橙皮素抑制氧化应激影响软骨细胞的炎性退变

doi:10.12307/2024.460

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (26): 4184-4188.doi: 10.12307/2024.460

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

橙皮素抑制氧化应激影响软骨细胞的炎性退变

罗善超1，2，唐继仁2

1广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530011；2玉林市中西医结合骨科医院，广西壮族自治区玉林市 537000

收稿日期:2023-07-24 接受日期:2023-09-04 出版日期:2024-09-18 发布日期:2023-10-07
通讯作者: 唐继仁，主任医师，玉林市中西医结合骨科医院，广西壮族自治区玉林市 537000
作者简介:罗善超，男，1980年生，广西壮族自治区玉林市人，汉族，2017年广西医科大学毕业，博士，主任医师，主要从事关节外科和创伤骨科的基础与临床研究。
基金资助:
广西自然科学基金资助项目(2019GXNSFAA185060)，项目参与人：罗善超

Effect of hesperetin on inflammatory degeneration of chondrocytes by inhibiting oxidative stress

Luo Shanchao1, 2, Tang Jiren2

1Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Yulin Orthopedic Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Yulin 537000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-07-24 Accepted:2023-09-04 Online:2024-09-18 Published:2023-10-07
Contact: Tang Jiren, Chief physician, Yulin Orthopedic Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Yulin 537000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Luo Shanchao, MD, Chief physician, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Yulin Orthopedic Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Yulin 537000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2019GXNSFAA185060 (to LSC [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨关节炎：是由多因素导致的骨科常见的关节疾病，关节软骨的退行性改变是主要的病理特点，经常累及负重大和活动多的膝关节、髋关节等部位。全球65岁以上人群超过一半为骨关节炎患者，严重危害中老年人群健康。
橙皮素：是一类天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和心血管保护作用等一系列重要功能，具有极高的药用价值及研究价值。

背景：研究表明，橙皮素可以通过多种机制或者信号通路对软骨细胞产生保护作用，但其保护机制尚未完全阐明。

目的：探讨橙皮素对脂多糖诱导的软骨细胞炎性退变的影响。
方法：体外提取、培养SD乳鼠关节软骨细胞，采用番红O染色鉴定。通过MTT法检测细胞毒性确定最佳橙皮素干预浓度。将软骨细胞随机分为3组：对照组、模型组和实验组，后2组采用脂多糖诱导软骨细胞建立骨关节炎细胞模型，实验组造模后给予橙皮素干预24 h。采用Calcein-AM/EthD-Ⅰ染色检测细胞活性，免疫组化染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达，活性氧检测试剂盒检测软骨细胞内活性氧水平，ELISA 检测软骨细胞内抗氧化剂总谷胱甘肽水平，qRT-PCR检测炎症基因白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和软骨特异性基因Ⅱ型胶原基因的表达。

结果与结论：①番红O染色结果表明，提取的细胞为软骨细胞；②细胞毒性实验表明0.5 μmol/L橙皮素干预软骨细胞活力最明显；③与对照组比较，模型组软骨细胞增殖能力降低，活性氧水平升高，总谷胱甘肽水平下降，Ⅱ型胶原降解增加，白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α基因表达水平升高，软骨特异性Ⅱ型胶原基因表达水平下降，差异均有显著性意义(P < 0.05)；④与模型组比较，实验组软骨细胞增殖能力上升，活性氧水平下降，总谷胱甘肽水平上升，Ⅱ型胶原降解减少，白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α基因表达水平下降，软骨特异性Ⅱ型胶原基因表达水平升高(P < 0.05)。结果表明：橙皮素对脂多糖诱导的骨关节炎软骨细胞炎性退变具有保护作用，其机制可能与橙皮素抑制活性氧介导的氧化应激有关。

https://orcid.org/0000-0001-5980-0035(罗善超)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 软骨细胞, 橙皮素, 活性氧, 氧化应激, 炎症, 软骨退变

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that hesperetin exerts protective effects on chondrocytes through a variety of mechanisms or signaling pathways, but the protective mechanisms have not been fully elucidated.
OBJECTIVE: To investigate the effect of hesperetin on lipopolysaccharide-induced inflammatory degeneration of chondrocytes.
METHODS: Knee joint chondrocytes from suckling Sprague-Dawley rats were isolated and cultured in vitro, and identified by Safranine O staining. The cytotoxicity of hesperetin on chondrocytes was determined by the MTT assay to ensure the optimal concentration of hesperetin. Chondrocytes were randomly divided into three groups, including the control group, model group, and experimental group. The cellular model of osteoarthritis was established in the latter two groups by simulating chondrocytes with lipopolysaccharide. Chondrocytes in the experimental group was then intervened with hesperetin for 24 hours. Calcein-AM/EthD-I staining was used to detect cell viability. Immunohistochemical staining was performed to determine the expression of type II collagen in chondrocytes. Intracellular reactive oxygen species level was detected by a reactive oxygen species detection kit. Total glutathione level was detected by ELISA. Real-time fluorescent PCR was employed to detect the expression of interleukin 1β, interleukin 6, tumor necrosis factor α and type II collagen.
RESULTS AND CONCLUSION: Safranine O staining results showed that the cells extracted were chondrocytes. Cytotoxicity test results showed 0.5 μmol/L hesperetin had the most significant effect on chondrocyte vitality. Compared with the control group, the model group showed a decrease in chondrocyte proliferation ability, an increase in reactive oxygen species levels, a decrease in total glutathione levels, an increase in type II collagen degradation, an increase in the levels of interleukin 1β, interleukin 6, and tumor necrosis factor α, and a decrease in the expression of type II collagen (P < 0.05). Compared with the model group, in the experimental group, the proliferation ability of chondrocytes increased, reactive oxygen species levels decreased, total glutathione levels increased, and type II collagen degradation decreased, levels of interleukin 1β, interleukin 6, and tumor necrosis factor α downregulated, and the expression of type II collagen upregulated (P < 0.05). To conclude, hesperetin has a protective effect on lipopolysaccharide-induced inflammatory degeneration of osteoarthritic chondrocytes, and the mechanism may be associated with inhibition of reactive oxygen species-mediated oxidative stress.

Key words: chondrocyte, hesperetin, reactive oxygen species, oxidative stress, inflammation, cartilage degeneration

中图分类号:

罗善超, 唐继仁. 橙皮素抑制氧化应激影响软骨细胞的炎性退变[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4184-4188.

Luo Shanchao, Tang Jiren. Effect of hesperetin on inflammatory degeneration of chondrocytes by inhibiting oxidative stress[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(26): 4184-4188.

图/表（结果） 7

2.1 软骨细胞的鉴定结果番红O染色后碱性染料与细胞蛋白多糖结合，使细胞变为红色，细胞具有分泌蛋白多糖的功能，表明是软骨细胞，见图1。

2.2 橙皮素对软骨细胞的细胞毒性作用用梯度浓度的橙皮素(0，0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 μmol/L)处理对数生长期的软骨细胞24 h，通过MTT法检测橙皮素对软骨细胞的细胞毒性。由图2可见，与对照组(0 μmol/L)相比，橙皮素在0.125-2.0 μmol/L的浓度范围内对软骨细胞没有显著的细胞毒性。当浓度为0.5 μmol/L时，细胞活力最佳。然而，当橙皮素浓度为2.0-8.0 μmol/L时，软骨细胞的活力呈下降趋势。因此，0.5 μmol/L被认为是干预骨关节炎软骨细胞的橙皮素最佳浓度，并选择此浓度为橙皮素的工作浓度。

2.3 橙皮素促进骨关节炎软骨细胞的增殖通过Calcein-AM/EthD-Ⅰ染色检测橙皮素对细胞活力的影响。由图3可见，与对照组相比，模型组死细胞增多、活细胞减少(P < 0.05)。与模型组相比，实验组活细胞增多、死细胞减少(P < 0.05)。说明橙皮素对体外培养的骨关节炎软骨细胞生长有促进作用。

2.4 橙皮素抑制骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原降解采用免疫组织化学方法检测骨关节炎大鼠软骨细胞中Ⅱ型胶原的沉积情况。软骨细胞经过Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后，胞浆区染色为棕黄色，由图4可见，与对照组相比，模型组软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性染色明显减少(P < 0.05)；然而橙皮素干预的实验组软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性染色较模型组增加(P < 0.05)。

2.5 橙皮素抑制骨关节炎软骨细胞内活性氧水平使用活性氧测定试剂盒分析各组软骨细胞内活性氧水平。由图5可见，与对照组相比，模型组软骨细胞的活性氧水平显著升高(P < 0.05)；而橙皮素干预的实验组软骨细胞的活性氧水平较模型组降低(P < 0.05)。

2.6 橙皮素增加骨关节炎软骨细胞的总谷胱甘肽水平由图6可见，与对照组相比，模型组软骨细胞的总谷胱甘肽水平显著降低(P < 0.05)，而实验组软骨细胞的总谷胱甘肽水平较模型组升高(P < 0.05)。结果表明，橙皮素抑制了脂多糖诱导骨关节炎软骨细胞的氧化应激。

2.7 软骨细胞特异性基因及炎症相关基因的表达由图7可见，与对照组相比，模型组软骨细胞的白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α基因表达均显著升高，Ⅱ型胶原基因表达降低(P < 0.05)；与模型组比较，实验组软骨细胞的白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α基因表达均明显降低，Ⅱ型胶原基因表达升高(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，两组间的比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年10月至2020年10月在广西医科大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性SD大鼠乳鼠，SPF级，3 d龄，体质量10-12 g，购自广西医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK桂2020-0004。该研究已通过玉林市中西医结合骨科医院伦理委员会审批，批准号：20200315。
1.3.2 化学品和试剂橙皮素(纯度≥95%) (上海源叶生物，中国)；脂多糖、Ⅱ型胶原酶(Sigma，美国)；钙黄绿素/乙锭均二聚物(Calcein-AM/EthD-Ⅰ)试剂(百奥莱博，中国)；胎牛血清、青霉素/链霉素、DMEM培养基(Gibco，美国)；胰蛋白酶(Solarbio，中国)；蛋白酶K(Boster，中国)；Ⅱ型胶原一抗、FITC免疫荧光抗体(博士德，美国)；总RNA提取试剂盒、番红O染色试剂盒(Solarbio，中国)；免疫组织化学试剂(中山市金桥生物科技有限公司，中国)；MTT (98%，Reagent grade)、活性氧检测试剂盒、总谷胱甘肽检测试剂盒(碧云天，中国)；反转录试剂盒(Fermentas Company，美国)；引物(金开瑞，中国)；所有其他化学品均为试剂级。
1.4 实验方法
1.4.1 关节软骨细胞的分离、培养和鉴定用过量戊巴比妥钠处死3 d龄SD乳鼠，用体积分数75%乙醇消毒。收获膝关节软骨，将软骨剪成1 mm3的小块，首先用0.25%胰蛋白酶处理30 min，然后用Ⅱ型胶原酶(2 mg/mL)处理4 h，1 000 r/min离心5 min收集软骨细胞，用含1%青霉素/链霉素和体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液培养，每两三天更换1次培养液，细胞融合度约为80%时进行传代，第3代细胞用于后续研究。番红O染色鉴定软骨细胞。
1.4.2 MTT法检测细胞毒性收集对数生长期的第3代软骨细胞，按照5 000个/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后，将培养液替换为含不同浓度(0，0.125，0.25，0.5，1，2，4，8 μmol/L)橙皮素的新鲜培养液，继续培养24 h，弃去旧培养液，更换为新的培养液，添加MTT试剂(10 µL/孔)并放入37 ℃培养箱内，4 h后弃去培养液，加入二甲基亚砜(100 µL/孔)在37 ℃下避光反应15 min，用酶标仪测定490 nm波长的吸光度值。细胞增殖率=[(实验组吸光度值-空白调零孔吸光度值)/(对照组吸光度值-空白调零孔吸光度值)]×100%。根据细胞毒性实验结果选择后续实验橙皮素的浓度。
1.4.3 软骨细胞分组及处理软骨细胞培养至第3代，随机分组如下：①对照组：用DMEM培养液培养细胞；②模型组：用含10 μg/mL 脂多糖的DMEM完全培养液诱导软骨细胞损伤；③实验组：用含10 μg/mL 脂多糖的DMEM完全培养液诱导软骨细胞损伤，1 h后更换含0.5 μmol/L橙皮素的DMEM培养液培养24 h。
1.4.4 Calcein-AM/EthD-Ⅰ染色检测软骨细胞活性将第3代软骨细胞接种到24孔板中(2×104个/孔)，细胞融合至80%-90%时，按上述1.4.3软骨细胞分组和处理后，PBS洗涤3次，加入0.05% Calcein-AM和0.2% EthD-Ⅰ染色试剂，37 ℃下避光处理5 min，PBS清洗去除染色试剂，荧光显微镜观察、拍照，用Image J软件统计活细胞和死细胞数目，计算细胞增殖率。
1.4.5 免疫组织化学检测软骨细胞Ⅱ型胶原的表达根据说明书采用免疫组化染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。将第3代软骨细胞接种到6孔板中(2×105个/孔)，待细胞融合度达到 80%-90%时，按上述1.4.3软骨细胞分组和处理后，用体积分数4%甲醛溶液固定30 min，用0.3%Triton X-100渗透10 min，在25 ℃下用5% BSA阻断15 min，添加Ⅱ型胶原一抗(1∶200稀释)，在4 ℃下孵育过夜，在室温下依次添加二抗(羊抗兔 1∶200)和生物素标记的辣根过氧化物酶避光孵育1 h，然后加入二氨基苯联胺显色，苏木精复染，乙醇逐级脱水，中性胶封固，荧光显微镜观察。
1.4.6 DCFH-DA检测软骨细胞内活性氧水平使用活性氧测定试剂盒分析软骨细胞内活性氧水平。将第3代软骨细胞接种到6孔板中(2×105个/孔)，待细胞融合度达到 80%-90% 时，按上述1.4.3软骨细胞分组和处理后，将样品与DCFH-DA(10 μmol/L)探针共同培养30 min，PBS洗涤3次，使用酶标仪(Thermo Fisher Scientific，USA)测量488 nm激发和525 nm发射的荧光强度来检测细胞内活性氧水平。
1.4.7 ELISA 试剂盒检测软骨细胞总谷胱甘肽水平通过总谷胱甘肽检测试剂盒检测软骨细胞中抗氧化剂总谷胱甘肽水平。将第3代软骨细胞接种到6孔板中(2×105个/孔)，待细胞融合度达到 80%-90%时，按上述1.4.3软骨细胞分组和处理后，PBS洗涤3次，离心和收集细胞，弃去上清，加入蛋白去除试剂S，液氮和37 ℃水浴快速冻融样品2次，在4 ℃下低温离心(10 000×g)10 min，收集上清用于ELISA检测总谷胱甘肽水平。

1.4.8 qRT-PCR检测软骨细胞相关基因mRNA的表达水平将第3代软骨细胞接种到6孔板中(2×105个/孔)，待细胞融合度达80%-90%时，按上述1.4.3软骨细胞分组和处理后，提取各组细胞RNA，反转录为cDNA，LightCycler® 96实时荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)进行qPCR反应，以GAPDH为内参，检测基因白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和Ⅱ型胶原的表达。引物序列见表1。通过2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①软骨细胞培养及鉴定结果；②软骨细胞活性；③软骨细胞内Ⅱ型胶原的表达；④软骨细胞内活性氧和总谷胱甘肽水平；⑤软骨细胞相关基因mRNA的表达水平。
1.6 统计学分析采用Graphpad prism 6.0统计分析软件对实验数据进行分析，计量资料以x±s表示，多组数据比较采用单因素方差分析，组间重比较采用Tukey’s法，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经通过广西医科大学生物统计学专家审核。

讨论

目前，骨关节炎的药物治疗主要包括镇痛和抗炎药物、关节内注射透明质酸等。然而，这些药物的作用是暂时的，并不能缓解或阻止骨关节炎的发展，疾病晚期需要行关节置换手术治疗。因此，迫切需要寻找新的潜在的药物来缓解、延缓或逆转骨关节炎的发展。橙皮素是一种天然黄酮类物质，具有多种药理作用，如抗肿瘤作用[15-16]、抗炎症作用[17]、抗糖尿病[18-19]、抗氧化作用[20]。白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α在骨关节炎软骨损伤中具有重要作用，可以导致软骨分解。该研究显示，橙皮素可以抑制骨关节炎软骨细胞炎症基因白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达，也缓解了脂多糖对软骨细胞增殖的抑制作用。这些结果表明，橙皮素对脂多糖诱导的骨关节炎软骨细胞具有显著的保护和抗炎作用。
活性氧的产生对于正常的细胞信号通路至关重要，但是过量产生的活性氧可以激活氧化应激并超越细胞抗氧化防御机制，从而导致细胞损伤。研究发现，香叶木素可激活YAP信号通路，进而抑制活性氧水平而减轻高糖诱导的血管内皮细胞损伤[21]；具有过氧化氢酶和超氧化物歧化酶样活性的纳米酶( PtCuSe纳米酶)可以通过级联清除活性氧减轻帕金森病动物模型神经细胞损伤[22]。骨关节炎患者表现出相对较高的活性氧水平和较低的抗氧化活性，抑制活性氧过量产生和增加抗氧化活性可能是缓解骨关节炎的有效策略。王旭东等[23]研究发现，脂多糖可以诱导软骨细胞活性氧增加、超氧化物歧化酶活性下降、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达减少和细胞凋亡，二甲双胍干预后活性氧降低、超氧化物歧化酶活性增加、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达增加和细胞凋亡减少。该研究使用脂多糖诱导软骨细胞也可以导致活性氧增加，并且降低了总谷胱甘肽水平，橙皮素干预后活性氧降低、总谷胱甘肽水平升高、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达增加，表明橙皮素可以通过抗氧化作用保护脂多糖诱导的软骨细胞损伤。
橙皮素具有强大的抗氧化活性和抗炎活性，已被证明能够通过抗氧化作用降低氧化应激水平而对多种疾病如钙化性主动脉瓣疾病、心肌损伤、高尿酸血症、创伤性脊髓损伤、急性肾损伤等发挥保护作用[24-27]。郭玲等[28]研究发现，橙皮素可能通过调控circ_0039411/miR-296-5p抑制白细胞介素1β诱导的白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、干扰素γ、cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9水平而改善软骨细胞损伤。另外有研究表明，橙皮素能够抑制白细胞介素1β诱导的肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达，同时促进Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的产生，从而保护软骨细胞[29]。然而，橙皮素在骨关节炎中发挥保护作用的机制尚不完全清楚。在这项研究中发现了橙皮素能够保护软骨细胞，与对照组相比，模型组软骨细胞增殖能力降低，活性氧水平升高，总谷胱甘肽水平下降和Ⅱ型胶原降解增加，炎症基因白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达水平上调和Ⅱ型胶原表达水平下调；经橙皮素干预后，软骨细胞的增殖能力上升，活性氧水平下降，总谷胱甘肽水平上升，Ⅱ型胶原降解减少，炎症基因白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达下调和软骨特异性基因Ⅱ型胶原表达上调。这些研究结果表明，橙皮素可以通过抗炎作用保护骨关节炎软骨细胞，可能机制是橙皮素通过抑制活性氧介导的氧化应激缓解脂多糖诱导的骨关节炎软骨细胞损伤。该研究的不足之处：①未能完全阐述橙皮素对骨关节炎软骨细胞炎性退变的机制及作用靶点；②未在蛋白质表达方面检测炎性因子相关蛋白的表达；③未开展动物实验进一步探索。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

橙皮素抑制氧化应激影响软骨细胞的炎性退变

Effect of hesperetin on inflammatory degeneration of chondrocytes by inhibiting oxidative stress

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