1.1 设计 动物实验和体外细胞学实验，比较WT和IL-9-/-小鼠之间体内成骨能力以及骨量的差异，分别提取原代骨髓间充质干细胞比较体外成骨分化能力，组间比较采用配对t检验与 ANOVA 单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2021年1月至2022年2月在苏州大学骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 实验中所用的野生型(WT)和IL-9基因全敲(IL-9-/-)小鼠(苏州大学王雪峰教授惠赠)，为2月龄雄性小鼠，体质量22 g左右，均于SPF级实验动物中心进行饲养和繁殖(SYXK(苏) 2021-0065)。SPF屏障设施相对温度为20-26 ℃，相对湿度为40%-70%。昼夜交替时间为12/12 h。
实验方案经过苏州大学大学动物实验伦理委员会批准，批准号：SUDA20230801A01。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 实验试剂与耗材 胎牛血清(东岭，中国)，抗坏血酸Vc、β-甘油磷酸钠、地塞米松(Sigma，美国)，α-MEM培养基(Hyclone，美国)，结晶紫染色液(碧云天，中国)，茜素红染色试剂盒(Cyagen，美国)，伊红染液、苏木精染液(武汉塞维尔生物科技有限公司，中国)，Masson染色试剂盒(索莱宝，中国)，40 g/L多聚甲醛(Biosharp，中国)，Ⅰ型胶原蛋白抗体(Abcam，美国)，荧光定量 PCR 试剂盒(伯乐，美国)；TRIzol RNA 分离试剂(Invitrogen，美国)
1.3.3 实验仪器 Micro-CT(SkyScan，比利时)，石蜡切片包埋机、切片机(Leica，德国)，正置显微镜(Carl Zeiss，德国)，超纯水过滤机(Millipore，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 IL-9-/-小鼠的鉴定 用生理盐水配制1%的戊巴比妥钠溶液，以20 mg/kg用量腹腔注射进行小鼠麻醉。剪取小鼠部分鼠尾组织放置于1.5 mL EP管中，加入300 μL裂解液和3 μL蛋白酶K，使鼠尾组织完全浸没，置于58 ℃烘箱过夜。次日消化完成，可见絮状物沉淀，振荡，加入42 μL乙酸钾，插入冰中孵育1 h。12 000 r/min，离心10 min；吸取上清，并转移到新的1.5 mL EP管中。每管加入约300 μL的异丙醇，上下颠倒混匀，可见丝状物的产生，12 000 r/min离心10 min，弃去上清，得到DNA沉淀。通风橱中晾干，适量加入DDH2O 70-100 μL，置于55 ℃烘箱，促进DNA的溶解，作为PCR扩增模板备用。再行琼脂糖电泳进行鉴定。
1.4.2 Micro-CT分析 用生理盐水配制1%的戊巴比妥钠溶液，以20 mg/kg用量腹腔注射进行小鼠麻醉。将麻醉后的2月龄大小的WT和IL-9-/-小鼠安乐死，收获股骨，剔除周围的软组织(n=3)。使用SkyScan1176型扫描器(Bruker，Belgium)对小鼠股骨进行扫描，扫描参数为射线管电压为50 kV，电流为200 μA，Al为0.5 mm，分辨率为High，扫描旋转角度为180°，空间分辨率尺寸为9 μm。扫描得到的原始图像通过计算机软件NRecon/NReconServe进行重建，使用软件Data Viewer确定生长板的位置，使用软件CTAn选取股骨远端生长板上60-210层作为骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目以及骨小梁分离度等参数的定量分析区域，并使用Mimics对这一区域进行三维重建。
1.4.3 苏木精-伊红染色 将WT和IL-9-/-小鼠股骨置于40 g/L多聚甲醛中进行固定，时间不超过48 h。固定完成后，用PBS清洗3遍，置于14%EDTA中进行脱钙，时间约为2周。脱钙完成后，用PBS清洗3遍，按照顺序进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片等操作。将小鼠股骨石蜡切片置于60 ℃烘箱中1 h，使用二甲苯脱蜡2次，梯度乙醇复水，DDH2O清洗5 min，苏木精染色2 min，流水冲洗5 min，盐酸乙醇分化液清洗30 s，氨水清洗1 min，伊红染色2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明2次，中性树脂封固。于通风橱内风干3 d后，用正置荧光显微镜拍照。
1.4.4 Masson三色染色 将WT和IL-9-/-小鼠股骨石蜡切片置于60 ℃烘箱中1 h，使用二甲苯脱蜡2次，梯度乙醇复水，DDH2O清洗5 min，Weigert铁苏木精染色液染色5 min，盐酸乙醇分化液分化5 min，流水冲洗，Masson蓝化液3 min，流水冲洗，丽春红品红染色液染色5 min，弱酸工作液洗1 min，磷钼酸溶液洗1 min，弱酸工作液洗1 min后置于苯胺蓝染色液2 min，弱酸工作液洗1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明2次，中性树脂封固。于通风橱内风干3 d后，用正置荧光显微镜拍照。
1.4.5 免疫组化 将WT和IL-9-/-小鼠股骨切片置于60 ℃烘箱中1 h，二甲苯脱蜡2次，梯度乙醇复水，用DDH2O清洗5 min，使用柠檬酸钠缓冲液修复抗原，滴加内源性过氧化物酶阻断剂孵育15 min。PBST洗涤3次，滴加Ⅰ型胶原蛋白一抗，稀释比例为1∶100，4 ℃冰箱孵育过夜。次日，回收一抗，PBST清洗，滴加二抗，稀释比例为1∶1 000，室温下孵育30 min；PBST清洗；滴加三抗，稀释比例为1∶200，同样在室温下孵育30 min，PBST清洗，滴加DAB显色液，DDH2O清洗5 min，苏木精染色2 min，流水冲洗5 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明2次，中性树脂封固。于通风橱内风干后，用正置荧光显微镜拍照。
1.4.6 骨髓细胞成纤维集落形成单位(colony-forming unit-fibroblast，CFU-F)实验 通过提取骨髓原代细胞培养，观察间充质干细胞集落形成情况，探究小鼠骨髓细胞中间充质干细胞占比的多少。
1.4.7 原代骨髓间充质干细胞的提取 收获2月龄WT和IL-9-/-小鼠两侧股骨与胫骨，用含α-MEM基础培养基的5 mL无菌注射器反复冲洗骨髓腔，直到骨髓被全部冲出，骨头发白；并用100 μm的滤筛过滤掉多余的肌肉、碎骨片，获得骨髓细胞悬液。进行细胞计数，以1×106个/孔的密度种于6孔板中，将细胞摇匀，用α-MEM成骨诱导培养基培养。
3 d后行半换液，之后每2 d换液。7 d后行结晶紫染色和碱性磷酸酶染色，21 d后进行茜素红染色。
1.4.8 结晶紫染色 取出6孔板细胞，弃去培养基，并用PBS清洗残余的培养基，洗涤2遍。用40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min，弃去多聚甲醛，用PBS清洗残余的多聚甲醛，洗涤2遍。每孔加入1 mL结晶紫染色，染色10 min，弃去染色液，加入PBS终止染色反应并洗去多余底色。显微镜下拍照。
1.4.9 碱性磷酸酶染色 取出6孔板细胞，弃去培养基，并用PBS清洗残余的培养基，洗涤2遍。用40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min，弃去多聚甲醛，用PBS清洗残余的多聚甲醛，洗涤2遍。每孔加入1 mL碱性磷酸酶染液，室温避光孵育30 min，弃去染色液，加入PBS终止染色反应并洗去多余底色。显微镜下拍照。
1.4.10 茜素红染色 取出6孔板细胞，弃去培养基，并用PBS清洗残余的培养基，洗涤2遍。用40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min，弃去多聚甲醛，用PBS清洗残余的多聚甲醛，洗涤2遍。每孔加入1 mL茜素红染液，室温避光孵育30 min，弃去染色液，加入PBS终止染色反应并洗去多余底色，显微镜下拍照。
1.4.11 荧光定量PCR检测成骨基因表达水平 将从WT和IL-9-/-小鼠提取的原代骨髓间充质干细胞分别用α培养基和成骨培养基诱导3 d，分别命名为WT-C、WT-OB、IL-9-/--C和IL-9-/--OB(其中C代表对照，OB代表成骨诱导)，弃去培养基，用PBS清洗细胞2遍，用胰酶将细胞消化下来，转移至1.5 mL EP管中。加入适量TRIzol裂解细胞，加入1/5体积氯仿混匀后高速离心。将上清转移至新的EP管中，加入适量异丙醇，混匀，高速离心。弃去上清，用1 mL 体积分数75%乙醇清洗底部RNA沉淀2次，去除杂质。于通风橱晾干后加入适量DEPC水溶解。用反转录试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行荧光定量PCR检测成骨相关基因碱性磷酸酶、runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2，Runx2)、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白的表达。引物序列见表1。
1.4.12 Western blot 检测JAK-STAT信号通路相关蛋白表达水平 将从WT和IL-9-/-小鼠提取的原代骨髓间充质干细胞分别用α培养基和成骨培养基诱导3 d，分别命名为WT-C、WT-OB、IL-9-/--C和IL-9-/--OB，弃去培养基，用PBS清洗细胞2遍，使用RIPA提取细胞蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度；经过电泳、转膜、封闭后，使用β-actin、STAT3和pSTAT3一抗(1∶1 000)孵育过夜，使用相应二抗(1∶1 000)孵育1 h后洗涤曝光。
1.5 主要观察指标 ①两组小鼠股骨Micro-CT分析、苏木精-伊红染色结果；②两组小鼠Ⅰ型胶原蛋白阳性细胞数量以及骨胶原纤维形成能力的差异；③两组小鼠成骨能力的差异。
1.6 统计学分析 采用 SPSS 26.0统计软件进行统计学分析。所有数值均以x±s表示，采用配对 t 检验检测两组间的变量来确定统计学意义，P < 0.05认为差异有显著性意义。统计学方法已经通过苏州大学附属第一医院生物统计学专家审核。
