中国组织工程研究 ›› 2010, Vol. 14 ›› Issue (11): 1951-1954.doi: 10.3969/j.issn.1673-8225.2010.11.013
• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇 下一篇
伍丽华,杨汝德
Wu Li-hua, Yang Ru-de
摘要:
背景:RNA干扰技术通过将具有一定结构特点、长19~25 bp的双链小干扰RNA导入哺乳动物细胞,特异性降解与其序列具有同源性的mRNA分子,导致目的基因表达抑制。
目的:拟构建针对人血管紧张素原mRNA的小干扰RNA表达载体,从而抑制肾素基因在脂肪细胞的表达。
方法:从NCBI中查找人血管紧张素原基因全长mRNA序列(NM000029),利用GeneScript公司提供的在线小干扰RNA模板序列设计软件,自行设计靶向血管紧张素原的两条shRNA的DNA模板单链,合成靶向血管紧张素原基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的psiRNAT-U6.1/Neo质粒连接,在TOP10菌株中扩增,并测序鉴定。
结果与结论:将含有血管紧张素原-mRNA目标序列19 bp的双链DNA插入片段,连接到pRNAT-U6.1/Neo质粒形成重组质粒。EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后,空载体得到351 bp小片段,而人重组质粒得到397 bp小片段,与预期相符。EcoRⅠ和Kpn Ⅰ双酶切后,空载体得到1条345 bp小片段,而人重组载体没有得到小片段条带,与预期相符。测序结果表明psiRNAT-U6.1/Neo质粒已经插入人脂肪细胞的干扰合成片段,无碱基突变,成功构建了靶向血管紧张素原-小干扰RNA表达载体。
中图分类号: