生物羊膜修复跟腱断裂大鼠跟腱粘连及对愈合的影响

doi:10.12307/2024.375

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (15): 2297-2301.doi: 10.12307/2024.375

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生物羊膜修复跟腱断裂大鼠跟腱粘连及对愈合的影响

杨晓光1，时艳程1，马韬1，张继敏1，张伟2

1河北省张家口市第二医院，河北省张家口市 075000；2河北医科大学第三医院，河北省石家庄市 050000

收稿日期:2022-09-13 接受日期:2023-06-01 出版日期:2024-05-28 发布日期:2023-09-16
通讯作者: 杨晓光，硕士，主治医师，河北省张家口市第二医院，河北省张家口市 075000
作者简介:杨晓光，男，1981年生，河北省张家口市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事神经肌腱修复及功能重建方面的研究。
基金资助:
河北省医学科学研究课题计划项目(20200986)，项目负责人：张伟；张家口市重点研发计划项目(2021121D)，项目负责人：杨晓光

Effects of biological amniotic membrane on tendon adhesion and healing in ruptured Achilles tendon rats

Yang Xiaoguang1, Shi Yancheng1, Ma Tao1, Zhang Jimin1, Zhang Wei2

1Second Hospital of Zhangjiakou, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China; 2Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China

Received:2022-09-13 Accepted:2023-06-01 Online:2024-05-28 Published:2023-09-16
Contact: Yang Xiaoguang, Master, Attending physician, Second Hospital of Zhangjiakou, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China
About author:Yang Xiaoguang, Master, Attending physician, Second Hospital of Zhangjiakou, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China
Supported by:
Medical Science Research Project of Hebei Province, No. 20200986 (to ZW); Key Research and Development Plan Project of Zhangjiakou City, No. 2021121D (to YXG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

跟腱损伤：跟腱是连接脚跟骨和小腿肌肉的结构，负责支持足部运动和稳定性。在剧烈运动、长时间站立或某些疾病的影响下，跟腱可能会遭受损伤，导致疼痛和运动功能障碍。跟腱损伤分为两种类型：部分断裂和完全断裂，部分断裂通常会产生轻微的疼痛和运动不适，而完全断裂会导致严重的疼痛、无法行走和其他严重并发症。
生物羊膜：是指从羊胎盘中提取的一种生物材料，主要由羊胚胎盘的羊膜和羊水组成。生物羊膜具有天然的生物相容性和生物活性，具有许多独特的生理功能，包括促进皮肤细胞增生和修复、促进血管形成和免疫调节等，可用于创面覆盖、组织修复和再生医学等领域。

背景：跟腱损伤术后跟腱粘连会导致跟腱的生物力学性能下降、愈合能力减弱及超微结构改变，进而影响到患者的日常生活和工作能力，因此，如何有效处理和预防跟腱粘连已成为临床治疗的热点和难点问题。

目的：分析生物羊膜对跟腱断裂大鼠术后跟腱粘连、生物力学及超微结构的影响。
方法：取60只6周龄SD大鼠建立双侧后肢跟腱断裂模型，采用随机数字表法分2组干预：模型组直接缝合肌腱断端，羊膜组将生物羊膜包裹于断裂吻合口周围后缝合固定，每组30只。术后1，2，4周，评估跟腱粘连、生物力学、组织形态与结构及p38、ERK1/2蛋白表达。

结果与结论：①术后1周，两组大鼠跟腱及腱周组织轻度水肿，其中模型组跟腱组织粘连较明显；干预后2周，模型组大鼠跟腱及腱周组织仍有水肿，跟腱与周围组织粘连程度重于羊膜组；术后4周，两组大鼠跟腱周围均无水肿，愈合良好，羊膜组跟腱粘连程度轻于模型组。羊膜组大鼠术后2，4周的跟腱最大拉力大于模型组(P < 0.001)。②苏木精-伊红染色与透射电镜观察显示，术后1周，两组大鼠跟腱肌腱结构紊乱，胶原纤维排列稀疏，其中模型组可见明显的炎性反应与跟腱粘连；术后2周，模型组仍可见明显的炎性反应、跟腱粘连，胶原纤维无规则排序，羊膜组大鼠胶原纤维排列整齐、成纤维细胞内质网扩张；术后4周，模型组大鼠跟腱胶原纤维组织增厚、排列紊乱，成纤维细胞内粗面内质网较少，羊膜组胶原纤维排列有序且较薄，成纤维细胞内含大量粗面内质网。③术后4周的蛋白免疫印迹检测显示，羊膜组大鼠跟腱组织中p38及ERK1/2蛋白表达均低于模型组(P < 0.05)。④结果表明，生物羊膜可促进断裂跟腱术后的愈合、抑制跟腱粘连，该作用可能与调控MAPK/ERK信号通路有关。

https://orcid.org/0000-0002-7267-4907(杨晓光)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 生物羊膜, MAPK, ERK, 跟腱粘连, 生物力学, 超微结构变化

Abstract: BACKGROUND: Achilles tendon adhesion after Achilles tendon injury can lead to decreased biomechanical properties, weakened healing ability, and ultrastructural changes of Achilles tendon, which further affects patients’ daily life and work ability. Therefore, how to effectively deal with and prevent Achilles tendon adhesion has become a hot and difficult problem in clinical treatment.
OBJECTIVE: To analyze the effects of biological amniotic membranes on postoperative Achilles tendon adhesion, biomechanics, and ultrastructural changes in rats with Achilles tendon rupture.
METHODS: Sixty 6-week-old SD rats were selected to establish bilateral Achilles tendon rupture models and divided into two groups (n=30 per group) by the random number table method. In the model group, the severed end of the tendon was sutured directly. In the amniotic membrane group, the biological amniotic membrane was wrapped around the broken anastomosis and fixed by a suture. The adhesion, biomechanics, morphology, and structure of the Achilles tendon and the expression of p38 and ERK1/2 protein were evaluated 1, 2, and 4 weeks after surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) 1 week after operation, the Achilles tendon and peritendinous tissues of the two groups were mildly edema, and the adhesion of the Achilles tendon tissues in the model group was more obvious. 2 weeks after the intervention, the Achilles tendon and peritendinous tissues of the model group still had edema, and the adhesion degree between the Achilles tendon and the surrounding tissues was heavier than that of the amniotic membrane group. 4 weeks after operation, there was no edema around the Achilles tendon in both groups, and the healing was well. The adhesion degree of the Achilles tendon in the amniotic membrane group was less than that in the model group. The maximum tension of Achilles tendons in the amniotic membrane group was higher than that in the model group at 2 and 4 weeks after operation (P < 0.001). (2) Hematoxylin-eosin staining and transmission electron microscopy revealed that 1 week after operation, the tendon structure of rats of the two groups was disordered and the collagen fibers were sparsely arranged, in which the model group demonstrated obvious inflammatory reaction and adhesion to the Achilles tendon. Two weeks after operation, the model group still demonstrated obvious inflammatory response, adhesion of Achilles tendon, and irregular ordering of collagen fibers. The amniotic membrane group exhibited an orderly arrangement of collagen fibers and expansion of the endoplasmic reticulum of fibroblasts. At 4 weeks after operation, the collagen fibers of the Achilles tendon in the model group were thickened and disordered, and the rough endoplasmic reticulum was less in the fibroblasts, while the collagen fibers in the amniotic membrane group were ordered and thin, and the fibroblasts contained a large number of rough endoplasmic reticulum. (3) Four weeks after operation, western blot assay exhibited that the expressions of p38 and ERK1/2 protein in the Achilles tendon tissue of rats in the amniotic membrane group were lower than those in the model group (P < 0.05). (4) The results confirm that the biologic amniotic membrane can promote the healing and inhibit the adhesion of Achilles tendon after the operation of the ruptured Achilles tendon, which may be associated with the regulation of the MAPK/ERK signaling pathway.

Key words: biological amniotic membrane, MAPK, ERK, Achilles tendon adhesion, biomechanics, ultrastructural change

中图分类号:

杨晓光, 时艳程, 马韬, 张继敏, 张伟. 生物羊膜修复跟腱断裂大鼠跟腱粘连及对愈合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2297-2301.

Yang Xiaoguang, Shi Yancheng, Ma Tao, Zhang Jimin, Zhang Wei. Effects of biological amniotic membrane on tendon adhesion and healing in ruptured Achilles tendon rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(15): 2297-2301.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 60只大鼠全部进入结果分析。
2.2 术后不同时间点两组大鼠跟腱粘连情况术后1周，两组大鼠跟腱及腱周组织轻度水肿，出现轻度粘连，其中模型组粘连较明显；术后2周，模型组仍有水肿，模型组跟腱与周围组织粘连程度高于羊膜组；术后4周，两组跟腱周围均无水肿，愈合良好，羊膜组跟腱粘连程度明显轻于模型组。术后不同时间点两组大鼠跟腱粘连分数比较，见表1。

2.3 术后不同时间点两组大鼠跟腱生物力学比较术后1周，跟腱处于胶原降解、炎症反应阶段，跟腱内部尚未愈合，羊膜组大鼠跟腱最大拉力略高于模型组，但差异无显著性意义(P > 0.05)；术后2周，炎症显著缓解，损伤处有纤维细胞生长，羊膜组大鼠跟腱弹性恢复较多，最大拉力明显高于模型组(P < 0.001)；术后4周，羊膜组大鼠跟腱弹性恢复更多，最大拉力明显高于模型组(P < 0.001)，见表2。

2.4 术后不同时间点两组大鼠跟腱组织形态学观察结果见图1。

术后1周，两组大鼠跟腱纤维结构紊乱，可见少量未成熟成纤维细胞增殖，模型组毛细血管扩张充血严重，可见明显炎性反应，羊膜组肌腱粘连较模型组轻。术后2周，模型组肌腱粘连厚度增加，迁移到跟腱修复部位，毛细血管充血减弱，仍有炎症细胞浸润；羊膜组肌腱粘连程度为中度，模型组肌腱粘连程度严重。术后4周，模型组跟腱恢复过程中形成的胶原纤维增生组织多且致密，成纤维细胞数量增多且分布紊乱；羊膜组跟腱端部胶原纤维排列有序，成纤维细胞趋于成熟，胶原纤维较薄。
2.5 术后不同时间点两组大鼠跟腱组织结构见图2。

术后1周，羊膜组大鼠跟腱中胶原纤维排列稀疏，可见横纹(箭头)，肌腱细胞呈现圆形和椭圆形，胞质内粗面内质网和胶原基质丰富；模型组大鼠跟腱中胶原纤维排列稀疏，肌腱细胞规则性较差且胶原纤维稀少，细胞内可见髓样小体、线粒体、粗面内质网扩张，部分线粒体呈空泡状，细胞膜有破裂，核染色质较集聚。术后2周，羊膜组大鼠跟腱中胶原纤维排列整齐，周期性横纹核椭圆，成纤维细胞染色丰富；模型组大鼠跟腱胶原纤维无规则排序，内有少量粗面内质网，囊腔轻度扩张，内含少量内容物。术后4周，羊膜组大鼠跟腱中胶原纤维数量较多且排列整齐，内含有大量粗面内质网，腔内充满分泌物；模型组胶原纤维排列紊乱，成纤维细胞内粗面内质网较羊膜组少。
2.6 术后4周两组大鼠跟腱组织中p38及ERK1/2蛋白表达的比较与模型组大鼠相比，羊膜组大鼠跟腱组织中p38及ERK1/2蛋白表达降低(P < 0.05)，见图3。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2022年1-12月在河北省张家口市第二医院实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 60只SPF级SD大鼠，6周龄，雄性，体质量180-220 g，购自凯学生物科技(上海)有限公司，动物许可证号：SCXK(沪)2020-0017。大鼠饲养于河北省张家口市第二医院SPF级动物实验中心所属单位，常规饲养，饲养温度为18-24 ℃，单笼饲养，定期换洗消毒。该实验严格按照动物伦理学标准进行。实验已通过河北省张家口市第二医院动物伦理委员会审批(批准号：Y20210213)。
1.3.2 药物、仪器与试剂戊巴比妥钠购自上海新亚药业有限公司；生物羊膜购买自上海雅吉生物科技；蛋白电泳仪购买自北京德元国际科技公司；p38抗体购买自上海科敏生物科技；ERK1/2抗体购买自上海梵态生物科技；苏木精-伊红染色试剂盒购买自北京索莱宝科技；透射电镜购买自武汉迈斯普生物科技。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组与干预采用随机数字表法将60只SD大鼠分为模型组与羊膜组，每组30只。腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，将大鼠俯卧固定在手术板上，双后肢后伸，剔除双后肢毛发，碘伏消毒，体积分数75%乙醇再次消毒，铺消毒巾，暴露大鼠双后肢跟腱，切断跟腱，建立跟腱断裂模型；羊膜组在肌腱断裂吻合口周围包裹2 cm×2 cm的生物羊膜，用7-0无损伤尼龙线缝合固定；模型组采用改良Kessler法，用7-0无损伤尼龙线缝合断裂的跟腱。
1.4.2 大鼠跟腱粘连及愈合情况观察术后1，2，4周，每组每个时间点随机取6只大鼠，麻醉后大体观察跟腱粘连情况。肌腱粘连等级分数[11]：0分，无明显的粘连；1分，轻度粘连，有一些不明显的纤维粘连带；2分，中度粘连，有清晰易识别的粘连带；3分，严重粘连，有厚实密集的粘连带，阻碍肌腱滑动；4分，极度粘连，完全限制肌腱活动。
1.4.3 跟腱生物力学实验术后1，2，4周，取部分跟腱标本，将跟腱远端及足部固定于力学测定仪的下端，将跟腱近端固定于力学测定仪的上端，用下端夹具固定跟腱另一端，进行力学测试前先将测定仪调零，测试肌腱滑动距离，设定拉伸速度为2 mm/min；逐渐增加拉力负荷，测定跟腱被拉断时所需的拉力为跟腱最大拉力。以上测定结果均由计算机直接生成。
1.4.4 透射电镜观察跟腱组织结构术后1，2，4周，取部分跟腱标本，置入2.5%戊二醛固定液中固定1 h，放入蔗糖溶液(0.18 mol/L)中浸泡2 h，冲洗；1%锇酸溶液固定2 h，从锇酸溶液中取出后依次进入梯度丙酮脱水30 min，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，置于电镜下观察。
1.4.5 跟腱组织形态观察术后1，2，4周，取部分跟腱标本，置于40 g/L多聚甲醛液固定24 h；取出已经固定好的跟腱组织，梯度乙醇脱水，透明，浸蜡包埋，切片(4 μm厚度)；二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，水洗5 min；置于苏木精染色5 min，放入蒸馏水中浸泡5 min，冲洗20 min；置于伊红染色10 min，再次梯度乙醇脱水，透明，中性树胶封固，置于光镜下观察。
1.4.6 跟腱组织中相关蛋白检测术后4周，取每组剩余的12只大鼠跟腱组织标本，以PBS冲洗后切碎，加入1 mL的细胞裂解液，4 ℃下10 000×g 离心5 min；取上清液，加入样孔中，采用 BCA 法测总蛋白浓度；每孔上样蛋白量20 μg，SDS-PAGE 凝胶电泳；转印缓冲液配制好后要放入4 ℃冰箱内预冷，然后全部转移到PVDF膜上，再把脱脂奶粉加入，全程封闭时长为1 h；加入一抗p38(1∶500)、ERK1/2(1∶500)
4 ℃孵育过夜；TTBS 漂洗3次，每次10 min；加入羊抗兔IgG二抗(1∶2 500)，ECL化学发光试系统JY-Clear分析p38、ERK1/2蛋白表达，以GAPDH作为内参。
1.5 主要观察指标各组大鼠跟腱粘连、生物力学、组织形态与结构及p38、ERK1/2蛋白的表达。
1.6 统计学分析采用GraphPad Priam 8.0统计学软件进行分析，各组计量结果符合正态分布，采用x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经河北省张家口市第二医院统计学专家审核。

讨论

跟腱有着非常重要的功能，它连接了腿部的肌肉和足部的骨骼，负责着人体行走、奔跑、跳跃等各种动作，但由于跟腱承受着巨大的拉伸力，一旦受到过度的压力或者剧烈撞击就容易发生损伤[12-13]。现阶段，手术是治疗跟腱损伤的主要方法，但其也会增加肌腱粘连的风险，影响术后康复[14]。肌腱修复过程中应促进纤维细胞大量增殖产生胶原纤维，完成修复。已有文献报道，生物羊膜对肌腱粘连有较好的效果[15]。因此，此次实验探讨生物羊膜对跟腱断裂大鼠术后跟腱粘连、生物力学及超微结构的影响，为寻找更好的治疗方法提供参考依据。
此次实验结果显示，与模型组相比，羊膜组大鼠跟腱术后1，2，4周的最大载荷有所升高，说明跟腱承受外力能力的提高。跟腱的生物力学研究主要涉及到它的力学特性，包括剪切力、拉伸力、扭转力等。跟腱在身体运动中承受着巨大的拉力和压力，因此其力学特性对于正常的身体运动至关重要。在跟腱损伤的治疗和康复中生物力学也起到了重要作用。通过测量跟腱的力学特性来评估跟腱损伤程度和康复进展，或者通过物理治疗和康复训练来改善跟腱的力学特性，可促进跟腱愈合[16-17]。生物力学能够反映跟腱肌肉、骨骼和肌腱等组织的形态结构和机械特性，通过提高跟腱的生物力学特性可以缓解跟腱损伤[18-19]。生物羊膜是一种来源于羊胎盘的天然材料，具有良好的生物相容性，被广泛应用于各种软组织损伤的治疗，包括跟腱损伤。研究表明，生物羊膜中含有多种细胞因子和生长因子，这些因子可以刺激干细胞分化为成纤维细胞，促进胶原合成和血管生成，加速跟腱修复和重建[20]。白江博等[21]通过建立动物肌腱损伤模型，采用生物力学检测发现，使用羊膜干预可以促进肌腱的恢复、提高肌腱愈合质量。
此次实验发现，生物羊膜干预后可改善断裂跟腱组织形态学和超微结构。跟腱损伤后组织形态和超微结构都会发生一系列变化，通常情况下跟腱损伤包括部分断裂、完全断裂等程度的损伤。在部分断裂的情况下，跟腱组织中的纤维束受到破坏，导致组织结构紊乱和断裂。在超微结构方面，跟腱损伤后组织发生改变，可表现为纤维断裂和破坏、直径分布改变、细胞形态改变等，影响跟腱的修复和再生过程。有研究已经证实羊膜是可吸收的，在体内约4个月基本降解完全，并且羊膜吸收可促进肌腱愈合，能够有效避免外源性愈合、促进内源性愈合，有利于损伤肌腱愈合[22]。生物羊膜中含有多种生长因子，具有多项生物活性和生物功能，可以刺激跟腱内的肌腱细胞增殖和基质合成，从而加速受损跟腱的修复。跟腱损伤后容易引发炎症反应和纤维化过程，这些过程会阻碍跟腱的修复和再生，应用生物羊膜可以有效抑制这些过程，从而有利于重建跟腱正常组织结构[23]。
此次实验发现经过生物羊膜干预后，大鼠跟腱组织中p38MAPK及ERK1/2蛋白表达明显降低。p38MAPK和ERK1/2都是细胞信号传导通路中的重要成员，分别参与了许多细胞的生理和病理过程，在跟腱损伤中这两个信号通路也扮演着至关重要的角色。p38MAPK是一种丝裂原活化蛋白激酶，广泛存在于各种细胞中。研究表明，在跟腱损伤中p38MAPK的激活会促进炎症反应的发生[24-25]。在反复应力刺激下，肌腱细胞内的p38MAPK激活会导致炎症因子的释放和编码基因的表达，引起炎症反应[26]。此外，p38MAPK还可以通过调节细胞凋亡、基质合成和氧化应激等过程来影响跟腱的修复[27]。ERK1/2也是MAPK家族成员之一，参与了多种细胞生理和病理过程，在跟腱损伤中ERK1/2的激活也发挥着重要的调节作用[28]。研究表明在跟腱损伤后，ERK1/2激活与肌腱细胞增殖和基质合成有关。研究证明，ERK途径在一些细胞中有助于Smad介导的信号传导，ERK2参与成纤维细胞生长因子2诱导的胶原表达和成纤维细胞增殖，这有助于肌腱手术后粘连的形成[29]。有研究表明，跟腱损伤大鼠中采用维拉帕米通过降低细胞内钙离子浓度进而抑制p38和ERK1/2通路激活，抑制纤维细胞过度增殖[30]。此外，ERK1/2还可以促炎症反应影响跟腱的正常生理状态[31-34]。有研究提出，抑制p38MAPK导致白细胞介素6表达显著下降，说明抑制p38可能有助于减轻炎症反应[35]。张治金等[36]研究发现过生物羊膜干预后可以降低p38蛋白以及ERK蛋白及其磷酸化蛋白的水平，修复软骨损伤。
实验结果证实，生物羊膜能有效阻止跟腱周结缔组织的侵入、降低跟腱组织中p38及ERK1/2蛋白表达、增加跟腱的最大拉力、预防跟腱粘连，并且该作用与调控MAPK/ERK信号通路蛋白表达有关。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

生物羊膜修复跟腱断裂大鼠跟腱粘连及对愈合的影响

Effects of biological amniotic membrane on tendon adhesion and healing in ruptured Achilles tendon rats

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