置换性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1477-1481.
[15]	王倩, 李璐, 舒静媛, 董志恒, 靳友士, 王青山. 氧化锆基纳米羟基磷灰石功能梯度生物材料的微观形貌和物相分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1517-1521.