2型糖尿病伴牙周炎模型大鼠胰腺自噬及胰岛素相关基因蛋白的表达

doi:10.12307/2022.926

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (29): 4605-4610.doi: 10.12307/2022.926

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2型糖尿病伴牙周炎模型大鼠胰腺自噬及胰岛素相关基因蛋白的表达

都沙沙，蔡智国，杨琨，刘琪

遵义医科大学附属口腔医院牙周科，贵州省遵义市 563003

收稿日期:2021-05-28 接受日期:2021-08-06 出版日期:2022-10-18 发布日期:2022-03-27
通讯作者: 刘琪，博士，教授，遵义医科大学附属口腔医院牙周科，贵州省遵义市 563003
作者简介:都沙沙，女，1991年生，贵州省遵义市人，汉族，2019年遵义医科大学毕业，硕士，医师，主要从事牙周炎与2型糖尿病的关系研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81860196)，课题名称：2型糖尿病伴牙周炎牙周膜干细胞凋亡转归的线粒体损伤、自噬失调机制研究，项目负责人：刘琪

Pancreatic autophagy and protein expression of insulin-related genes in type 2 diabetic rats with periodontitis

Du Shasha, Cai Zhiguo, Yang Kun, Liu Qi

Department of Periodontology, Hospital of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China

Received:2021-05-28 Accepted:2021-08-06 Online:2022-10-18 Published:2022-03-27
Contact: Liu Qi, MD, Professor, Department of Periodontology, Hospital of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
About author:Du Shasha, Master, Physician, Department of Periodontology, Hospital of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81860196 (to LQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
牙周炎与糖尿病的关系：近年来，糖尿病与牙周炎之间的双向关系得到学者们的广泛认可，目前有关糖尿病对牙周炎影响的机制研究较多，主要集中在高血糖所致的高炎症状态，破骨活动增强和骨修复减弱的骨代谢平衡失调，糖基化终末产物及其受体间的相互作用；然而牙周病对糖尿病影响的研究较少，故此次研究探讨牙周炎对糖尿病胰腺组织自噬的影响。
自噬：适当的自噬可以清除体内受损的细胞器，而过度的自噬可使细胞器被过度降解从而导致细胞功能受损。

背景：糖尿病易引发全身多种器官发生病变，牙周炎是其并发症之一，牙周炎炎症程度越重，越不利于血糖控制。
目的：通过建立动物模型探索牙周炎对2型糖尿病大鼠胰腺组织自噬的影响。
方法：40只雄性6周龄SD大鼠随机分为对照组和实验组，又将实验组分为糖尿病组、牙周炎组和糖尿病伴牙周炎组，每组10只。高脂高糖喂养+腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病模型，丝线结扎法构建牙周炎模型。ELISA法检测血清中炎症因子表达水平；实时荧光定量PCR检测胰腺组织中自噬及胰岛素分泌相关基因的表达；Western Blot法检测胰腺组织中自噬相关蛋白的表达。
结果与结论：①ELISA结果显示，糖尿病组、牙周炎组及糖尿病伴牙周炎组的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6表达水平较对照组依次增加(P < 0.05)；②实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，糖尿病组、糖尿病伴牙周炎组的葡萄糖激酶、葡萄糖转运蛋白2 mRNA表达水平均下降，糖尿病伴牙周炎组的表达下降最多(P < 0.05)；同时糖尿病组、糖尿病伴牙周炎组的解偶联蛋白2、Beclin1、LC3ⅡmRNA表达均增加，糖尿病伴牙周炎组的表达增加最多(P < 0.05)；但牙周炎组与对照组各指标相比差异无显著性意义(P > 0.05)；③Western Blot结果显示，相较于对照组，糖尿病组、糖尿病伴牙周炎组的Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均增加，糖尿病伴牙周炎组表达增加最多(P < 0.05)；但牙周炎组与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；④推测2型糖尿病大鼠患牙周炎后可能诱导其胰岛细胞过度自噬，进而影响胰岛细胞分泌胰岛素的功能，最终加剧糖尿病病情。
缩略语：葡萄糖转运蛋白2：recombinant glucose transporter 2，GLUT-2

https://orcid.org/0000-0002-1313-2374 (都沙沙)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 糖尿病, 牙周炎, 自噬, 胰岛素分泌, 炎性因子

Abstract: BACKGROUND: Diabetes is prone to cause multiple organ diseases in the body. Periodontitis is one of the complications. The more severe the inflammation of periodontitis is, the less favorable it is for glycemic control.
OBJECTIVE: To investigate the effect of periodontitis on autophagy of pancreatic tissue in a rat model of type 2 diabetes mellitus.
METHODS: Forty 6-week-old male Sprague-Dawley rats were randomly divided into a control group and an experimental group, and rats in the experimental group were subdivided into three groups (n=10 per group): a diabetes group, a periodontitis group, and a diabetes+periodontitis group. High fat and high sugar feeding+intraperitoneal injection of streptozotocin was used to establish a diabetic model, and silk thread ligation was used to establish a periodontitis model. Enzyme-linked immune sorbent assay was used to detect the expression of inflammatory factors in rat serum. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression of autophagy and insulin secretion-related genes in rat pancreatic tissue. Western blot was used to detect the protein expression of autophagy-related in rat pancreatic tissue.
RESULTS AND CONCLUSION: The results of enzyme-linked immunosorbent assay showed that the expression of tumor necrosis factor α, interleukin 1β, and interleukin 6 was increased sequentially in the diabetes group, the periodontitis group, and the diabetes+periodontitis group compared with that in the control group (P < 0.05). The results of real-time fluorescent quantitative PCR showed that, compared with the control group, the mRNA expression of glucokinase and recombinant glucose transporter 2 was decreased in the diabetes group and the diabetes+periodontitis group, especially in the diabetes+periodontitis group (P < 0.05). At the same time, the mRNA expression of uncoupling protein 2, Beclin1, and LC3II was increased in the diabetes group and the diabetes+periodontitis group, and increased most in the diabetes+periodontitis group (P < 0.05). However, there was no significant difference between the periodontitis group and the control group (P > 0.05). The results of western blot showed that, compared with the control group, the expression of Beclin1, LC3II/LC3I was increased in the diabetes group and the diabetes+periodontitis group, and increased most in the diabetes+periodontitis group (P < 0.05). And there was no significant difference between the periodontitis group and the control group (P > 0.05). Therefore, it is speculated that type 2 diabetes mellitus with periodontitis may induce excessive autophagy of pancreatic islet cells, then impact the secretion function of insulin in islet cells, and finally aggravate the development of diabetes mellitus in the rat models.

Key words: diabetes, periodontitis, autophagy, insulin secretion, inflammatory factor

中图分类号:

都沙沙, 蔡智国, 杨琨, 刘琪. 2型糖尿病伴牙周炎模型大鼠胰腺自噬及胰岛素相关基因蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4605-4610.

Du Shasha, Cai Zhiguo, Yang Kun, Liu Qi. Pancreatic autophagy and protein expression of insulin-related genes in type 2 diabetic rats with periodontitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(29): 4605-4610.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析对照组10只纳入结果分析，糖尿病组、糖尿病伴牙周炎组因糖尿病导致各脱失1只，各模型组每组8只纳入结果分析。
2.2 糖尿病模型评估体质量变化：高糖高脂饲养6周后，糖尿病组、糖尿病伴牙周炎组的体质量较对照组、牙周炎组明显增加(P < 0.05)；但14周时却较对照组、牙周炎组减轻，且糖尿病伴牙周炎组减轻最多(P < 0.05)，见图1。

空腹血糖变化：高糖高脂饲养6周后，对照组和实验组间无显著性差异(P > 0.05)；第7周时，糖尿病组、糖尿病伴牙周炎组高于对照组、牙周炎组(P < 0.05)；并且在第14周时，糖尿病伴牙周炎组最高(P < 0.05)，见图2。

2.3 牙周炎模型评估 Micro-CT结果显示，牙周炎组、糖尿病伴牙周炎组第一、二磨牙牙槽骨较对照组、糖尿病组明显吸收，根分叉暴露，且糖尿病伴牙周炎组牙槽骨吸收最为显著，出现牙周炎影像学表现，这表明实验动物牙周炎模型建立成功，见图3。

釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离显示，对照组与糖尿病组牙槽骨吸收程度无差异(P > 0.05)，牙周炎组和糖尿病伴牙周炎组牙槽骨吸收均加剧(P < 0.05)，其中糖尿病伴牙周炎组吸收最多(P < 0.05)，见表2。

2.4 牙周组织病理改变镜下见对照组、糖尿病组牙槽嵴顶高度正常，结合上皮附着于釉牙骨质界处，胶原纤维束呈现多种排列方式；牙周炎组、糖尿病伴牙周炎组牙槽骨嵴顶吸收，高度降低，结合上皮向根方增殖进而形成深牙周袋，胶原纤维排列紊乱、水肿、变性、丧失，结合Micro-CT扫描结果表明牙周炎大鼠模型建成，见图4。

2.5 大鼠胰腺组织病理学改变见图5。

对照组和牙周炎组大鼠胰岛结构正常，胰岛内细胞分布均匀，排列紧密，包浆丰富，胰岛与外分泌腺分界清楚，周围腺体细胞排列紧密，见图5A，C。糖尿病组大鼠的胰岛细胞与外分泌腺界限模糊，胰岛内细胞排列疏松，周围腺体排列较松散，见图5B。糖尿病伴牙周炎组胰岛体积显著减小，胰岛细胞数量锐减，胰岛与外分泌腺界限不清，周围腺体细胞排列十分松散，见图5D。
2.6 血清炎性因子的ELISA检测结果与对照组相比，糖尿病组、牙周炎组及糖尿病伴牙周炎组白细胞介素6、白细胞介素1 β、肿瘤坏死因子α的表达水平依次增加(P < 0.05)，见图6。

2.7 实时荧光定量PCR检测胰岛素分泌及自噬相关基因的表达牙周炎组葡萄糖激酶、GLUT-2的基因表达量较对照组降低，但二者差异无显著性意义(P > 0.05)；糖尿病组和糖尿病伴牙周炎组葡萄糖激酶、GLUT-2的表达量较对照组均降低，且糖尿病伴牙周炎组降低最多(P < 0.05)，见图7A，B。
牙周炎组解偶联蛋白2、Beclin1、LC3Ⅱ的表达较对照组增加，但二者差异无显著性意义(P > 0.05)；糖尿病组、糖尿病伴牙周炎组的表达较对照组均升高，且糖尿病伴牙周炎组增加最多(P < 0.05)，见图7C-E。

2.8 Western Blot检测自噬相关蛋白的表达与对照组比较，牙周炎组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达增加，但差异无显著性意义(P > 0.05)；糖尿病组及糖尿病伴牙周炎组表达量增加(P < 0.05)，糖尿病伴牙周炎组增加最多(P < 0.05)，见图8。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析，有差异再用SNK法进行两两比较。
1.2 时间及地点实验于2016年5月至2019年9月在遵义医科大学动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级健康6周龄雄性SD大鼠40只，体质量180-220 g，由解放军第三军医大学大坪动物中心提供，动物合格证号：SCXK(渝)2012-0005，实验动物伦理学批准编号：[2016]2-068。
按随机数字法分为对照组(n=10)、实验组(n=30)；实验组又分为糖尿病组、牙周炎组及糖尿病伴牙周炎组，每组10只。
1.3.2 实验试剂链脲佐菌素(Sigma，美国)；Trizol裂解液(Takara，日本)；反转录试剂盒(Takara，日本)、PCR试剂盒(Takara，日本)，ELISA试剂盒(RD，美国)；BCA蛋白浓度测定试盒(Solarbio，中国)；Beclin1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ兔抗鼠单克隆抗体(Sigma，美国)等。
1.3.3 实验仪器 PCR反转录仪(Thermal Cycler，美国)；PCR仪(BIO-RAD，美国)；酶标仪(TEC-CAN，奥地利)；倒置相差显微镜(Olympus，美国)；Western Blot 荧光感应曝光机(Odyssey，美国)等。
1.4 方法
1.4.1 2型糖尿病模型造模高脂高糖饲料饲养糖尿病组和糖尿病伴牙周炎组大鼠，6周后按35 mg/kg腹腔注射1%的链脲佐菌素，3 d后以空腹血糖≥16.7 mmol/L，且稳定1周作为2型糖尿病大鼠成模标准[12-13]。
1.4.2 牙周炎模型造模糖尿病伴牙周炎组大鼠在糖尿病模型建立成功后建立牙周炎模型，牙周炎组也在此时造模，0.3%戊巴比妥钠(10 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠后探针分离牙龈，将3-0丝线双股结扎双侧上颌第一、二磨牙牙颈部，共7周[14]。第14周末麻醉处死大鼠取双侧上颌牙槽骨行苏木精-伊红染色及Micro-CT检测。

1.4.3 体质量监测分别于第0，6，14周测各组大鼠体质量。
1.4.4 空腹血糖检测分别于第0，6，7周(链脲佐菌素注射后1周)、第14周尾静脉采血，用血糖仪测空腹血糖，观察各组大鼠血糖水平变化。
1.4.5 胰腺与牙周组织病理学改变取上颌骨固定、脱钙，将胰尾和脱钙好的上颌骨分别制成石蜡包块，切片，脱水，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察胰腺和牙周组织病理变化。
1.4.6 Micro-CT扫描牙槽骨取上颌牙槽骨(与牙周组织病理学取材区域对应)进行Micro-CT扫描，第一、二磨牙近中及远中釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离，测量3次，平均值定为该标本的牙槽骨吸收值。
1.4.7 ELISA法检测血清中炎性因子的表达各组大鼠麻醉处死后取腹主动脉血，离心分离血清；严格按照ELISA试剂盒操作步骤，检测肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的表达水平。
1.4.8 实时荧光定量PCR检测胰腺组织中自噬及胰岛素分泌相关基因的表达称取胰腺胰尾组织50 mg，提取总RNA，测量其浓度及纯度，反转录试剂盒合成cDNA，葡萄糖激酶、葡萄糖转运蛋白2(recombinant glucose transporter 2，GLUT-2)、解偶联蛋白2、LC3Ⅱ、Beclin1和GAPDH基因序列见表1。PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，65 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共40个循环；95 ℃ 1 min。以 2-ΔΔCt法统计分析。

1.4.9 Western Blot 检测胰腺组织中自噬蛋白的表达取100 mg胰腺胰尾组织，用细胞裂解液进行总蛋白提取；用BCA法测定蛋白浓度；SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，免疫反应；最后进行化学发光反应检测各组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表达，目的条带灰度值读取并进行数据分析。
1.5 主要观察指标检测体质量、空腹血糖；Micro-CT扫描上颌牙槽骨；苏木精-伊红染色观察胰腺及牙槽骨病理学变化；ELISA法检测血清中炎性因子；实时荧光定量PCR检测胰腺组织中葡萄糖激酶、GLUT-2、解偶联蛋白2、LC3Ⅱ、Beclin1基因的表达水平；Western Blot法检测胰腺组织中Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表达水平。
1.6 统计学分析数据录入SPSS 23.0软件进行统计分析，结果描述以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，有差异再用SNK法进行两两比较，检验水准α=0.05。

讨论

自噬是机体对废用的蛋白和细胞器进行降解，并对一些糖类、蛋白质再利用的过程，在细胞稳态的维持中发挥重要作用[15]。自噬在生理状态下对维持细胞的生理功能至关重要，而过度的自噬可导致细胞自噬性死亡，致使机体生理功能障碍，最终加剧疾病的发生和发展[16]。炎症性疾病与自噬密切相关，研究表明炎性因子在调节自噬方面有着重要作用，炎症因子如白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等能诱导自噬的激活[17-18]。此次实验结果显示糖尿病组与牙周炎组血清白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α炎症因子表达水平均增加，但牙周炎组更高，推测炎症因子可能通过受损的牙周组织进入血液循环中，致使其含量升高。而糖尿病是一种慢性低度炎症反应，与传统典型炎症反应不同，没有典型的红、肿、热、痛炎症反应，却有相关炎症递质的升高，因此通常被称之为“低度炎症”或“代谢性炎症”[19]，这提示其全身循环系统中炎症因子的水平可能不及牙周炎。糖尿病伴牙周炎组的炎症因子表达量最高，因此推测，在2型糖尿病的基础上，牙周炎发生时从牙周组织进入全身血液循环中的炎症因子与机体内存在的低度炎症状态可能产生协同作用，致使血清中炎性因子的表达量升高。

2型糖尿病是胰岛素绝对或相对缺乏引起的代谢性疾病[20]。葡萄糖激酶是糖代谢和胰岛素分泌调节中的关键酶，该酶催化葡萄糖转变为6-磷酸葡萄糖[21]，主要存在于肝细胞和胰岛β细胞中，其在胰岛β细胞中可以识别葡萄糖分子，在转录后水平调节葡萄糖激酶的表达，但此种调节只在葡萄糖生理浓度时较敏感。如果血糖持续升高，此种调节不敏感，其活性减低可导致胰岛素分泌不足与葡萄糖代谢紊乱[22-23]。GLUT2是一类能转运葡萄糖的膜蛋白，是胰岛β细胞主要的葡萄糖转运体，生理条件下，葡萄糖可经GLUT2转运进入细胞内，该蛋白与葡萄糖激酶共同形成葡萄糖感受器，调节胰岛素的合成与分泌[24]。在实验性糖尿病动物模型中，观察到胰岛素分泌受损与胰岛β细胞GLUT2的表达降低显著有关，且糖尿病胰岛β细胞的特征之一便是GLUT2表达减少[25]。解偶联蛋白2是存在于线粒体内膜上的转运蛋白，该蛋白解偶联氧化磷酸化使细胞内ATP降低[26]。胰岛β细胞分泌胰岛素过程中需要ATP的参与，胰岛β细胞中绝大部分ATP的产生依赖线粒体氧化磷酸化过程。胰岛β细胞中解偶联蛋白2的高表达使细胞内ATP生产减少，从而导致胰岛素分泌降低，最终促进糖尿病的发生发展[27-28]。此次实验结果显示，葡萄糖激酶、GLUT-2的表达为对照组、牙周炎组、糖尿病组、糖尿病伴牙周炎组依次降低，解偶联蛋白2的表达与之相反，但牙周炎组与对照组差异无显著性意义，推测单纯牙周炎时，其尚不足以引起大鼠胰岛细胞分泌胰岛素功能异常；而当糖尿病伴牙周炎时，牙周炎可加重破坏糖尿病大鼠胰岛细胞分泌胰岛素的功能。胰腺组织病理学改变，与糖尿病组相比，糖尿病伴牙周炎组胰腺细胞胞质明显排列不紧密、胰岛明显变小、胰岛细胞数量变少等病变进一步加重。

为进一步探讨牙周炎加重糖尿病病情是否与增加胰岛细胞自噬反应有关，检测了Beclin1、LC3Ⅱ的表达。Beclin1基因作为酵母ATG6的同系物，常作为自噬反应的特异性基因[29-30]。另一种自噬标志物，即LC3，当体内发生自噬反应时，细胞浆型LC3(即LC3Ⅰ)会酶解掉一小段多肽，转变为膜型(即LC3Ⅱ)，机体内自噬水平的高低可通过检测LC3Ⅱ的表达水平来进行评估[31-32]。此次实验结果显示，对照组、牙周炎组、糖尿病组、糖尿病伴牙周炎组Beclin1、LC3Ⅱ的基因与蛋白的表达依次增加，且牙周炎组与对照组的表达差异无显著性意义，推测糖尿病伴牙周炎时，牙周炎可能通过刺激大鼠胰岛细胞自噬作用的增加从而加重糖尿病病情。

综上推测牙周炎可能通过刺激2型糖尿病胰岛细胞自噬的增加而过度降解细胞内的细胞器，从而进一步破坏胰岛细胞分泌胰岛素的功能，最终恶化2型糖尿病的病情。这将为进一步探索牙周炎影响糖尿病病情发展的可能机制和糖尿病及其并发症的防治提供新的思路和途径。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

2型糖尿病伴牙周炎模型大鼠胰腺自噬及胰岛素相关基因蛋白的表达

Pancreatic autophagy and protein expression of insulin-related genes in type 2 diabetic rats with periodontitis

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