高糖微环境下糖原合酶激酶3β抑制剂Tideglusib干预大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化

doi:10.12307/2023.620

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (19): 2968-2974.doi: 10.12307/2023.620

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

高糖微环境下糖原合酶激酶3β抑制剂Tideglusib干预大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化

罗文豪1，2，冯乐2，3 ，黄海霞1，2，刘敏1，2，王频1，2

1西南医科大学附属口腔医院修复科，四川省泸州市 646000；2口颌面修复重建和再生泸州市重点实验室，四川省泸州市 646000；3攀枝花学院附属医院口腔科，四川省攀枝花市 617000

收稿日期:2022-06-25 接受日期:2022-08-01 出版日期:2023-07-08 发布日期:2022-11-28
通讯作者: 王频，硕士，主治医师，西南医科大学附属口腔医院修复科，四川省泸州市 646000；口颌面修复重建和再生泸州市重点实验室，四川省泸州市 646000
作者简介:罗文豪，男，1997年生，福建省南平市人，汉族，西南医科大学在读硕士，主要从事口腔修复、种植的基础与临床研究。
基金资助:
四川省医学科研课题计划项目(S19023)，项目负责人：刘敏；泸州市科技计划项目(2021-JYJ-68)，项目负责人：黄海霞

Effect of glycogen synthase kinase-3 beta inhibitor Tideglusib on proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells under high glucose microenvironment

Luo Wenhao1, 2, Feng Le2, 3, Huang Haixia1, 2, Liu Min1, 2, Wang Pin1, 2

1Department of Prosthodontics, Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Luzhou Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 3Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Panzhihua University, Panzhihua 617000, Sichuan Province, China

Received:2022-06-25 Accepted:2022-08-01 Online:2023-07-08 Published:2022-11-28
Contact: Wang Pin, Master, Attending physician, Department of Prosthodontics, Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Luzhou Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Luo Wenhao, Master candidate, Department of Prosthodontics, Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Luzhou Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Medical Research Project of Sichuan Province, No. S19023 (to LM); Science and Technology Plan Project of Luzhou City, No. 2021-JYJ-68 (to HHX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

Tideglusib：是一种噻二唑烷酮类的小分子药物，是糖原合酶激酶3β的非ATP竞争性抑制剂，该药物最开始应用于阿尔茨海默症等神经退行性疾病的临床研究中，可改善学习和记忆水平，诱导神经元的再生，并有少量动物实验证明其可以促进骨缺损的修复。
Wnt/β-catenin经典信号通路：Wnt/β-catenin经典通路的信号传递包括3个环节：膜上的Wnt信号转导、细胞质中β-catenin的稳定和核移位以及细胞核中Wnt靶基因的激活。作为经典通路参与了细胞的多种生理功能，是间充质干细胞生理活动的决定性调节因素，在成骨代谢活动中发挥着重要作用。

背景：高糖环境能够抑制骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化能力，如何提高成骨细胞在高糖状态下的生物学活性，是改善糖尿病患者种植体骨结合的关键。
目的：探究非ATP竞争性的特异性糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)抑制剂Tideglusib在高糖微环境下对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。
方法：采用全骨髓贴壁法培养并纯化大鼠骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞分为4组：正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)，Tideglusib+正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+20 nmol/L Tideglusib)，高糖组(25.5 mmol/L葡萄糖)，Tideglusib+高糖组(25.5 mmol/L葡萄糖+20 nmol/L Tideglusib)。①CCK-8法检测细胞的增殖情况；②成骨诱导培养4，7 d后检测碱性磷酸酶的活性；③成骨诱导培养21 d后采用茜素红染色检测钙化结节的形成；④细胞接种24 h后鬼笔环肽染色观察细胞的初期黏附形态；⑤RT-qPCR检测成骨基因Runx2、OPN的mRNA表达，Western blot检测β-catenin和p-GSK-3β的蛋白表达。
结果与结论：①Tideglusib(20 nmol/L)不仅显著促进骨髓间充质干细胞的增殖(P < 0.05)，还能逆转高糖环境对骨髓间充质干细胞增殖的抑制作用(P < 0.05)；②Tideglusib(20 nmol/L)显著减轻高糖环境对碱性磷酸酶活性的抑制作用(P < 0.05)，并促进高糖状态下钙化结节产生(P < 0.05)；③Tideglusib(20 nmol/L)能够改善骨髓间充质干细胞被高糖环境破坏的黏附形态；④与高糖组比较，在高糖环境下Tideglusib(20 nmol/L)可上调成骨基因Runx2、OPN的mRNA表达(P < 0.05)；⑤与高糖组比较，在高糖环境下Tideglusib(20 nmol/L)可上调Wnt/β-catenin信号通路相关靶点β-catenin蛋白的表达，下调p-GSK-3β蛋白的表达(P < 0.05)；⑥结果表明，Tideglusib(20 nmol/L)能够通过激活Wnt/β-catenin信号通路从而逆转高糖环境对骨髓间充质干细胞初期黏附形态的破坏以及对细胞增殖和成骨分化的抑制。
https://orcid.org/0000-0002-6666-7735 (罗文豪)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: Tideglusib, 骨髓间充质干细胞, 高糖微环境, 细胞增殖, 成骨分化, Wnt/β-catenin, 黏附形态, 骨桥蛋白

Abstract: BACKGROUND: High glucose condition can inhibit the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, and how to improve the biological activity of osteoblasts in high glucose conditions is the key to improve osseointegration in diabetic patients.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Tideglusib, a non-ATP-competitive specific glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) inhibitor, on the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells under high glucose conditions.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were cultured and purified by whole bone marrow apposition method. Bone marrow mesenchymal stem cells were divided into four groups as follows: normal control group (5.5 mmol/L glucose), Tideglusib group (5.5 mmol/L glucose + 20 nmol/L Tideglusib), high glucose group (25.5 mmol/L glucose), and Tideglusib + high glucose group (25.5 mmol/L glucose+20 nmol/L Tideglusib). (1) The proliferation activities of cells were detected by CCK-8 assay. (2) Alkaline phosphatase activity was detected at 4 and 7 days after osteogenic differentiation in each group. (3) Calcium nodules were detected by alizarin red staining at 21 days after osteogenic differentiation in each group. (4) Phalloidin staining was used to observe the adhesion morphology of each group after 24 hours of inoculation. (5) RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of osteogenic genes Runx2 and OPN. Western blot assay was used to detect the protein expression of β-catenin and p-GSK-3β.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Tideglusib (20 nmol/L) not only significantly promoted the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (P < 0.05), but also reversed the inhibitory effect of the high glucose on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (P < 0.05). (2) Tideglusib (20 nmol/L) significantly reduced the inhibitory effect of high glucose conditions on alkaline phosphatase activity (P < 0.05) and promoted the formation of calcified nodules under high glucose conditions (P < 0.05). (3) Tideglusib (20 nmol/L) could improve the adhesion morphology of bone marrow mesenchymal stem cells damaged by high glucose conditions. (4) Compared with the high glucose group, Tideglusib (20 nmol/L) up-regulated the mRNA expression of osteogenic genes Runx2 and OPN under the high glucose conditions (P < 0.05). (5) Compared with the high glucose group, Tideglusib (20 nmol/L) upregulated the expression of Wnt/β-catenin pathway related target β-catenin protein and down-regulated the expression of p-GSK-3β protein under high glucose conditions (P < 0.05). (6) The results showed that Tideglusib (20 nmol/L) could reverse the damage of high glucose conditions on the initial adhesion morphology, cell proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by activating Wnt/β-catenin signaling pathway.

Key words: Tideglusib, bone marrow mesenchymal stem cell, high glucose microenvironment, cell proliferation, osteogenic differentiation, Wnt/β-catenin, adhesion morphology, osteopontin

中图分类号:

罗文豪, 冯乐, 黄海霞, 刘敏, 王频. 高糖微环境下糖原合酶激酶3β抑制剂Tideglusib干预大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(19): 2968-2974.

Luo Wenhao, Feng Le, Huang Haixia, Liu Min, Wang Pin. Effect of glycogen synthase kinase-3 beta inhibitor Tideglusib on proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells under high glucose microenvironment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(19): 2968-2974.

图/表（结果） 10

2.1 骨髓间充质干细胞形态及其成骨、成脂潜能 48 h后镜下可见少部分呈多角形的贴壁细胞，大小不一；3 d后贴壁的细胞伸展较为明显，呈梭形或多角形等；5 d左右细胞紧密融合在一起形成明显的细胞集落；7-10 d细胞可长满培养瓶底。随着换液和传代，细胞形态逐渐变得均匀一致，胞体饱满，细胞密集排列相互挤压，呈梭形，漩涡状均匀排列，见图1。第3代大鼠骨髓间充质干细胞分别进行成骨、成脂诱导21 d后可见钙化结节及脂滴形成，见图2。

2.2 流式细胞技术鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原经流式细胞仪检测表面抗原的表达，见图3，CD29、CD90呈阳性表达，表达率为99.72%，99.89%，CD34和CD45呈阴性表达，阳性表达率为4.71%，0.06%。

2.3 Tideglusib减轻高糖微环境对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的抑制各组骨髓间充质干细胞的增殖情况见图4。在第1天时，Tideglusib+正常对照组增殖活性较为明显，与其他组相比，差异均有显著性意义(P < 0.05)；其余组间增殖量差异均无显著性意义(P > 0.05)；在第3，5天时，与正常对照组相比，高糖组细胞增殖能力受到明显抑制(P < 0.05)；与高糖组相比，Tideglusib+高糖组细胞的增殖量升高(P < 0.05)，但仍小于Tideglusib+正常对照组(P < 0.05)。

2.4 Tideglusib减轻高糖微环境下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化障碍各组成骨诱导4 d和7 d后，碱性磷酸酶染色显示：Tideglusib+正常对照组的碱性磷酸酶染色程度最深，高糖组的碱性磷酸酶染色程度低于正常对照组，Tideglusib+高糖组的碱性磷酸酶染色程度优于高糖组，见图5。碱性磷酸酶活性定量测定显示：在第4，7天时，Tideglusib+正常对照组的碱性磷酸酶活性高于其他各组(P < 0.05)；高糖组的碱性磷酸酶活性低于其他各组(P < 0.05)；Tideglusib+高糖组的碱性磷酸酶活性高于高糖组(P < 0.05)，见图6。成骨诱导21 d后，茜素红染色显示：Tideglusib+正常对照组茜素红特异性红染的钙化结节较多，染色较深，红染斑块面积较大，钙化结节形成能力较强；正常对照组的红染钙化结节数量低于Tideglusib+正常对照组，且红染斑块面积小于Tideglusib+正常对照组；Tideglusib+高糖组的红染结节少于正常对照组，且斑块较小；高糖组的红染结节数量和面积最小。钙化结节半定量检测结果显示，Tideglusib+正常对照组的钙化结节数量最多，差异均有显著性意义(P < 0.05)，高糖组的钙化结节数量最低，差异有显著性意义(P < 0.05)，Tideglusib+高糖组的钙化结节数量大于高糖组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

2.5 Tideglusib改善高糖微环境下骨髓间充质干细胞初期黏附形态使用荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在不同培养条件下培养24 h后细胞初期黏附形态，正常对照组的骨髓间充质干细胞多呈梭形或者多角形，胞内肌动蛋白丝清晰可见，细胞骨架与细胞长轴走形一致；Tideglusib+正常对照组相较于正常对照组细胞铺展更佳、面积更大，肌动蛋白丝数量更多；高糖组的细胞铺展不良，内部的肌动蛋白丝排列紊乱，细胞骨架卷曲，与细胞长轴不平行；与高糖组相比，Tideglusib+高糖组细胞内肌动蛋白丝排列更加规律，细胞铺展面积更大，细胞形态得到明显改善，见图8。

2.6 Tideglusib上调高糖微环境下大鼠骨髓间充质干细胞成骨标志基因的表达 RT-qPCR结果显示Tideglusib+正常对照组的Runx2、OPN基因表达量高于其他3组(P < 0.05)；Tideglusib+高糖组的基因表达量低于Tideglusib+正常对照组，而高于高糖组(P < 0.05)；与其他组相比，高糖组的Runx2、OPN基因表达量最低 (P < 0.05)，见图9。

2.7 Tideglusib上调高糖微环境下大鼠骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin经典通路相关蛋白的表达 Western blot结果显示Tideglusib+正常对照组p-GSK-3β和β-catenin的表达量高于其他组，差异有显著性意义(P < 0.05)；高糖组p-GSK-3β和β-catenin蛋白的表达量最低，与其他组比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)；Tideglusib+高糖组的表达量略低于正常对照组，与高糖组、Tideglusib+正常对照组比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图10。

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引言

随着口腔医学和材料学的发展，种植修复治疗已成为患者和临床医生首选的修复治疗方案。糖尿病作为一种代谢性的疾病，其特征是血糖长期处于高水平的状态，为种植体周围微生物提供有利的生长环境，提高了种植体周围炎的患病
率[1]。同时糖尿病患者体内晚期糖基化终末产物、硬化蛋白、5-羟色胺水平升高，抑制成骨细胞功能[2-4]，影响骨代谢和种植体骨结合[5-6]。研究表明2型糖尿病患者种植手术的愈后与术后血糖控制水平密切相关[7]，与血糖控制良好的2型糖尿病患者相比，血糖控制不佳者的种植体骨结合更差[8]。但由于影响血糖控制的因素多种多样，患者往往难以较好地自主控制血糖。因此探究在高糖环境下促进成骨细胞生物活性的方法具有重要的临床意义。
Tideglusib作为一种噻二唑烷酮类的小分子药物，是糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)的非ATP竞争性抑制剂。Tideglusib可促进SD大鼠牙体穿髓孔处修复性牙本质的形成[9]，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进牙髓干细胞分化为成牙本质细胞[10]。在动物骨缺损实验中，Tideglusib显著提高骨缺损区骨质形成，同时下调GSK-3β的表达，上调β-catenin的表达[11-12]。但是Tideglusib是否能用于改善高糖环境下成骨细胞的生物学活性还需进一步研究。
实验采用全骨髓贴壁法体外分离培养并纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，研究Tideglusib在高糖微环境下对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响，为改善糖尿病患者种植体骨结合提供一种新的研究参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。采用单因素方差分析方法(One-Way ANONA)对组间差异进行分析。
1.2 时间及地点实验于2020年4-11月在西南医科大学口腔颌面修复重建和再生实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠20只，三四周龄，体质量为60-100 g，雌雄不限，购买于成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK(川)2020-030，实验单位使用许可证号：SYXK(川)2018-065，西南医科大学实验动物福利伦理审查表编号：NO: 20210810-1。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂 α-MEM基础培养液(美国，Gibco公司)；双抗溶液(中国，碧云天生物技术有限公司)；胎牛血清(以色列，BI公司)；胰蛋白酶消化液(美国，Gibco公司)；地塞米松、β-甘油磷酸钠、胰岛素、抗坏血酸、吲哚美辛、IBMX、1%茜素红染色液、油红O染色液(中国，Solarbio科技有限公司)；NBT/BCIP碱性磷酸酶显色试剂盒(中国，上海生工生物工程有限公司)；RNA提取试剂盒(中国，TianGen生化科技公司)；PCR引物(中国，上海生物生工)；qPCR RT Master Mix、SYBR®Green Realtime PCR Master Mix(日本，Toyobo公司)；SDS-PAGE凝胶(中国，碧云天公司)；RIPA裂解液(中国，Bioteke生物技术有限公司)；QuickBlock Western溶液套装(中国，碧云天公司)；β-catenin抗体、p-GSK-3β抗体、GSK-3β抗体、β-actin抗体(美国，Abcam公司)；Tideglusib(中国，上海麦克林生化科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养采用异氟烷吸入麻醉联合颈椎脱臼法处死SD大鼠并将其置于体积分数为75%乙醇中浸泡2次，每次5 min，转移至超净台中，无菌外科器械取出双侧股骨、胫骨，剔除骨骼周围附着的多余组织，将股骨和胫骨浸泡在无菌预热的PBS中清洗3次，去除骨组织表面多余碎屑后，将其置于含有双抗溶液的预热PBS中，反复清洗3次。无菌组织剪剪断骨头两端的骨骺，用5 mL无菌注射器抽取α-MEM培养液反复冲洗骨髓腔，冲洗直至骨骼发白后收集骨髓冲洗液并转移至15 mL离心管中，1 000 r/min室温低速离心5 min，移液枪吸弃上清液，加入含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的完全培养液轻柔吹打细胞沉淀，将细胞悬液接种于底面积为25 cm2的无菌塑料培养瓶中，放置于37 ℃、体积分数为5%CO2恒温孵育箱内培养，显微镜下观察细胞生长情况，2 d后对原代骨髓间充质干细胞进行半量换液，此后每2 d全量换液1次。显微镜下观察细胞生长情况，待细胞生长达90%时，按1∶2传代。第3代细胞用于后续所有实验。

1.4.2 流式细胞技术鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原取对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞，PBS清洗3次后，使用胰酶消化，收集细胞悬液，1 000 r/min常温低速离心5 min，弃上清，加入预冷的无菌PBS轻柔吹打细胞沉淀，血球计数板在显微镜下计数，使细胞密度为1×105个，分装在5个无菌EP管中，各0.2 mL。向对应的EP管中分别加入CD29、CD34、CD45、CD90抗体各100 µL，未加入抗体的细胞悬液为空白对照组，室温避光静置孵育25-30 min，上流式细胞仪检测，并用FCS Express软件进行结果分析。
1.4.3 成骨诱导收集对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞，以2×104个/cm2的密度接种于直径为3.5 cm的培养皿中，设置3个复孔。待细胞生长至70%-80%时，每孔更换新鲜的成骨诱导培养液2 mL(10-7 mol/L地塞米松、10-2 mol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C)避光培养，每隔2 d进行半量换液1次。待细胞成骨诱导21 d后，移液枪吸去原有的成骨诱导液，PBS清洗细胞3次，每次5 min，每孔加入1 mL 40 g/L多聚甲醛溶液固定细胞30 min，吸去固定液，PBS再次清洗细胞3次，每次5 min，每孔加入1 mL 1%茜素红染液，室温避光染色30 min，吸去多余的茜素红染色液，PBS清洗，显微镜下拍照分析，并拍摄大体图。
1.4.4 成脂诱导收集对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞，以2×104个/cm2的密度接种于直径为3.5 cm的培养皿中，设置3个复孔。待细胞生长至70%-80%时，吸弃原有的培养液，PBS清洗细胞3次后，每孔加入2 mL成脂诱导A液，诱导3 d后更换为2 mL成脂诱导B液并继续诱导1 d，按照此诱导步骤A液和B液交替诱导21 d后，吸去原有成脂诱导液，PBS清洗细胞3次，每次5 min，每孔加入1 mL 40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，吸去固定液，PBS再次清洗细胞3次，每次5 min，每孔加入1 mL油红O染液，室温避光染色30 min，吸去多余的染色液并加入PBS清洗，显微镜下观察拍照分析。
1.4.5 CCK-8法检测大鼠骨髓间充质干细胞的增殖情况取对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞，以2×107 L-1的细胞浓度接种于96孔板中，每孔100 µL细胞悬液，每组4个复孔，置于体积分数为5% CO2、37 ℃的恒温培养箱内培养。设置4组，分别为正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)，Tideglusib+正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+20 nmol/L Tideglusib)，高糖组(25.5 mmol/L葡萄糖)，Tideglusib+高糖组(25.5 mmol/L葡萄糖+20 nmol/L Tideglusib)。细胞贴壁后，按以上分组处理1，3，5 d后，按照CCK-8试剂盒说明书检测细胞增殖情况。
1.4.6 碱性磷酸酶活性检测取第3代骨髓间充质干细胞，待细胞生长至70%-80%时，同1.4.5描述分为4组，加入成骨诱导培养液2 mL进行成骨诱导，每隔2 d进行半量换液1次。在第4，7天时根据碱性磷酸酶显色试剂盒和碱性磷酸酶测试试剂盒的说明书进行碱性磷酸酶活性检测。
1.4.7 茜素红染色取第3代骨髓间充质干细胞，待细胞生长至70%-80%时，同1.4.5描述分为4组，加入成骨诱导培养液2 mL进行成骨诱导21 d后进行茜素红染色，显微镜下拍照。拍照完成后使用PBS洗涤，向每孔中加入氯化十六烷基吡啶水溶液，充分溶解钙化结节后于562 nm波长处测量各组的吸光度值。
1.4.8 鬼笔环肽染色观察细胞骨架将第3代骨髓间充质干细胞以5×106 L-1的细胞浓度接种于预先放置细胞爬片的24孔板中，每孔0.5 mL，实验分组同1.4.5。培养24 h后，预热PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛溶液室温固定细胞10 min，PBS清洗3次后向每个孔中加入0.5% Triton X-100溶液500 µL并静置5 min，PBS清洗3次，加入鬼笔环肽工作液，室温避光静置30 min，PBS清洗细胞3次，DAPI复染细胞核30 s，擦掉多余的DAPI溶液，封固，倒置荧光显微镜进行观察拍照。
1.4.9 RT-qPCR检测成骨标志基因的表达根据1.4.5的分组进行成骨诱导4 d后，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，并用Rever traAce®qPCR RT Master Mix 反转录成 cDNA，SYBR®Green Realtime PCR Master Mix在 ABI PRISM 7300 Fast Real-Time PCR System 中进行 PCR 扩增引物。基因表达相对量=2-ΔΔCT，PCR引物见表1。

1.4.10 Western blot检测信号通路中关键蛋白水平根据1.4.5的分组进行成骨诱导4 d后，使用细胞裂解液(PMSF∶蛋白酶抑制剂∶Lysis Buffer=10 μL∶1 µL∶1 mL)提取细胞内总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，使用上样缓冲液稀释蛋白并沸水水浴8 min，通过SDS-PAGE分离样品，转至 PVDF膜，使用5%脱脂牛奶于摇床上室温封闭1 h，TBST漂洗3次，将膜与一抗(anti-β-catenin、anti-p-GSK-3β、anti-GSK-3β、anti-β-actin)4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，室温下与二抗孵育1 h，TBST漂洗3次，加入ELC显色液，凝胶成像系统(Bio-Rad)中曝光蛋白条带，使用Image J软件分析目的蛋白条带的灰度值。
1.5 主要观察指标 ①大鼠骨髓间充质干细胞的形态及其成骨、成脂诱导分化潜能；②Tideglusib在正常/高糖微环境下对骨髓间充质干细胞增殖和初期黏附形态的影响；③
Tideglusib在正常/高糖微环境下对骨髓间充质干细胞内碱性磷酸酶和钙化结节的影响；④Tideglusib在正常/高糖微环境下对骨髓间充质干细胞成骨标志基因mRNA表达的影响，对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 26.0中的单因素方差分析方法(One-Way ANONA)进行相关数据处理，结果用x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。每项实验重复3次。统计学方法已经西南医科大学生物统计学专家审核。

讨论

研究证实，高糖环境不仅可以抑制骨髓间充质干细胞的增殖，也可抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。其中，25.5 mmol/L的葡萄糖浓度可抑制骨髓间充质干细胞内碱性磷酸酶的活性和细胞外钙化结节的形成[13-14]、成骨相关基因Runx2以及OPN和Wnt/β-catenin经典信号中β-catenin蛋白的表达，同时上调Wnt/β-catenin经典信号中负调节蛋白GSK-3β的表达[15-18]。高糖环境还能通过增加Wnt通路抑制剂硬化素的产生，从而诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化[19]。对比糖尿病大鼠和正常大鼠的骨髓间充质干细胞的生物学行为，发现高糖环境可抑制骨髓间充质干细胞的生物学活性并加速其凋亡[20]。该研究通过CCK-8法检测高糖环境对骨髓间充质干细胞增殖的影响，结果表明与正常对照组相比，高糖组在72 h后的细胞增殖率有显著降低，在24 h内高糖环境对细胞增殖率的抑制并不明显，可能是在培养初期细胞具有一定的代偿能力，且高糖环境为细胞提供了充足的能量，所以其对骨髓间充质干细胞的抑制作用并不明显。
Tideglusib作为不可逆的GSK-3β抑制剂，最开始应用于阿尔茨海默症等神经退行性疾病的临床研究中，可改善学习和记忆水平，诱导神经元的再生[21]，还能促进大鼠骨缺损的修复[12]、牙髓干细胞的成血管分化[22]。同时Tideglusib也可促进大鼠表皮干细胞的增殖，从而促进缺损创面的修复[23]。但是，目前尚无Tideglusib在高糖环境下对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响及其机制等研究。在该实验中，Tideglusib+正常对照组的细胞增殖率高于正常对照组，Tideglusib+高糖组的细胞增殖率高于高糖组，表明20 nmol/L
Tideglusib对大鼠骨髓间充质干细胞增殖率有明显的促进作用，并可以减轻高糖环境对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的抑制作用。成骨细胞正常的骨架形态是其发挥成骨生物学行为、促进其在种植体表面伸展黏附的前提[24]。高糖环境下细胞铺展不佳，内部的丝状结构卷曲，排列紊乱，在加入Tideglusib
后细胞形态更加舒展，骨架排列更为规律，且大致与细胞长轴一致，表明Tideglusib对改善高糖环境下骨髓间充质干细胞的初期黏附具有一定的作用。同时在高糖环境下，大鼠骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性、细胞外矿化结节的形成及成骨标志基因(Runx2、OPN)的mRNA表达均被抑制，表明高糖抑制了细胞的成骨分化能力。重要的是，该研究发现，相较于正常对照组和高糖组，在加入Tideglusib后，Tideglusib+正常对照组和Tideglusib+高糖组中碱性磷酸酶的定性染色和定量检测、细胞外矿化结节分泌、成骨标志基因(Runx2、OPN)的mRNA表达均提高，提示Tideglusib能够提高大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，改善高糖环境对细胞成骨分化能力的抑制。
Wnt/β-catenin经典信号通路对成骨细胞的增殖、成骨分化以及骨的形成具有重要作用[25]。激活Wnt/β-Catenin通路可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化[26]。经典Wnt信号通路是由β-catenin介导的，在没有Wnt蛋白的刺激下或者胞质中的GSK-3β蛋白被异常激活时，胞质内的β-catenin将会被GSK-3β磷酸化，进而被泛素化，最终被蛋白酶体系快速降解，从而抑制下游信号的生理功能[27-28]。研究表明，高糖可上调成骨细胞中GSK-3β的水平[29]，同时可以通过介导Wnt/β-Catenin经典通路影响成骨细胞的增殖和分化[30]。动物实验证明在高糖微环境下GSK-3β具有对骨髓间充质干细胞的负成骨作用，而抑制GSK-3β可促进骨髓间充质干细胞在高糖环境下的成骨效应[31]。当Wnt蛋白激活时可以促进GSK-3β的磷酸化，并抑制GSK-3β对β-Catenin的降解作用，β-catenin在胞质内大量积累并易位到细胞核中与T细胞转录因子(T cell factor，TCF)/淋巴促进因子(lymphoid enhancing factor，LEF)结合，进一步调节Wnt靶基因如Runx2等的表达[32]，从而促进成骨细胞的增殖及成骨作用。在该研究中，Western blot结果显示，高糖环境使骨髓间充质干细胞内的p-GSK-3β/总GSK-3β比例下调，β-catenin的表达降低，这与其他学者的研究结果一致，从另一个角度说明高糖环境使得细胞内的非磷酸化GSK-3β/总GSK-3β比例上调并导致了β-catenin的磷酸化。而Tideglusib可以上调高糖环境下p-GSK-3β和β-catenin的表达，证明Tideglusib能够在高糖环境下激活Wnt/β-catenin经典信号通路。结合前面的实验结果，Tideglusib+高糖组细胞的增殖、成骨能力均大于高糖组，说明Tideglusib可逆转高糖环境对骨髓间充质干细胞内Wnt/β-catenin经典信号通路的抑制作用，从而促进细胞的增殖以及成骨分化。
综上所述，Tideglusib可通过激活Wnt/β-catenin经典信号通路，促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖、黏附和成骨分化，同时可改善高糖环境对细胞增殖、黏附和成骨分化的抑制作用，对改善糖尿病患者种植体骨结合提供了理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

高糖微环境下糖原合酶激酶3β抑制剂Tideglusib干预大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化

Effect of glycogen synthase kinase-3 beta inhibitor Tideglusib on proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells under high glucose microenvironment

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