2.1   实验动物数量及一般情况分析   36只大鼠随机分为假手术组、模型组和川芎嗪组，每组12只。大鼠脊髓完全横断后即刻出现双后肢抽搐、摆尾等动作，苏醒后双后肢自主运动功能消失。36只大鼠术后均未死亡，伤口无感染迹象，部分大鼠术后前3 d出现血尿，经青霉素皮下注射后痊愈，未见其他明显不适。
2.2   后肢运动功能评估   
2.2.1   BBB评分   术前36只大鼠BBB评分均为21分。术后各时间点，假手术组大鼠BBB评分均为21分，较其他两组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。模型组与川芎嗪组大鼠造模后7 d后肢爪面朝上，可见轻微的单个后肢关节运动；造模后14 d，可见后肢2个关节活动，BBB评分均无显著改善(P > 0.05)。各组大鼠造模后各时间点BBB评分见图1A。
2.2.2   改良Rivlin斜板实验结果   术前所有大鼠斜板角度均能维持在60°左右；术后1 d，假手术组大鼠斜板角度略有下降，其余时间均恢复至正常，较其他两组差异有显著性意义(P < 0.05)；模型组与川芎嗪组大鼠术后各时间点斜板角度相比差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图1B。



2.3   苏木精-伊红染色结果    假手术组脊髓组织白质、灰质界限清晰，组织连续完整；与假手术组相比，模型组脊髓缺损处瘢痕增生，组织破坏明显，细胞核出现明显固缩，头尾端均出现不同程度水肿，脊髓空洞逐渐形成，炎性细胞大量浸润；川芎嗪组炎性细胞浸润相对较少，见图2。



2.4   Nissl染色结果   假手术组脊髓结构完整，神经元数量较多，可见呈虎斑状的尼氏体；与假手术组相比，模型组脊髓缺损邻近组织内神经元数量明显减少；川芎嗪组神经元数量较模型组多，可见到部分未凋亡的神经元，见图3。



2.5   血清C-反应蛋白表达情况   ELISA结果显示，与7 d相比，模型组脊髓损伤后14 d血清C-反应蛋白水平呈下降趋势，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4A。术后各时间点，模型组血清C-反应蛋白水平相较假手术组均明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05)；川芎嗪组C-反应蛋白水平均低于模型组，术后第14天模型组及川芎嗪组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4B。



2.6   组织炎性因子表达情况   炎性因子核因子κB、肿瘤坏死因子α、白细胞介素10弥散性散在分布于脊髓组织断端两侧，阳性表达呈棕褐色。假手术组脊髓组织未见明显炎性因子表达；造模后7 d，模型组核因子κB、肿瘤坏死因子α阳性表达均多于假手术组(P < 0.05)，白细胞介素10阳性表达较少；与模型组相比，川芎嗪组脊髓组织核因子κB、肿瘤坏死因子α表达量显著降低，白细胞介素10表达量显著升高，两组间核因子κB、白细胞介素10的表达量相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5及表1。

造模后14天，模型组核因子κB、肿瘤坏死因子α和白细胞介素10的阳性表达与假手术组差异均有显著性意义(P < 0.05)，模型组白细胞介素10的阳性表达量与川芎嗪组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6及表2。

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脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤性疾病，长久以来缺乏有效的治疗手段[1-2]。不同部位和程度的脊髓损伤可导致不同程度的残疾，包括从部分感觉或运动功能丧失到损伤部位以下完全瘫痪[3]，对肝肾、心血管等系统的正常生理功能亦有一定影响[4]。脊髓损伤患者在生理与心理上承受着巨大的痛苦，家庭与社会负担也因此加重。因此，明确脊髓损伤的发病机制、寻找有效的治疗手段成为亟需解决的问题[5-6]。

脊髓损伤的病理机制主要分为两个阶段：原发性损伤和继发性损伤[7]。脊髓损伤后局部微环境的变化是复杂的，微环境的失衡主要表现为组织、细胞或分子在不同时间与空间内抑制因子增加和促进因子减少[8]。炎症反应在脊髓损伤后微环境失衡的过程中占据重要地位，研究发现，炎症反应是加剧脊髓继发性损伤的关键因素[9-10]。脊髓损伤后中性粒细胞浸润、小胶质与巨噬细胞激活，均会导致促炎细胞因子表达上调，引起炎性微环境的失衡[11]。如何有效调控炎症反应、减轻促炎因子的释放、维持炎性微环境的平衡是治疗的重点。

川芎嗪药理作用广泛，既往的研究主要集中于心脑血管领域[12-13]。ZHANG等[14]在脑脊髓膜炎的研究中发现，川芎嗪能够通过介导核因子κB信号通路调节小胶质细胞的极化状态，进而抑制促炎细胞因子的释放，保护血脊髓屏障的完整性。近年来，川芎嗪已被逐步应用于脊髓损伤的基础研究，目前多认为该药物能改善脊髓损伤后微循环障碍、抑制神经元凋亡等[15]，对于其是否能调控脊髓损伤炎症反应尚缺乏有效的研究。因而，此次研究通过建立脊髓完全横断大鼠模型[16]，检测核因子κB及相关炎性因子，初步探索川芎嗪调控脊髓损伤后炎性微环境的作用与机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，符合正态分布、方差齐性的计量资料采用单因素方差分析；正态分布、方差不齐或非正态分布的计量资料采用非参数检验。
1.2   时间及地点   实验于2021年10-12月在中国中医科学院基础研究所动物实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   SPF级健康8周龄雌性SD大鼠36只，体质量220-240 g，购于中国中医科学院骨伤研究所，动物合格证编号：SCXK(京)2021-0008。造模前，大鼠统一于标准动物实验环境下(温度22 ℃，湿度40%-50%，12 h光/暗循环)适应性喂养1周，4只/笼，不限制饮食活动。实验方案经北京中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：BUCM-2021040802-2029。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   实验试剂与仪器   尼氏染色液(索莱宝，北京)；C-反应蛋白ELISA试剂盒(索莱宝，北京)；核因子κB、白细胞介素10抗体(三鹰生物，武汉)；肿瘤坏死因子α抗体(Abcam，英国)；抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(三鹰生物，武汉)。
1.4   实验方法   将36只大鼠采用随机数字表法分为假手术组、模型组和川芎嗪组，每组12只。术前所有大鼠禁饮食12 h，经0.3%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，备皮消毒，俯卧位固定于操作台上。以T9/T10骨性标志点为中心，使用15号尖刀片沿棘突纵行切开皮肤、筋膜，剥离并用撑开器撑开两侧椎旁肌，咬骨钳咬除T9、T10棘突，暴露椎板骨面及关节突关节内侧缘，深入椎板间隙咬除T9、T10椎板，暴露脊髓。假手术组仅行T10椎板切除；模型组与川芎嗪组采用4-0缝合线沿椎管侧壁进入，对侧穿出，缝线轻微提起脊髓，使用自制显微双刃剪离断脊髓，离断长度2 mm，明胶海绵填塞止血。生理盐水冲洗伤口，依次缝合各层组织。术后每天20×104 U青霉素皮下注射，连续3 d。大鼠4只/笼饲养，室温保持22 ℃，术后每日早、中、晚3次按摩膀胱排尿，术后1周改为早、晚各1次。

川芎嗪组术后30 min腹腔注射盐酸川芎嗪注射液，注射剂量为200 mg/(kg·d)；其他两组均经相同途径给予同剂量生理盐水，连续治疗5 d。给药剂量根据人体表面积等比例换算[17]。

1.5   主要观察指标   
1.5.1   后肢运动功能评估   造模后1，3，7，14 d分别采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分[18]、改良Rivlin斜板实验对大鼠进行行为学检测[19]，评估肢体运动功能恢复情况。

BBB评分：共22个等级，0分表示完全瘫痪，21分表示正常。观察时间为晚上19：00，观测时间5 min，双人双盲，结果取平均值。

改良Rivlin斜板实验：将大鼠置入自制平板上，保持大鼠头部朝上，身体纵轴与斜板倾斜方向平行，每次将平板倾斜度提高5°，记录大鼠在平板上维持5 s而不滑落的角度。

1.5.2   苏木精-伊红染色   造模后14 d，每组分别取6只大鼠麻醉后行多聚甲醛心脏灌注，待大鼠全身僵硬后，以脊髓损伤处为中心，取约1.5 cm长脊髓组织，标注头尾端。采用全自动脱水机脱水后，行石蜡包埋，制作石蜡切片，片厚5 μm。行苏木精-伊红染色，封固后于光学显微镜下扫描观察。
1.5.3   Nissl染色   取材步骤同1.5.2。采用全自动脱水机脱水后，行石蜡包埋，制作石蜡切片，片厚5 μm。切片脱蜡至水，0.5%甲苯胺蓝水溶液56 ℃温箱中浸染40 min，体积分数95%乙醇溶液镜下控制分色，封固后于光学显微镜下扫描观察。
1.5.4   ELISA法检测血清C-反应蛋白表达   造模后7，14 d，大鼠腹主动脉取血5 mL，室温下3 500 r/min离心10 min，取上清液。根据ELISA试剂盒的操作步骤进行实验，通过标准曲线检测C-反应蛋白的表达情况。
1.5.5   免疫组织化学染色检测炎性因子表达   石蜡切片步骤同1.5.2。PBS冲洗3次，每次5 min；抗原修复液修复15 min，冷却至室温；体积分数3%双氧水阻断室温孵育30 min，PBS冲洗2次，每次5 min；3%BSA室温孵育30 min；分别滴加核因子κB一抗(1∶100)、肿瘤坏死因子α一抗(1∶200)、白细胞介素10一抗(1∶50)，4 ℃过夜，滴加适当比例稀释的二抗，37 ℃孵育30 min；PBS水洗后DAB显色3 min，苏木精染色5 min，盐酸乙醇分化、反蓝后，透明封固，镜下观察。利用Image J对免疫组化结果进行定量分析，分别计算各组平均吸光度值。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已经通过北京中医药大学生物统计学专家审核。采用SPSS 25.0统计分析软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，符合正态分布、方差齐性的计量资料采用单因素方差分析；正态分布、方差不齐或非正态分布的计量资料采用非参数检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

脊髓原发性机械损伤后，损伤局部会立即出现缺血缺氧、水肿以及氧化应激，随着病情进一步发展，炎性细胞大量浸润、神经元凋亡、轴突变性脱髓鞘以及胶质瘢痕形成，最终导致不可逆性损伤[20-22]。继发性损伤中，炎症反应占据了重要地位，过度的炎症反应破坏了微环境的平衡，阻碍了神经再生与功能恢复[23]。近年来，研究者们普遍认为脊髓损伤后的炎症反应是一把“双刃剑”，因此根据脊髓损伤后炎症反应的变化机制进行针对性干预，对于治疗脊髓损伤至关重要[24]。脊髓微环境是组织、细胞、因子等正常代谢活动所形成的环境，炎性微环境主要由中性粒细胞、单核巨噬细胞、小胶质细胞、T细胞、B细胞以及多种炎性因子组成。脊髓损伤早期，中性粒细胞与单核细胞浸润至损伤区域，小胶质细胞激活，促炎因子与抗炎因子比例失衡；脊髓损伤慢性期以淋巴细胞介导为主，T细胞与B细胞浸润并长期发挥作用，直接或间接地参与神经元的凋亡[25]。C-反应蛋白作为机体感染或组织损伤后急性表达的非特异性血液标志物，能够一定程度上反映机体内存在的炎症反应[26]。此次实验结果发现，脊髓损伤后大鼠血清中C-反应蛋白表达量明显升高，说明机体内存在炎症反应，但随着时间的延长，C-反应蛋白的表达呈下降趋势，证明机体对于炎症反应存在内部调节能力。

炎性因子是由外周免疫细胞和神经胶质细胞产生的多肽类物质，可与靶细胞表面的相应受体结合，传递生物信息，介导炎症反应[27]。脊髓损伤后，炎性因子在时间与空间上表达与分布异常，促炎与抗炎因子稳态被破坏，导致炎性微环境失衡，使细胞凋亡程序被激活，神经元再生受到抑制[28-29]。核因子κB是由复杂的多肽亚基组成的蛋白质家族，作为真核细胞的转录因子，几乎存在于所有的细胞胞质内，其主要参与巨噬细胞所介导的免疫炎症反应，通过激活炎症信号通路产生炎性效应[30]。脊髓损伤后，神经细胞、胶质细胞内的核因子κB被激活并发生核易位，启动靶基因表达的同时，又受到肿瘤坏死因子α等促炎因子的进一步加强，形成正反馈效应[31]。核因子κB信号通路作为炎症、细胞分化、凋亡的关节调节通路，抑制其激活对于改善脊髓损伤后炎症反应、促进神经功能恢复具有重要作用[32-33]。此次研究结果与既往结论一致，脊髓损伤后损伤区域周围核因子κB阳性表达明显增多，且主要表达于细胞核内。肿瘤坏死因子α是一种具有广泛生物活性的细胞因子，在脊髓损伤后数小时内其表达量会大幅增加，自身不仅发挥神经毒性作用，还会诱导多种促炎性细胞因子的表达，加重继发性损伤[34]。研究认为，脊髓损伤后肿瘤坏死因子α的表达与核因子κB信号通路的激活密切相关，核因子κB信号通路的激活不仅受到肿瘤坏死因子α的调节，还会进一步诱导肿瘤坏死因子α的释放[31]。此次研究结果也发现，脊髓损伤后肿瘤坏死因子α的阳性表达量随着核因子κB表达量的增多而增多。白细胞介素10是一种有效的抗炎细胞因子，脊髓损伤后其可通过促进M1型单核/巨噬细胞向M2型转化，进而抑制促炎因子的释放[35]。维持脊髓组织内白细胞介素10高表达，对于改善炎性微环境，促进脊髓损伤恢复具有重要意义。此次研究发现，脊髓损伤后核因子κB、肿瘤坏死因子α的表达量明显增多、白细胞介素10的表达量极低，且上述促炎因子、抑炎因子随时间延长有改善的趋势，这说明机体自身存在一定的修复能力。

川芎嗪又名四甲基吡嗪，是从中药川芎中提取的生物碱，具有改善微循环、抗炎、抗氧化等作用[36]。现有研究证明，川芎嗪能够有效改善急性肾损伤、保护软骨细胞、缓解膝关节骨性关节炎等作用[37-39]，其作用机制多与调控核因子κB信号通路有关。川芎嗪在中枢神经系统疾病中应用也较为广泛[40-45]，李洁等[46]认为其能够通过抑制核因子κB信号通路减轻炎症反应，改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经元凋亡的情况。JIN等[47]在小鼠局灶性缺血性脑卒中的研究中发现，川芎嗪能够通过上调缺血脑组织中的单核细胞趋化蛋白诱导蛋白1，降低肿瘤坏死因子α等相关炎性因子的表达，缓解脑水肿的程度。上述研究证实了川芎嗪能够在中枢神经系统疾病中发挥有效的抗炎作用，但目前关于其在脊髓损伤方面的应用相对较少。张毅等[48]通过构建大鼠脊髓损伤模型，利用转录组测序技术预测川芎嗪治疗脊髓损伤的作用机制可能与炎症反应、免疫应答/调节等有关，但仍需进一步的实验验证。因而，此次研究构建了脊髓完全横断大鼠模型，拟从微观层面观测川芎嗪改善脊髓损伤后炎性微环境的疗效与机制；根据实验结果可知，川芎嗪能够有效降低脊髓损伤大鼠血清C-反应蛋白的表达，相较于模型组，川芎嗪组核因子κB、肿瘤坏死因子α的阳性表达明显减少，白细胞介素10表达量增多，这说明川芎嗪对于调控脊髓损伤后的炎症反应是切实有效的。通过Nissl染色结果发现，川芎嗪的神经元存活数量明显优于模型组，说明川芎嗪在抑制神经元凋亡方面具有良好的疗效，其机制可能与介导核因子κB信号通路调控炎症反应有关。

综上所述，川芎嗪能够改善脊髓组织内的炎性微环境，减轻脊髓组织的病理性损伤，抑制神经元凋亡，促进脊髓损伤修复。此次研究的创新之处在于动态、多时间点地观察川芎嗪改善脊髓损伤炎性微环境的作用，为脊髓损伤后炎症反应机制提供依据，同时为川芎嗪的干预时间点及周期提供参考。此次实验也存在一定的局限性，在模型选择方面，选择了脊髓完全横断大鼠，这导致短期内无法观察到大鼠运动功能的改变，仅能从微观分子层面探讨脊髓损伤炎症改善的情况。川芎嗪调控脊髓损伤后促炎/抑炎因子的释放可能与抑制核因子κB信号通路的激活有关，但具体的分子机制仍需进一步探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
川芎嗪：是从中药川芎的根茎中分离提纯的单体生物碱，主要用于治疗心脑血管缺血性疾病，现已被证实具有改善脊髓损伤后微循环障碍、调控神经元凋亡等作用。
脊髓损伤后炎性反应：脊髓损伤后免疫炎性反应被异常激活并持续存在，炎性细胞的浸润、促炎因子的释放均会导致炎性微环境失衡，加剧脊髓继发性损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

川芎嗪药理作用广泛，既往的研究主要集中于心脑血管领域。有学者在脑脊髓膜炎的研究中发现，川芎嗪能够通过介导核因子κB信号通路调节小胶质细胞的极化状态，进而抑制促炎细胞因子的释放，保护血脊髓屏障的完整性。近年来，川芎嗪已被逐步应用于脊髓损伤的基础研究，目前多认为该药物能改善脊髓损伤后微循环障碍、抑制神经元凋亡等，对于其是否能调控脊髓损伤炎症反应尚缺乏有效的研究。此次研究通过建立脊髓完全横断大鼠模型，检测核因子κB及相关炎性因子，初步探索川芎嗪在调控脊髓损伤后炎性微环境的作用与机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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