1.1 设计 静电纺丝膜的制备与表征，体外细胞实验，动物实验。
1.2 时间及地点 实验于 2024年6-10 月在苏州大学骨研所力学材料实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料、试剂与仪器
材料： 聚醚碳酸酯脲(上海源叶生物科技股份有限公司)；纳米羟基磷灰石(上海源叶生物科技股份有限公司)。
试剂：胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素+链霉素(Gibco，美国)；DAPI(Beyotime，中国)；细胞毒性检测试剂盒(Beyotime，中国)；鬼笔环肽染色试剂盒、茜素红染液(源叶，中国)；CCK-8工作液(新赛美，中国)；BCIP-NBT碱性磷酸酶显色液、碱性磷酸酶检测试剂盒(上海碧云天生物技术股份有限公司，中国)；氯代十六烷基吡啶溶液(麦克林试剂，中国)；六氟异丙醇(上海阿拉丁试剂有限公司)；戊巴比妥钠(上海隆盛化工有限公司)；成骨诱导培养基、α-MEM培养基(上海源培生物科技股份有限公司)；苏木精-伊红、中性树脂(美国 Sigama Aldrich 公司)；多聚甲醛(中国碧云天公司)；脱钙液(中国索莱宝公司)；Msson染色试剂盒(中国源叶公司)；碘伏消毒液(中国索莱宝公司)。
仪器：扫描电子显微镜(FESEM，美国)；EVOS倒置荧光显微镜(AMG，美国)；水接触角测量仪(Data Physsics，美国)；静电纺丝机(高压直流电源来源于天津东文高压电源厂，微量注射泵来源于保定精工泵业有限公司)；Micro-CT(德国布鲁克公司)；Zeiss Axiovert 40CFL显微镜(Zeiss，Oberkochen，德国)；酶标仪(Molecular Devices，美国)；高压灭菌锅(中国八金有限公司)；高压汞灯电源(上海季光特种照明电器厂)；细胞培养箱(美国THERMO公司)；4 ℃冰箱(日本松下)；-80 ℃超低温冰箱(日本SANYO)；电子天平(北京赛多丽斯)；等离子体原子发射光谱仪(美国Varian公司)。
1.3.2 实验动物 健康雄性SD大鼠30只，6-8周龄，体质量(200±50) g，SPF级，购自苏州大学实验动物中心，许可证号：SYXK(苏)2021-0065。喂养在 25 ℃和50%湿度的清洁通风环境中。实验方案已通过青海省人民医院伦理委员会批准[伦理号：科研伦审(2023)-262]。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的提取 参考文献[9]中的方法分离提取大鼠骨髓间充质干细胞。取8周龄雄性SD大鼠3只，腹腔注射过量戊巴比妥麻醉后处死，剔除后肢腿部毛发，取出完整的股骨，剔除周围肌肉，使用无菌剪刀剪开股骨近端和远端骨质髓腔，用注射器冲洗股骨髓腔，每个股骨冲洗3遍，将骨髓液最后转入37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。首次3 d后换液，之后每 2 d换一次液。后续实验使用第2代细胞。
选取生长状况优良的第2代大鼠骨髓间充质干细胞，以3×105/孔的密度接种于12孔板，当细胞长满约60%时将培养基替换为专门的三系分化诱导液，分别进行茜素红、油红O和蕃红O染色，检测细胞的多向分化潜能。
1.4.2 静电纺丝液的配制
静电纺丝液的制备：称取0.450 g聚醚碳酸酯脲置于玻璃瓶中，加入2 mL六氟异丙醇磁力搅拌12 h，得到聚醚碳酸酯脲静电纺丝液；称取0.09 g纳米羟基磷灰石加入聚醚碳酸酯脲静电纺丝液中，磁力搅拌12 h，得到纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲静电纺丝液。
静电纺丝膜的制备：取聚醚碳酸酯脲静电纺丝液、纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲静电纺丝液，分别进行纺丝，连接好电源和接收滚轴，调整纺丝参数至适宜范围后启动纺丝机进行纺丝操作：使用5 mL注射器吸入2 mL静电纺丝液， 接上粗细大小为18 G的针头，电压12 kV，溶液流速1 mL/h，转轴与注射器针头之间的距离为15 cm，将铝箔固定在转轴上，转轴速率1 200 r/min。纺制结束之后，将收集到的静电纺丝膜放入真空干燥箱内室温真空干燥7 d，分别得到聚醚碳酸酯脲静电纺丝膜与纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲静电纺丝膜，置于干燥器内储存备用。
支架的构建：将静电纺丝膜切成矩形条(长 8 cm，宽 1 cm)，将上下2条膜进行斜交层叠，用5 mm消毒的打孔器制备成5 mm×1 mm的圆形支架，紫外照射灭菌。将2×104 个大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于两种支架表面，待细胞贴壁后用于动物实验。
1.4.3 静电纺丝膜的性能检测
扫描电镜观察：将两种静电纺丝膜风干、去除表面水分，裁成小圆片，放置在载物台，用导电胶黏附表面进行喷金处理，利用扫描电镜观察表面形态。采集图像后，用Image J软件测量纤维直径(n=50)。
水接触角检测：将0.25 μL去离子水分别滴在两种静电纺丝膜表面，2 s后拍摄水滴与支架之间的角度照片，使用接触角测试仪检测水接触角；对两种静电纺丝膜进行等离子体处理1 min，将0.25 μL去离子水分别滴在两种静电纺丝膜表面，2 s后拍摄水滴与支架之间的角度照片，使用接触角测试仪检测水接触角。
1.4.4 静电纺丝膜的生物相容性检测
活死染色：将大鼠骨髓间充质干细胞接种于24孔板内，细胞密度为2×104 /孔，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。观察细胞贴壁后分3组处理：对照组不加入任何材料，聚醚碳酸酯脲组和纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲组分别加入对应的静电纺丝膜共培养。培养5 d后用PBS清洗，进行活死染色，置于37 ℃下孵育30 min，用PBS轻轻冲洗以去除未结合的染料，置于荧光显微镜下观察。
骨架染色：将大鼠骨髓间充质干细胞接种于24孔板内，细胞密度为2×104 /孔，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。观察细胞贴壁后分3组处理：对照组不加入任何材料，聚醚碳酸酯脲组和纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲组分别加入对应的静电纺丝膜共培养。培养 3 d后用PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定45 min，吸去多聚甲醛后用PBS清洗；根据鬼笔环肽染色试剂盒说明书进行染色，置于37 ℃
孵育1 h，用PBS轻轻冲洗以去除未结合的染料，用DAPI染细胞核，置于荧光显微镜下观察。
CCK-8检测：将大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于96孔板内，细胞密度为7×103/孔，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。观察细胞贴壁后分3组处理：对照组不加入任何材料，聚醚碳酸酯脲组和纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲组分别加入对应的静电纺丝膜共培养。培养第1，3，5天，吸弃原培养基，每孔加入100 μL含CCK-8的培养基(CCK-8∶培养基=1∶10)，轻轻摇匀后放回培养箱中继续培养2 h，使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值。
EdU染色：将大鼠骨髓间充质干细胞接种于24孔板内，细胞密度为2×104 /孔，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。观察细胞贴壁后分3组处理：对照组不加入任何材料，聚醚碳酸酯脲组和纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲组分别加入对应的静电纺丝膜共培养。培养7 d后，按照EdU染色试剂盒使用说明书进行EdU染色，置于倒置显微镜下观察细胞增殖情况。采集图像后，使用Image J软件统计EdU标记阳性细胞数增殖比例。
1.4.5 静电纺丝膜支架体外促成骨性能检测
碱性磷酸酶染色：将大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于6孔板内，细胞密度为1×105/孔，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。观察细胞贴壁后更换为成骨诱导培养基，分3组处理：对照组不加入任何材料，聚醚碳酸酯脲组和纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲组分别加入对应的静电纺丝膜共培养，隔天换液1次。成骨诱导培养7 d后，用PBS轻轻冲洗3次，每次5 min；加入40 g/L多聚甲醛于37 ℃固定15 min，用PBS冲洗3次，每次5 min；按照碱性磷酸酶染色试剂盒说明书配制碱性磷酸酶染色工作液，将支架浸入工作液中于37 ℃孵育1.0-2.0 h，用蒸馏水冲洗3次，每次5 min，置于光学显微镜观察并拍照。拍照完成后，在样品中加入BCIP-NBT 碱性磷酸酶显色液于37 ℃孵育1 h，加入终止液(如NaOH)停止反应，在405 nm波长处测定吸光度值，计算碱性磷酸酶活性。
茜素红染色：将大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于6孔板内，细胞密度为1×105/孔，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。观察细胞贴壁后更换为成骨诱导培养基，分3组处理：对照组不加入任何材料，聚醚碳酸酯脲组和纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲组分别加入对应的静电纺丝膜共培养，隔天换液1次。成骨诱导培养21 d后，用PBS轻轻冲洗3次，每次5 min，加入40 g/L多聚甲醛固定液于37 ℃固定15 min，用PBS冲洗3次，每次5 min；浸入0.1%茜素红S溶液中室温下染色15-30 min，用蒸馏水冲洗3次，每次5 min，置于光学显微镜察并拍照记录。拍照完毕后将孔内液体吸干，每孔加入1 mL 10%氯代十六烷基吡啶溶液于室温下孵育15 min，每孔吸取150 μL溶液至96孔板，利用酶标仪在425 nm波长处测定吸光度值，评估细胞的矿化能力。
1.4.6 静电纺丝膜支架的体内成骨性能检测
颅骨缺损模型的建立：采用随机数字表法将27只 SD 大鼠随机分为对照组(n=9)、聚醚碳酸酯脲组(n=9)、纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲组(n=9)。腹腔注射戊巴比妥麻醉大鼠，术区备皮、消毒及铺洞巾，切开皮肤、皮下，分离骨膜，充分暴露大鼠颅骨，使用电钻制备一个直径为5 mm 的颅骨全层缺损，术中保持脑膜完整性，防止破裂，对照组不植入任何材料，聚醚碳酸酯脲组、纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲组分别植入聚醚碳酸酯脲-大鼠骨髓间充质干细胞支架、纳米羟基磷灰石-聚醚碳酸酯脲-大鼠骨髓间充质干细胞支架，逐层间断缝合骨膜、皮下组织、皮肤，无菌敷料包扎。
取材：术后8周，过量吸入二氧化碳后处死所有大鼠，利用手术刀片将颅骨皮肤切开，找到颅骨缺损的部位，完整取出颅骨，置于甲醛溶液中固定24 h。
Micro-CT分析：取出固定后的颅骨标本，使用高分辨率Micro-CT进行扫描，使用Skyscan软件对扫描数据进行重建，通过CTAn、NRecon 软件分析骨体积、骨体积/组织体积与骨小梁厚度。
颅骨标本的病理组织学观察：将固定后的颅骨标本用PBS冲洗，放进装有脱钙液的离心管内，置于振动摇床上进行脱钙，每3 d更换一次脱钙液，待脱钙完全后进行脱水处理，放进包埋盒内依次经过不同浓度乙醇进行梯度脱水，二甲苯透明处理后包埋，利用石蜡切片机进行切片(切片厚度为6 μm)，利用黏附载玻片捞取样本，进行烤片处理，分别进行苏木精-伊红染色与Masson染色。①苏木精-伊红染色：把石蜡切片放进烘箱将石蜡融化，温度60 ℃、时间 1 h，将融化的切片在二甲苯里浸泡30 min脱蜡；经梯度乙醇水化，苏木精染色5 min后水洗2遍，盐酸乙醇溶液分化10 s后水洗2遍，用PBS 洗30 s；伊红染色3 min后水洗 3 遍(每遍 10 s)，梯度乙醇脱水处理后二甲苯透明处理5 min。②Masson染色：将石蜡切片脱蜡至水，用苏木精染色液染色5 min；用酸性乙醇分化液分化10 s，水洗3遍，使用 Masson蓝化液染色5 min，去离子水洗1 min；使用丽春红品红染色液染色8 min，用弱酸工作液清洗1 min，磷钼酸溶液清洗 2 min，直接放入苯胺蓝染色液中染色2 min，用弱酸工作液洗1 min，中性树胶封固。
1.5 主要观察指标 两种静电纺丝膜的微观形态、水接触角与体外生物相容性、促成骨分化能力，以及动物体内促成骨分化能力。
1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，各项数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经苏州大学附属第一医院生物统计学专家审核。
