含Cu2+医用镁合金微弧氧化功能涂层的制备及抗肿瘤、促血管形成效应

doi:10.12307/2026.330

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (20): 5103-5114.doi: 10.12307/2026.330

• 组织工程血管材料 tissue-engineered vascular materials • 上一篇下一篇

含Cu2+医用镁合金微弧氧化功能涂层的制备及抗肿瘤、促血管形成效应

林科建1，柴应红2，邹杰1，黄蕊欣3，方永超3，黄警4，杨沁1，罗霞2，张红1

1成都医学院第一附属医院烧伤整形外科，四川省成都市 610599；2西南石油大学新能源与材料学院，四川省成都市 610500；3成都医学院药学院，四川省成都市 610500；4自贡市第四人民医院，四川省自贡市 643000

接受日期:2025-04-22 出版日期:2026-07-18 发布日期:2025-11-21
通讯作者: 张红，副主任医师，成都医学院第一附属医院烧伤整形外科，四川省成都市 610599 罗霞，副教授，硕士生导师，西南石油大学新能源与材料学院，四川省成都市 610500
作者简介:林科建，女，1997年生，贵州省毕节市人，汉族，硕士，主要从事临床医学烧伤整形外科方面的研究。
基金资助:
四川省科技计划项目(2020YFH0151)，项目负责人：罗霞；发育与再生四川省重点实验室研究基金(SYS19-09)，项目负责人：张红

Preparation of Cu2+-containing microarc oxidation functional coating on medical magnesium alloy and its anti-tumor and angiogenesis-promoting effects

Lin Kejian1, Chai Yinghong2, Zou Jie1, Huang Ruixin3, Fang Yongchao3, Huang Jing4, Yang Qin1, Luo Xia2, Zhang Hong1

1Department of Burn and Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610599, Sichuan Province, China; 2School of New Energy and Materials, Southwest Petroleum University, Chengdu 610500, Sichuan Province, China; 3School of Pharmacy, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, Sichuan Province, China; 4The Fourth People’s Hospital of Zigong, Zigong 643000, Sichuan Province, China

Accepted:2025-04-22 Online:2026-07-18 Published:2025-11-21
Contact: Zhang Hong, Associate chief physician, Department of Burn and Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610599, Sichuan Province, China Luo Xia, Associate professor, Master’s supervisor, School of New Energy and Materials, Southwest Petroleum University, Chengdu 610500, Sichuan Province, China
About author:Lin Kejian, MS, Department of Burn and Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610599, Sichuan Province, China
Supported by:
Sichuan Provincial Science and Technology Plan Project, No. 2020YFH0151 (to LX); Sichuan Provincial Key Laboratory of Development and Regeneration Research Fund Project, No. SYS19-09 (to ZH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
微弧氧化：是一种在有色金属表面原位生长陶瓷膜的新型表面处理技术，在航空航天、汽车、电子、生物医药等领域有广泛应用前景。
镁合金：是一种以镁为基体加入其他元素(如铝、锌、锰等)组成的合金材料，继承了镁的低密度、高比强度等特性，在航空航天、汽车、电子等众多领域有着广泛应用。

背景：医用镁合金因优异的生物相容性被广泛用作骨肉瘤手术植入物，然而镁合金在人体内的降解速度较快，限制了它在临床上的应用。因此，迫切需要具有功能性的植入材料来解决骨肉瘤手术治疗及局部骨骼功能重建问题。
目的：在镁合金表面制备含Cu2+微弧氧化涂层，表征该材料的抗肿瘤与促血管形成效应。
方法：①采用半固态粉末成型技术制备镁合金(合金中镁与锌的质量比为94∶6)。以含不同质量浓度(0.26，0.32，0.38 g/L)醋酸铜的硅酸盐作为电解液，采用微弧氧化工艺在镁合金表面制备含Cu2+微弧氧化涂层，涂层中Cu2+质量分数分别为0.30%，0.34%，0.69%，表征涂层的形貌、厚度、显微硬度与耐腐蚀性能，以单纯负载微弧氧化涂层的镁合金为对照。②将对照镁合金浸提液、负载含Cu2+微弧氧化涂层的镁合金浸提液分别与大鼠动脉血混合，检测溶血率。将大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于负载微弧氧化涂层镁合金与负载含Cu2+微弧氧化涂层镁合金表面，检测细胞黏附情况。将大鼠骨髓间充质干细胞分别与对照镁合金浸提液、负载含Cu2+微弧氧化涂层镁合金浸提液共培养，检测细胞增殖率。③将大鼠骨肉瘤细胞UMR-106分别与对照镁合金浸提液、负载含Cu2+微弧氧化涂层镁合金浸提液共培养，检测细胞增殖率。将UMR-106细胞分别接种于对照镁合金与负载含Cu2+微弧氧化涂层镁合金表面，检测细胞黏附情况。将UMR-106细胞培养上清作为肿瘤条件培养基，在加入(或不加入)肿瘤条件培养基情况下，将大鼠血管内皮细胞分别与对照镁合金浸提液、负载含Cu2+微弧氧化涂层镁合金浸提液共培养，检测细胞增殖率与血管形成。
结果与结论：①Cu2+降低了负载微弧氧化涂层镁合金表面的孔隙率、孔径与腐蚀速率，提高了负载微弧氧化涂层镁合金的表面显微硬度。②CCK-8检测结果显示，当涂层中Cu2+质量分数为0.30%，0.34%时，大鼠骨髓间充质干细胞相对增殖率均大于80%，符合生物安全材料植入标准。负载涂层镁合金的溶血率均低于5%，具有良好的血液相容性。随着涂层中Cu2+质量浓度的升高，镁合金表面黏附的大鼠骨髓间充质干细胞数量减少。③随着涂层中Cu2+质量分数的增加，镁合金表面的UMR-106细胞相对增殖率、黏附数量均减少。在未加入与加入肿瘤条件培养基情况下，当Cu2+质量分数为0.30%，0.34%时，镁合金表面的大鼠血管内皮细胞相对增殖率与血管形成能力良好。结果表明，负载含适量Cu2+微弧氧化涂层的镁合金具有良好的抗肿瘤与促血管形成效应。

https://orcid.org/0009-0000-6196-5613 (林科建)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 医用镁合金, 微弧氧化, 含Cu2+涂层, 骨缺损, 抗肿瘤, 成血管, 骨植入物

Abstract: BACKGROUND: Medical magnesium alloys are widely used as surgical implants for osteosarcoma due to their excellent biocompatibility. However, magnesium alloys degrade rapidly in the human body, which limits their clinical application. Therefore, functional implant materials are urgently needed to solve the problems of surgical treatment of osteosarcoma and local bone function reconstruction.
OBJECTIVE: To prepare a microarc oxidation coating containing Cu2+ on the surface of magnesium alloy and characterize the anti-tumor and angiogenesis-promoting effects of the material.
METHODS: (1) Magnesium alloy (the mass ratio of magnesium to zinc in the alloy is 94:6) was prepared by semi-solid powder molding technology. Microarc oxidation coatings containing Cu2+ were prepared on the surface of magnesium alloy using silicate containing copper acetate with different mass concentrations (0.26, 0.32, and 0.38 g/L) as electrolyte. The mass fraction of Cu2+ in the coating was 0.30%, 0.34%, and 0.69%, respectively. The morphology, thickness, microhardness and corrosion resistance of the coating were characterized. The magnesium alloy simply loaded with miroarc oxidation coating was used as the control. (2) The extract of control magnesium alloy and the extract of magnesium alloy loaded with microarc oxidation coating containing Cu2+ were mixed with rat arterial blood, and the hemolysis rate was detected. Rat bone marrow mesenchymal stem cells were inoculated on the surface of magnesium alloy loaded with microarc oxidation coating and magnesium alloy loaded with microarc oxidation coating containing Cu2+, and the cell adhesion was detected. Rat bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with the extract of control magnesium alloy and the extract of magnesium alloy loaded with microarc oxidation coating containing Cu2+, and the cell proliferation rate was detected. (3) Rat osteosarcoma cells UMR-106 were co-cultured with the extract of control magnesium alloy and the extract of magnesium alloy loaded with microarc oxidation coating containing Cu2+, and the cell proliferation rate was detected. UMR-106 cells were inoculated on the surface of control magnesium alloy and magnesium alloy loaded with microarc oxidation coating containing Cu2+, and the cell adhesion was detected. The culture supernatant of UMR-106 cells was used as tumor conditioned medium. In the presence of (or without) tumor conditioned medium, rat vascular endothelial cells were co-cultured with extracts of control magnesium alloy and extracts of magnesium alloy loaded with microarc oxidation coating containing Cu2+, respectively, and the cell proliferation rate and angiogenesis were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cu2+ reduced the porosity, pore size, and corrosion rate of the surface of magnesium alloy loaded with microarc oxidation coating, and increased the surface microhardness of magnesium alloy loaded with microarc oxidation coating. (2) CCK-8 assay results showed that when the mass fraction of Cu2+ in the coating was 0.30% and 0.34%, the relative proliferation rate of rat bone marrow mesenchymal stem cells was greater than 80%, which met the implantation standard of biosafety materials. The hemolysis rate of magnesium alloy loaded with coating was less than 5%, which had good blood compatibility. With the increase of Cu2+ mass concentration in the coating, the number of rat bone marrow mesenchymal stem cells adhered to the surface of magnesium alloy decreased. (3) With the increase of Cu2+ mass fraction in the coating, the relative proliferation rate and adhesion number of UMR-106 cells on the surface of magnesium alloy decreased. In the absence and addition of tumor conditioned medium, when the mass fraction of Cu2+ was 0.30% and 0.34%, the relative proliferation rate and angiogenesis ability of rat vascular endothelial cells on the surface of magnesium alloy were good. The results show that magnesium alloy loaded with microarc oxidation coating containing an appropriate amount of Cu2+ has good anti-tumor and pro-angiogenesis effects.

Key words: medical magnesium alloy, microarc oxidation, containing Cu2+ coating, bone defect, anti-tumor, angiogenesis, bone implant

中图分类号:

林科建, 柴应红, 邹杰, 黄蕊欣, 方永超, 黄警, 杨沁, 罗霞, 张红. 含Cu2+医用镁合金微弧氧化功能涂层的制备及抗肿瘤、促血管形成效应[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(20): 5103-5114.

Lin Kejian, Chai Yinghong, Zou Jie, Huang Ruixin, Fang Yongchao, Huang Jing, Yang Qin, Luo Xia, Zhang Hong. Preparation of Cu2+-containing microarc oxidation functional coating on medical magnesium alloy and its anti-tumor and angiogenesis-promoting effects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(20): 5103-5114.

图/表（结果） 14

2.1 医用镁合金涂层的形貌表征结果扫描电镜下可见镁合金微弧氧化膜层表面产生细小的裂纹与孔隙，当微弧氧化电解液中Cu2+质量浓度为0.26 g/L时，镁合金表面微弧氧化涂层较粗糙，表面有较多裂纹和孔隙；当微弧氧化电解液中Cu2+质量浓度为0.32 g/L时，镁合金表面微弧氧化涂层较平整光滑，见图1。随着微弧氧化电解液中Cu2+质量浓度的增加，负载涂层镁合金表面的孔隙率和孔径呈现先减小再增大的趋势，见图2A，B。Cu2+的加入提升了镁合金表面微弧氧化涂层显微硬度，涂层厚度无明显变化，见图2C，D。
能谱分析结果显示，Cu2+在微弧氧化涂层表面分布较为均匀，见图3。等离子体质谱检测显示Cu2+被有效负载于微弧氧化涂层中，随着电解液中Cu2+质量浓度(0，0.26，0.32，0.38 g/L)的增加，微弧氧化涂层中的Cu2+质量分数增加，依次为0%，0.30%，0.34%，0.69%，见图3。X射线衍射仪分析结果显示，在含Cu2+微弧氧化涂层中出现了如SiO2、MgSiO4、Mg2Si等高硬化合物，使得涂层显微硬度得到进一步提升，见图4。

2.2 医用镁合金涂层的耐腐蚀性能检测结果表1和图5展示了4组微弧氧化涂层的耐腐蚀性能检测结果。与不含Cu2+涂层相比，含Cu2+涂层自腐蚀电位明显正向移动，当涂层中Cu2+质量分数为0.34%时，镁合金表面的腐蚀电位达到最大值，为-1.32 V，电流密度为1.49×10-7 A/cm2，阻抗值为1.84×104 Ω/cm2，腐蚀速率最小，为2.08×10-5 mm/年。结果表明，Cu2+的添加改善了微弧氧化涂层的缺陷，减小了镁合金表面孔径与孔隙率，有效阻止了腐蚀物质的渗透与扩散，与不含Cu2+微弧氧化涂层相比，添加Cu2+后微弧氧化涂层腐蚀速率降低了1个数量级，呈现出更为优异的耐腐蚀性能。

2.3 医用镁合金涂层的生物相容性评估结果各组大鼠骨髓间充质干细胞的相对增殖率如图6A所示。含Cu2+质量分数0.30%，0.34%微弧氧化涂层组培养1，3，5 d后的大鼠骨髓间充质干细胞相对增殖率均大于80%，符合生物安全材料植入标准；含Cu2+质量分数0.69%微弧氧化涂层组培养1，5 d后的大鼠骨髓间充质干细胞相对增殖率小于80%，不符合生物安全材料植入标准。各组微弧氧化涂层的溶血率均低于5%，见图6B。FITC/DAPI免疫染色结果显示，随着涂层中Cu2+质量分数的增加，镁合金表面黏附的大鼠骨髓间充质干细胞数量呈先增加后减少的趋势，其中含Cu2+质量分数0.30%微弧氧化涂层组黏附细胞数量最多，含Cu2+质量分数0.69%微弧氧化涂层组黏附细胞数量最少，见图7。

2.4 医用镁合金涂层的体外抗肿瘤性能检测结果由图8可知，随着培养时间和涂层中Cu2+质量分数的增加，UMR-106细胞相对增殖率呈现减少趋势，培养5 d后，含Cu2+质量分数0.30%，0.34%，0.69%微弧氧化涂层组UMR-106细胞相对细胞增殖率均小于80%。由图9可知，随着涂层中Cu2+质量分数的增加，镁合金表面黏附的UMR-106细胞数量减少。

2.5 医用镁合金涂层的体外促血管形成检测结果正常环境下各组大鼠血管内皮细胞相对增殖率如图10所示。随着培养时间与涂层中Cu2+质量分数的增加，大鼠血管内皮细胞相对增殖率大体呈先升高后降低趋势，其中含Cu2+质量分数0.34%微弧氧化涂层组大鼠血管内皮细胞相对增殖率最高。正常环境下各组大鼠血管内皮细胞Calcein/PI免疫荧光染色结果见图11所示。培养6 h时，各组均未形成成型的网状结构，随着培养时间的延长，各组均出现了血管网状结构；培养12 h时，含Cu2+质量分数0.30%，0.34%微弧氧化涂层组形成的网状结构最为显著，并且具有最多分支节点及最长分支管，此时含Cu2+质量分数0.34%微弧氧化涂层组大鼠血管内皮细胞相对增殖率高达128.24%，表现出优异的成血管能力。
肿瘤环境下各组大鼠血管内皮细胞相对增殖率如图12所示。随着培养时间的增加，大鼠血管内皮细胞相对增殖率呈先升高后降低的趋势，其中培养12 h时大鼠血管内皮细胞相对增殖率最高。肿瘤环境下各组大鼠血管内皮细胞Calcein/PI免疫荧光染色结果见图13所示。培养6 h时，含Cu2+质量分数0%，0.30%微弧氧化涂层组有少量分支节、分支管等血管化结构形成，随着培养时间延长至12 h，各组均出血管网状结构，其中含Cu2+质量分数0.69%微弧氧化涂层组形成的血管网状结构较少，该组大鼠血管内皮细胞相对增殖率为87.97%，明显低于其他3组，血管化程度最弱。

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引言

骨肉瘤是一种截肢率及死亡率较高的恶性肿瘤[1]，治疗过程需要切除肿瘤组织并重建肢体功能[2]。医用镁合金因优异的生物相容性被广泛用于骨肉瘤手术的植入物[3]，然而镁合金在人体内的降解速度较快[4]，限制了它在临床的应用。微弧氧化工艺可以提高镁合金表面的耐腐蚀性能、延缓镁合金的降解速度[5]，使它能够更好地应用于临床。许多研究通过添加不同的金属离子(钙、锌、铜)对镁合金表面进行改性，以提高镁合金的耐腐蚀性和生物相容性，并使材料具备一定的功能性。例如，LIANG等[6]利用微弧氧化技术在纯镁表面制备具有微孔结构的铜涂层，发现铜涂层对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性，在体外具有促成骨和血管生成能力。骨肉瘤治疗往往伴随着易复发和难恢复的问题，因此，迫切需要富有功能性的镁合金植入材料来解决骨肉瘤手术治疗及局部骨骼功能重建问题。
针对镁合金的功能化探索(如骨整合[7]、成血管[8]、抗肿瘤等[9])，大量学者展开了一系列研究。ZENG等[10]在镁合金上制备了微弧氧化/聚乳酸复合涂层，使镁合金具有更好的生物相容性，赋予镁合金促成骨能力。纪凌宇[11]在镁合金表面制备了钙磷/壳聚糖复合涂层，显著提升了镁合金的耐腐蚀性能，同时使镁合金具备了一定抗菌性能。WU等[12]制备了镁合金/聚合物复合材料，发现该材料在降解过程中形成的碱性环境具有抗肿瘤作用。微弧氧化涂层为Cu2+的持续稳定释放提供载体，使局部Cu2+达到有效抗肿瘤浓度。肿瘤组织中Cu2+含量相对较高，涂层释放的额外Cu2+导致肿瘤细胞Cu2+过载，Cu2+通过Fenton反应或类Fenton反应产生大量活性氧攻击肿瘤细胞的脂质、蛋白质和DNA，引发细胞凋亡[13]。微弧氧化协同Cu2+可调节巨噬细胞等免疫细胞的功能，使它们极化为具有抗肿瘤作用的表型，同时分泌细胞因子和趋化因子招募更多的免疫细胞到肿瘤部位，发挥抗肿瘤作用[14]。
研究发现，Cu2+具有良好的生物相容性[15-16]、抗菌性[17]、血管生成活性[18-19]、抗肿瘤等特性[20-21]。LIANG等[6]在纯镁表面制备了含Cu2+微弧氧化涂层，证实该涂层具有良好的生物相容性与促成骨和成血管能力。LI等[22]在镁合金表面构建了含Cu2+的镁铝层状双氢氧化物，显著提高了镁合金的耐腐蚀、抗菌和促成骨性能。因此，利用Cu2+的优异性能，制备负载含Cu2+微弧氧化涂层为解决骨肉瘤治疗及局部骨骼功能重建问题提供了新途径。此次研究在镁合金表面制备含Cu2+微弧氧化涂层，分析涂层的耐腐蚀性能、生物相容性、抗肿瘤性能和促血管形成性能，为医用镁合金多功能涂层的制备提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计含Cu2+ 微弧氧化涂层的制备及相关表征，体外细胞学实验，采用单因素方差分析对实验数据进行统计分析。
1.2 时间及地点实验于2023年9月至2024年6月在成都医学院附西区实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞大鼠骨肉瘤细胞UMR-106(逸漠生物，IM-R028)；SD大鼠血管内皮细胞(BNCC，337896)；SD大鼠骨髓间充质干细胞(OriCell，RASMX)。
1.3.2 主要试剂 Mg粉(唐山威豪公司)；Zn粉(中诺新材料公司)；Cu粉(中诺新材料公司)；DMEM高糖培养基(Solarbio，11995)；优级胎牛血清(Solarbio，S9020)；PBS(Solarbio，H10001)；0.25%胰酶消化液(CoolaberSL，6020)；红细胞裂解液(Biosharp，BL503A)；Matrix-Gel基质胶(Beyotime，C0376)；DAPI(Thermo，62247)；FITC标记鬼笔环肽(Solarbio，CA1620)；40 g/L组织细胞固定液(Solarbio，P1110)；0.1%Triton X-100(碧云天，P0096)；Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(碧云天，C2015M)；Prmi-1640基础培养基(Beyotime，中国)；CCK-8溶液(Sigma-Aldrich)；Hanks溶液(Solarbio，H1045)。
1.3.3 主要仪器酶标仪(Thermo Scientific，51119180ET)；离心机(Thermo，MuLtifuge X3)；倒置显微镜(Olympus，IX71)；共聚焦显微镜(Nikon A1R+SIM)；生物安全柜(Thermo Scientific，1300)；扫描电子显微镜(ZEISS EVO MA15，German)；能谱仪(OXFOR20，German)；X射线衍射仪(DX-2700B，China)；数字显微硬度测试仪(HVS-100，中国)；等离子体质谱仪(Aglient 7800，USA)。
1.3.4 实验动物雄性SD大鼠 2只，6-8周龄，体质量150 g，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK(川)2025-0030。实验获得成都医学院伦理委员会批准，批准号：成医动伦[2024]第023号。
1.4 实验方法
1.4.1 医用镁合金涂层的制备采用半固态粉末成型技术制备镁合金(合金中Mg与Zn质量比为 94∶6)[23-24]。将镁合金切割成10 mm×10 mm×2 mm规格，使用砂纸抛光以去除表面氧化膜，超声波清洗10 min以去除样品表面的污渍。使用微弧氧化工作站(WDL20-L，中国)制备含Cu2+微弧氧化涂层，连接微弧氧化相关设备的电源线路，金属板是阴极，镁合金样品是阳极。实验选用硅酸盐体系电解液，电解液总体积为2 L，组成为：NaSiO3·9H2O(18.6 g/L)、NaOH(4 g/L)、KF·H2O(2 g/L)、体积分数0.5%三乙醇胺。预实验结果显示，Cu2+质量浓度为0.2 g/L左右时能有效负载在涂层表面，因此Cu2+质量浓度区间选择为0.20，0.26，0.32，0.38，0.44 g/L；细胞毒性预实验结果显示，Cu2+质量浓度为0.20 g/L细胞活性相对较差，Cu2+质量浓度为0.44 g/L时具有较强的细胞毒性，因此排除该2个质量浓度，此次实验选择Cu2+质量浓度为0.26，0.32，0.38 g/L。将醋酸铜粉添加到电解液中，使其中Cu2+质量浓度分别为0.26，0.32，0.38 g/L。根据已有文献将恒速变频搅拌器设置转速为45-50 r/min[25]，使电解液处于流动中并充分均匀混合，以获得质地均匀的微弧氧化涂层。微弧氧化最佳工艺参数为[26]：电流密度6 A/dm2，微弧氧化时间5 min，频率500 Hz。打开 20 kW 微弧氧化电源，随着电压快速升高至600 V，镁合金样品表面能看到明显的弧光，等待 20 min后即可得到3种负载含Cu2+微弧氧化涂层的镁合金。以单纯负载微弧氧化涂层的镁合金为对照。
1.4.2 医用镁合金涂层的表征使用扫描电子显微镜观察4组负载涂层镁合金的表面形貌，统计孔隙率和孔径大小。使用能谱仪分析4组镁合金的元素分布。使用X射线衍射仪分析4组负载涂层镁合金的物相组成，扫描范围为10°-90°，扫描步长为0.02°。使用数字显微硬度测试仪测量4组负载涂层镁合金的涂层厚度和显微硬度，每个参数样本选择7个点，最终取平均值。使用电化学系统进行电化学测试，检测4组负载涂层镁合金涂层的耐腐蚀性、化学极化曲线与阻抗性能，铂电极用作辅助电极，饱和甘汞电极作为作参比电极，负载涂层镁合金作为工作电极，实验在37 ℃ Hank模拟体液中进行，将涂层浸入体液中测试30 min，以获得稳定的开路电位，扫描速率为1 mV/s，扫描范围为开路电位±0.4 V。
1.4.3 医用镁合金涂层的生物相容性评估
镁合金浸提液制备：将4组负载涂层镁合金在含有乙醇的超声仪中清洗10 min以去除表面异物及油脂，紫外灭菌1 h。参照GB/T 16886.12-2023进行制备浸提液[27]，将负载涂层镁合金放入于盛有浸提介质(含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的‌DMEM培养基)的离心管内，浸提介质与材料表面积比为 1.25 mL/cm2，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中。72 h后取出离心管，3 000 r/min离心10 min后收取上清液，0.22 μm过滤器过滤以获得原始镁合金浸提液，保存在4 ℃冰箱中待用；同时，采用等离子体质谱仪测定铜离子含量。
镁合金血液相容性检测：取2只SD大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后仰卧位固定，腹股沟处剪毛、消毒、分离股动脉，用注射器直接刺入股动脉取血2 mL，取血后压迫止血。将收集的新鲜血液与生理盐水按体积比4∶5混合后备用。阴性对照组为10 mL PBS，阳性对照组为10 mL红细胞裂解液，实验组为10 mL负载涂层镁合金浸提液，各组预热至37 ℃保温30 min后加入0.2 mL稀释后的血液，37 ℃继续培养60 min；取出样品，1 000 r/min离心5 min后取上清液，测量545 nm波长处的吸光度值，按公式(1)计算溶血率。根据溶血率，评估材料溶血性能[28]：溶血率<5%，说明材料无溶血性，生物相容性良好；溶血率5%-10%，说明材料有轻微溶血性，需进一步评估；溶血率> 10%，说明材料有明显溶血性，生物相容性较差。
溶血率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100% (1)
公式中，As为实验组吸光度值，Ab为阴性对照组吸光度值，Ac为阳性对照组吸光度值。
镁合金细胞黏附性检测：选取生长状态良好的对数期大鼠骨髓间充质干细胞，配置成细胞浓度为1×109 L-1的悬液。4组涂层镁合金经紫外线灭菌1 h后分别置于24孔板中，将大鼠骨髓间充质干细胞按1.0×105/孔的密度分别接种于4组镁合金表面，每组设置3个复孔，置于细胞培养箱中培养。培养24 h后，用1 mL PBS清洗孔板2次，添加500 μL 0.5%Triton X-100透化溶液透化处理5 min，再用1 mL PBS清洗孔板2次；避光条件下加入200 μL FITC溶液染色45 min，用1 mL PBS清洗孔板2次，加入DAPI溶液避光染色5 min，用1 mL PBS清洗孔板2次，在荧光显微镜下观察细胞黏附情况，通过Image J软件计数材料表面的细胞数量。
镁合金细胞毒性检测：选取生长状态良好的对数期大鼠骨髓间充质干细胞，配置成细胞浓度为5×108 L-1的悬液，按照5.0×104/孔的密度接种于96孔板中，培养24 h后吸出原细胞培养基，用PBS洗涤2次，分组处理：实验组加入100 μL负载涂层镁合金浸提液，阴性对照组加入100 μL含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的‌DMEM培养基，空白对照组仅加入100 μL含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的‌DMEM培养基(无细胞)，每组设置3个复孔，每2 d换液一次。培养1，3，5 d后取出孔板，吸出原细胞培养基，避光加入100 μL 10%CCK-8溶液，放入细胞培养箱中继续孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度值，按公式(2)计算细胞相对增殖率[29]。
细胞相对增殖率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100% (2)
公式中，As为实验组吸光度值，Ab为空白对照组吸光度值，Ac为阴性对照组吸光度值。
1.4.4 医用镁合金的体外抗肿瘤性能检测
镁合金肿瘤细胞毒性检测：选取生长状态良好的对数期UMR-106细胞，配置成细胞浓度为5×107 L-1的悬液，按照5.0×104/孔的密度接种于96孔板中，培养24 h后吸出原细胞培养基，用PBS洗涤2次，分组处理：实验组加入100 μL负载涂层镁合金浸提液，阴性对照组加入100 μL含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的‌DMEM培养基，空白对照组仅加入100 μL含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的‌DMEM培养基(无细胞)，每组设置3个复孔，每2 d换液一次。培养1，3，5 d后取出孔板，吸出原细胞培养基，避光加入100 μL 10% CCK-8溶液，放入细胞培养箱中继续孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度值，按公式(2)计算细胞相对增殖率。
镁合金肿瘤细胞黏附性检测：选取生长状态良好的对数期UMR-106细胞，配置成细胞浓度为5×107 L-1的悬液。4组涂层镁合金经紫外线灭菌1 h后分别置于24孔板中，将UMR-106细胞以5.0×104/孔的密度分别接种于4组涂层镁合金表面，每组设置3个复孔，置于细胞培养箱培养。培养48 h后，用40 g/L多聚甲醛室温条件下固定细胞10 min，用1 mL PBS清洗孔板2次，每次清洗10 min；添加0.8 mL 0.5%Triton X-100透化溶液透化处理5 min，用1 mL PBS清洗孔板2次；避光条件下加入200 μL FITC溶液染色45 min，用1 mL PBS清洗孔板2次，加入DAPI溶液避光染色5 min，用1 mL PBS清洗孔板2次，在荧光显微镜下观察细胞黏附情况，通过Image J软件计数材料表面细胞数量。
1.4.5 医用镁合金的体外促血管形成检测
正常环境下的成血管实验：将Matrigel基质胶置于4 ℃冰箱中解冻，将24孔板及枪头置于4 ℃冰箱中预冷处理24 h。取出解冻后的基质胶轻柔吹打为匀浆状，取30 μL加入24孔板中均匀摊平，置于孵育箱中孵育30 min。选取生长状态良好的对数期大鼠血管内皮细胞，配置成细胞浓度为5×108 L-1的悬液，以5.0×104/孔的密度接种到铺好Matrigel基质胶的24孔板中，分组处理：实验组加入200 μL负载涂层镁合金浸提液和100 μL完全培养基，阴性对照组加入100 μL含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的‌DMEM培养基，空白对照组仅加入100 μL含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的‌DMEM培养基(无细胞)，每组设置3个复孔，置于细胞培养箱中培养。培养6，12，24 h后吸出原细胞培养基，用PBS洗涤2次，避光条件下加入100 μL 10%CCK-8溶液，放入细胞培养箱中继续孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度值，计算细胞相对增殖率。吸出CCK-8溶液，用PBS洗涤两三次，使用Calcein/PI试剂盒进行染色，在倒置荧光显微镜下观察血管网状结构形成的数量、节点数量等并拍照记录。
肿瘤环境下的成血管实验：将UMR-106细胞以5×105/孔的密度接种于24孔板中，加入Prmi-1640基础培养基培养24 h，1 000 r/min离心5 min后取上清液，加入体积分数10%胎牛血清混匀后作为肿瘤条件培养基。选取生长状态良好的对数期大鼠血管内皮细胞，配置成细胞浓度为5×108 L-1的悬液，以5.0×104/孔的密度接种到铺好Matrigel基质胶的24孔板中，实验组每孔加入200 μL负载涂层镁合金浸提液和100 μL肿瘤条件培养基，阴性对照组加入100 μL肿瘤条件培养基，空白对照组仅加入100 μL含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的‌DMEM培养基(无细胞)，每组设置 3个复孔，置于细胞培养箱中培养。培养6，12，24 h后吸出原细胞培养基，用PBS洗涤2次，避光条件下加入100 μL 10%CCK-8溶液，放入细胞培养箱中继续孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度值，计算细胞相对增殖率。吸出CCK-8溶液，用PBS洗涤两三次，使用Calcein/PI试剂盒进行染色，在倒置荧光显微镜下观察血管网状结构形成的数量、节点数量等并拍照记录。
1.5 主要观察指标 4组负载涂层镁合金的表面形貌、耐腐蚀性、生物相容性以及体外抗肿瘤、促血管形成性能。
1.6 统计学分析采用Image J和GraphPad Prism 10.0软件完成数据分析，图表采用GraphPad Prism 10.0软件制作。组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计方法已经过成都医学院统计学专家审核。

讨论

肉瘤作为一种恶性程度极高的肿瘤严重威胁患者生命健康和肢体功能，治疗过程面临着诸多挑战[30]。目前针对骨肉瘤的治疗主要依赖手术切除肿瘤组织，但手术往往伴随着大面积的骨缺损[31]，极大地损害了肢体正常功能，严重降低患者的生活质量。因此，骨植入材料在骨肉瘤术后功能重建中具有不可或缺的必要性。
近几年来，医用镁合金因优异的生物相容性在骨肉瘤手术植入物领域具有一定的应用潜力，然而它在人体内的降解速度较快，这一特性限制了镁合金在临床应用的长期有效性和稳定性。在术后功能重建的关键时期，镁合金过快的降解可能导致植入部位结构不稳定，无法为新生组织提供足够的支撑和引导，从而影响骨组织的正常修复和再生过程[32]。许多研究通过表面改性并添加不同的合金元素如钙、锌、锰、铜、锡、银及稀土元素等调整镁合金成分，改善镁合金的力学性能、腐蚀性能和生物相容性，以满足肢体重建的需求[33]。
此次实验制备了负载Cu2+的镁合金微弧氧化涂层，显著提高了镁合金表面的耐腐蚀性能，延缓了镁合金的降解速度。当涂层中Cu2+质量分数为0.34%时，涂层腐蚀电位最大，为-1.32 V，电流密度为1.49×10-7A/cm2，极化电阻为1.84×104 /cm2，腐蚀速率最小，为2.08×10-5 mm/年，腐蚀速率较不含Cu2+微弧氧化涂层降低了1个数量级。腐蚀速率降低使涂层在植入初期至骨骼愈合的过程中更好地保持原有的强度和刚度，确保能有效支撑骨骼，降低因植入物过早腐蚀导致支撑力不足、骨折等风险[34]；此外，腐蚀速率降低可使涂层中的铜离子、镁离子缓慢适量释放，减少对周围组织的刺激，降低炎症发生的概率和程度，促进伤口正常愈合[35]。
同时涂层表面微弧氧化膜在生长过程中，由于电压和电流的施加，大量气体从电解液中逸出，高温熔融物也随放电通道喷出，它与电解液接触并快速冷却，进而在产生细小的裂纹与孔隙[36-37]；而涂层表面产生的孔隙结构提供了更大的比表面积，为细胞提供了更多的附着位点，便于骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞等在涂层表面黏附，进而促进细胞增殖，为骨组织的修复和再生奠定细胞基础[38]。在含Cu2+涂层中还出现了如SiO2、MgSiO4、Mg2Si等高硬化合物，这使得涂层的显微硬度得到进一步提升，使涂层拥有更高致密性和硬度，更好地承受力学负荷，为受损或病变的骨骼提供更稳固支撑，降低植入物变形或断裂的风险。此次实验制备的涂层拥有良好的耐腐蚀性能和较高的硬度性，对于维持植入物在体内的结构完整性和功能稳定性具有重要意义。
铜是维持人体骨骼健康的必需微量元素。研究报道Cu2+具有良好的生物相容性，Cu2+可促进成骨细胞分化、增加骨胶原的沉积，进而促进钙、磷等无机物质在骨上的沉积，有助于修复骨组织、促进骨再生、改善骨质疏松症状[39]。适量Cu2+可促进成骨细胞分化，在骨组织工程中表现出良好生物相容性，利于维持细胞活力和功能，但过量Cu2+可能会产生细胞毒性，对细胞生长和功能产生负面影响[40]。此次实验结果显示，当涂层中Cu2+质量分数为0.30%，0.34%，大鼠骨髓间充质干细胞相对增殖率大于80%，为1级细胞毒性[29]，符合生物安全材料植入标准，但当涂层中Cu2+质量分数为0.69%时，大鼠骨髓间充质干细胞相对增殖率小于80%。各组涂层的溶血率均低于5%，符合国际标准ISO 10993-4:2017[28]，证明Cu2+的适量加入不会造成红细胞破裂。当涂层中Cu2+质量分数为0.30%，0.34%时，鼠骨髓间充质干细胞黏附率相对较多，细胞黏附率主要受涂层表面形貌的影响，通常具有较高粗糙度的材料表面更有利于细胞黏附[41]。另外，过量的Cu2+也会导致细胞凋亡，从而引起细胞黏附下降[42]，进一步表明适量Cu2+有助于维持细胞活力和生物相容性，过量则会抑制细胞活力。过量Cu2+会打破细胞内的Cu2+稳态平衡，造成铜中毒，进而诱导细胞死亡[43-44]；过量Cu2+产生的大量活性氧使得细胞内的抗氧化防御系统不堪重负，无法及时清除活性氧，从而使细胞处于氧化应激状态[45]，活性氧会攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸引发脂质过氧化反应，破坏细胞膜的完整性和流动性，导致细胞膜功能紊乱，影响细胞的物质运输、信号传递等正常生理功能。另外，活性氧会使蛋白质的氨基酸残基发生氧化修饰，改变蛋白质的结构和功能，导致酶失活、细胞骨架破坏等[46]。活性氧还能直接作用于细胞核内的DNA导致DNA链断裂、碱基修饰等损伤，影响基因的正常表达和复制，进而引发细胞凋亡或癌变[47]。
有研究报道Cu2+具有抗肿瘤作用。XU等[48]基于铜死亡的纳米平台设计，通过调节肿瘤细胞的铜稳态来诱导铜死亡，以提升乳腺癌的免疫治疗效果。ZHONG等[49]设计了一种Cu2+或亚Cu2+的递送系统，可将不同价态的Cu2+递送至肿瘤部位，在激光照射下释放出Cu2+或亚Cu2+触发肿瘤部位的类芬顿反应，产生羟基自由基，导致细胞脂质过氧化积累，从而杀死肿瘤细胞。此次实验结果显示，3种含Cu2+微弧氧化涂层组大鼠骨肉瘤细胞相对增殖率均小于80%，达到2，3级细胞毒性[29]；大鼠骨肉瘤细胞黏附数量也随涂层中Cu2+含量增加而减少，表明了在3种含Cu2+微弧氧化涂层对大鼠骨肉瘤细胞均有抑制作用，表现出一定的抗肿瘤性能，这可能是因为肿瘤组织中铜含量相对较高[50]，额外Cu2+的加入使肿瘤细胞内Cu2+过载，同时涂层持续释放Cu2+导致溶液pH值升高，形成局部碱性环境，共同抑制了肿瘤细胞生长[51]。Cu2+可通过Fenton反应或类Fenton反应产生大量活性氧，攻击肿瘤细胞的脂质、蛋白质和DNA，破坏细胞膜完整性，使蛋白质失活，造成DNA损伤，引发细胞凋亡。另外，Cu2+还可直接与细胞内凋亡相关蛋白结合激活凋亡信号通路。Cu2+还能作用于磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B、丝裂原活化蛋白激酶等肿瘤细胞内的信号通路，激活或抑制关键蛋白，进而影响肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和迁移等行为[52]。
Cu2+具有促进血管生成的作用，能为骨组织再生提供充足的营养物质和氧气，加速伤口愈合和骨整合过程[53]。研究发现，金属硫蛋白2A能够通过中和过多的Cu2+并修复由铜过载引发的线粒体功能障碍促进慢性缺血性大脑的血管生成，证明了Cu2+在脑血管生成中的作用[54]。有学者指出Cu2+在伤口愈合中扮演关键角色，具有抗菌和促进血管生成的特性，可通过激活铜依赖性酶、稳定缺氧诱导因子1α和激活血管内皮生长因子等促进血管生成[55]。此次实验结果表明，在正常环境下，当涂层中Cu2+质量分数为0.30%，0.34%时，大鼠血管内皮细胞形成的网状结构明显，分支节点多且分支管长，此时涂层中Cu2+质量分数为0.34%组大鼠血管内皮细胞相对增殖率高达128.24%，表现出优异的成血管能力，这归因于适宜含量Cu2+刺激内皮细胞增殖分化，促进血管新生[56]。Cu2+是基质金属蛋白酶的重要调节因子，基质金属蛋白酶能降解细胞外基质，为血管内皮细胞的迁移和增殖创造空间，促进新生血管芽的形成和延伸[57]。Cu2+可激活缺氧诱导因子1α，缺氧诱导因子1α与血管内皮生长因子基因的缺氧反应元件结合，增强血管内皮生长因子的转录，促进内皮细胞的增殖、迁移和血管管腔形成。然而在肿瘤环境下，当涂层中Cu2+质量分数为0.69%时，大鼠血管内皮细胞形成的血管网状结构较少，细胞相对增殖率最低可至87.97%，血管化程度最弱，可能是肿瘤环境中铜负荷过载产生大量活性氧抑制了内源活性氧的生成，进而显著降低血管内皮生长因子表达，抑制了肿瘤细胞生长和血管生长[58]。Cu2+可调节肿瘤微环境中的细胞外基质成分，影响细胞与基质的相互作用，使肿瘤细胞和内皮细胞的生存和迁移环境改变，不利于肿瘤血管生成。
此次研究首次将Cu2+负载于镁合金微弧氧化涂层用于骨肉瘤治疗研究中，结合了镁合金良好的生物相容性与Cu2+的多种特性，研究成果为医用镁合金多功能涂层制备提供了一定的实验依据，但有关涂层的一些关键性能指标研究不够深入，未来实验将围绕此方面开展一系列研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

含Cu2+医用镁合金微弧氧化功能涂层的制备及抗肿瘤、促血管形成效应

Preparation of Cu2+-containing microarc oxidation functional coating on medical magnesium alloy and its anti-tumor and angiogenesis-promoting effects

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