聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法

doi:10.12307/2022.091

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (4): 553-559.doi: 10.12307/2022.091

• 材料生物相容性 material biocompatibility • 上一篇下一篇

聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法

何云影1，李玲婕2，3，4，张舒淇2，李雨舟2，3，4，杨生2，3，4，季平2，3，4

1重庆医科大学口腔医学院，重庆市 401147；2重庆医科大学附属口腔医院，重庆市 401147；3口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市 401147；4重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆市 401147

收稿日期:2021-02-06 修回日期:2021-02-08 接受日期:2021-04-10 出版日期:2022-02-08 发布日期:2021-11-03
通讯作者: 季平，博士，主任医师，博士生导师，重庆医科大学附属口腔医院，重庆市 401147；口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市 401147；重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆市 401147 杨生，博士，主任医师，博士生导师，重庆医科大学附属口腔医院，重庆市 401147；口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市 401147；重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆市 401147
作者简介:何云影，女，1992年生，重庆市人，汉族，重庆医科大学在读硕士，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82071115)，项目负责人：季平；国家自然科学基金(81500894)，项目负责人：杨生；国家自然科学基金(82001081)，项目负责人：李玲婕；重庆市研究生导师团队建设项目(dstd201806)，项目负责人：季平

Method of constructing cell spheroids based on agarose and polyacrylic molds

He Yunying1, Li Lingjie2, 3, 4, Zhang Shuqi2, Li Yuzhou2, 3, 4, Yang Sheng2, 3, 4, Ji Ping2, 3, 4

1College of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China; 2Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China; 3Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China; 4Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education, Chongqing 401147, China

Received:2021-02-06 Revised:2021-02-08 Accepted:2021-04-10 Online:2022-02-08 Published:2021-11-03
Contact: Ji Ping, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China; Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China; Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education, Chongqing 401147, China Yang Sheng, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China; Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China; Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education, Chongqing 401147, China
About author:He Yunying, Master candidate, College of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82071115 (to JP); the National Natural Science Foundation of China, No. 81500894 (to YS); the National Natural Science Foundation of China, No. 82001081(to LLJ); the Chongqing Postgraduate Tutor Team Construction Project, No. dstd201806 (to JP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
细胞球：是一种简单且被广泛应用的多细胞三维培养模型，细胞在隔绝与基底的黏附作用后，由于聚集倾向而相互靠拢形成细胞球。这种立体结构促进了细胞与周围细胞在空间上的交流，符合体内细胞的生长状态，一定程度上还原了细胞在体内的生存环境，生理学相关性强。
琼脂糖：是一种提取自藻类的多糖，可溶解在沸腾的溶液中，冷却后形成凝胶。琼脂糖凝胶无细胞毒性，且不携带细胞黏附位点，因此人和动物的细胞不能附着在该水凝胶之上。
背景：细胞球三维培养模型在组织工程领域应用前景广泛，但使用商品化超低吸附培养板进行细胞球培养的实验成本较高，因此需探寻一种细胞球成形的替代策略，推动细胞球在相关研究领域的应用。
目的：采用琼脂糖和聚丙烯酸模具，并利用层层自组装技术构建细胞球三维培养模型，部分模拟细胞体内生存的微环境。
方法：体外培养小鼠前体成骨细胞，依次使用明胶与海藻酸钠对小鼠前体成骨细胞进行层层自组装处理(层层自组装-小鼠前体成骨细胞)，同时分别制备明胶包裹与海藻酸钠包裹的小鼠前体成骨细胞。分别制备琼脂糖凝胶涂层培养板与琼脂糖凝胶微孔板，观察上述不同处理的细胞在两种培养板中的成球效果，采用Live/Dead染色法检测细胞球的活性，采用碱性磷酸酶染色法、RT-PCR 实验检测细胞球的成骨能力。
结果与结论：①光学显微镜下可见，在琼脂糖凝胶涂层孔板中，未经处理与经3种涂层处理的小鼠前体成骨细胞均未成球；在琼脂糖凝胶微孔板中，未经处理与层层自组装处理的小鼠前体成骨细胞形成了理想的细胞球，其中层层自组装-小鼠前体成骨细胞球的直径大于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P < 0.05)；②Live/Dead染色显示，层层自组装-小鼠前体成骨细胞球内的细胞活性高于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P < 0.05)；③层层自组装-小鼠前体成骨细胞球的碱性磷酸酶活性高于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P < 0.05)，Ⅰ型胶原和Osterix基因表达高于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P < 0.05)，两组Runx2基因表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)；④结果表明，采用琼脂糖凝胶结合层层自组装技术成功建立了细胞球三维培养模型，此方法便捷、经济、高效且细胞活性良好，保留了细胞成骨分化能力，在骨组织工程和再生医学领域具有潜在应用价值。

https://orcid.org/0000-0003-4820-7468 (何云影)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 细胞球, 三维培养, 琼脂糖, 小鼠前体成骨细胞, 层层自组装, 细胞活性, 骨组织工程

Abstract: BACKGROUND: The application prospect of cell spheroids is wide in tissue engineering, while the experimental cost of using commercial ultra-low adsorption culture plates to form spheroids is relatively high. Therefore, it is necessary to explore an alternative strategy for cell spheroids formation to promote the application of cell spheroids in related research fields.
OBJECTIVE: Combined with agarose and polyacrylic mold, three-dimensional cell spheroids are established by layer-by-layer self-assembly technology, and so that the micro physiological environment of cells are partially restored.
METHODS: In vitro, MC3T3-E1 cells of mice were coated with gelatin and sodium alginate respectively, through layer-by-layer self-assembly technology (LBL-MC3T3-E1). Gelatin-coated and sodium alginate-coated MC3T3-E1 cells were prepared as well. Agarose-coated plates and agarose microwell plates were prepared respectively. The cellular spheroids formation effect of the above treated cells in these culture plates was observed. The Live/Dead staining method was used to detect the viability of cell spheroids. The alkaline phosphatase staining and real-time PCR were used to confirm the osteogenesis of cell spheroids.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) As seen under the light microscope, in agarose-coated well plates, both untreated and treated MC3T3-E1 cells did not form into spheroids; and in agarose microwell plates, untreated and LBL-MC3T3-E1 cells formed ideal cell spheroids, in which the diameter of LBL-MC3T3-E1 cell spheroids was larger than that of untreated MC3T3-E1 cell spheroids (P < 0.05). (2) The results of Live/Dead staining showed that the cellular viability within LBL-MC3T3-E1 cell spheroids was better than that of MC3T3-E1 cell spheroids (P < 0.05). (3) The alkaline phosphatase activity of LBL-MC3T3-E1 cell spheroids was higher than that of MC3T3-E1 cell spheroids (P < 0.05). Collagen-I and Osterix gene expression levels were higher than those of MC3T3-E1 cell spheroids (P < 0.05), and the difference in Runt-related transcription factor 2 gene expression was not significant between the two groups (P > 0.05). (4) These results showed that a three-dimensional culture model of cell spheroids was successfully established by using agarose and polyacrylic acid molds combined with layer-by-layer self-assembly technology. This method is convenient, economical, efficient, and has good cell viability, preserves the osteogenic differentiation ability of cells, thus having potential applications in the field of bone tissue engineering and regenerative medicine.

Key words: cell spheroid, three-dimensional culture, agarose, MC3T3-E1, layer-by-layer, cell viability, bone tissue engineering

中图分类号:

何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.

He Yunying, Li Lingjie, Zhang Shuqi, Li Yuzhou, Yang Sheng, Ji Ping. Method of constructing cell spheroids based on agarose and polyacrylic molds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(4): 553-559.

图/表（结果） 4

2.1 层层自组装技术及琼脂糖凝胶微孔板的细胞成球效果为了验证倒金字塔结构和琼脂糖凝胶对细胞成球的有效性，将不同实验条件进行组合并进行验证，得到以下结果：未经处理的小鼠前体成骨细胞在普通孔板中贴壁生长；在琼脂糖凝胶涂层孔板中，细胞与基底的黏附被隔绝，散在悬浮于培养基中；而在琼脂糖凝胶微孔板中，未经处理的小鼠前体成骨细胞聚集成球，见图2a。经过海藻酸钠涂层处理的小鼠前体成骨细胞在普通孔板中贴壁生长，细胞形态同未经处理的小鼠前体成骨细胞相近；在琼脂糖凝胶涂层孔板中呈单个细胞悬浮状态；在琼脂糖凝胶微孔板中未能形成理想的细胞团块，见图2b。使用明胶涂层的小鼠前体成骨细胞，在普通孔板中细胞黏附性好，细胞铺展略受限；在琼脂糖凝胶涂层之上仍为散在悬浮状；而在琼脂糖凝胶微孔板中也未能实现细胞间的聚集，见图2c。层层自组装-小鼠前体成骨细胞在普通孔板保持贴壁状态，但早期呈未完全铺展的细胞形态；位于琼脂糖凝胶涂层孔板中时悬浮于培养基中，而在琼脂糖凝胶微孔板中细胞间彼此聚集形成了理想的细胞球，见图2d。

2.2 琼脂糖凝胶微孔板的成球效率琼脂糖凝胶微孔板能在一次实验中批量形成细胞球，见图3a。同时，通过改变细胞悬液浓度可精准调控微孔中形成的细胞球大小，见图3b。激光共聚焦显微镜下观察发现，层层自组装-小鼠前体成骨细胞球内部连接紧密，在收集及染色过程中不易破碎、分解，见图3c。在相同的细胞铺板密度下(0.5×108 L-1)，层层自组装-小鼠前体成骨细胞所形成的细胞球直径为(74.49±2.69) μm，小鼠前体成骨细胞球直径为(62.1±1.41) μm，二者之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3d。

2.3 层层自组装-小鼠前体成骨细胞球和小鼠前体成骨细胞球的活性比较 Live/Dead染色发现，层层自组装-小鼠前体成骨细胞球内细胞活性较未经处理的小鼠前体成骨细胞球更好，见图4a；层层自组装-小鼠前体成骨细胞球内的活细胞占比高于小鼠前体成骨细胞球(0.489±0.021，0.386±0.014，P < 0.05)，而球内的死细胞占比低于小鼠前体成骨细胞球(0.511±0.021，0.614±0.0136，P < 0.05)，见图4b。
小鼠前体成骨细胞与各浓度氯化钙溶液共培养后，各组在激发波长为450 nm处的吸光度值间均未表现出明显差异 (P > 0.05)，见图4c，表明细胞成球时使用的0.1 mol/L氯化钙溶液并不会影响细胞活性。
除此之外，实验中还检测了层层自组装技术对细胞增殖能力的影响，与小鼠前体成骨细胞组相比，第1天和第4天层层自组装-小鼠前体成骨细胞并没有表现出增殖受抑制的现象；第4天时其增殖能力甚至较小鼠前体成骨细胞有所改善，两组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4d。

碱性磷酸酶染色结果表明在没有添加成骨诱导液的条件下，层层自组装-小鼠前体成骨细胞球的成骨活性较小鼠前体成骨细胞球维持得更好，而且在染色过程中层层自组装-小鼠前体成骨细胞球形态保持良好，小鼠前体成骨细胞球则已部分破裂，见图5a；统计分析结果显示，层层自组装-小鼠前体成骨细胞球的成骨活性高于小鼠前体成骨细胞球(0.519±0.027，0.314±0.058，P < 0.05)，见图5b。
RT-PCR检测结果表明，层层自组装-小鼠前体成骨细胞球中的Ⅰ型胶原和Osterix基因表达高于小鼠前体成骨细胞球组(P < 0.05)，两组间Runx2基因表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5c。

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引言

细胞球三维培养方法可部分程度模拟体内细胞生存微环境，因而在骨组织工程及再生医学领域中被广泛应用[1-3]。目前用于构建细胞球的商品化超低吸附培养板的作用原理是：隔绝细胞与培养板基底之间的黏附作用，使细胞在重力作用下自发聚集成球，即细胞的聚集培养。然而，目前市场上的商品化超低吸附培养板多依赖进口，价格昂贵且为一次性使用耗材[4-6]，不符合中国及广大科技工作者倡导的低碳、可循环及可持续发展的战略要求。因此，探寻一种细胞球成形的新策略将有利于细胞球在相关研究领域的进一步推广。
聚丙烯酸模具的灵感来自于自行车反光灯，具备市场常见、价格低等优点，其内部为多个倒金字塔样微孔结构整齐排列，与商品化超低吸附培养板构造相近，然而，聚丙烯酸模具不适合直接用于细胞培养。因此课题组提出利用生物相容性材料复制聚丙烯酸模具倒金字塔样微孔的构想，还原其凹底造型，为细胞聚集成球提供空间，模拟细胞在商品化培养板中的行为。
为了完整地复制出聚丙烯酸模具内倒金字塔结构并应用于细胞培养，应选择一种既具备生物安全性又能用于模具复制的材料。琼脂糖是一类具备良好生物安全性的高分子材料，易获取且成本低。琼脂糖凝胶表面细胞黏附性较低[7]，同时凝胶制备对实验设备和实验环境要求较低，因此可被看作一种理想的超低吸附材料。在高温加热时琼脂糖呈溶液状态，而当温度降至37 ℃以下时会出现凝胶现象[8]，这赋予了琼脂糖极佳的可塑性，可用于复制聚丙烯酸模具内的倒金字塔微孔结构，进而替代商品化超低吸附培养板进行细胞培养，在隔绝细胞黏附的同时促进细胞聚集成球。细胞聚集培养过程还原了生理条件下细胞间的立体空间关系，即细胞在生物体内的宏观生存环境，从而在体外培养过程中维持细胞特性[9]。
然而，聚集培养虽然恢复了细胞的宏观三维环境，但忽略了在生理条件下细胞的独特微观环境[10-11]，细胞的微观环境由细胞-细胞、细胞-细胞外质间的相互作用组成，对细胞功能及其状态进行调整[12]，因此在进行细胞培养时应同时考虑宏观和微观环境对细胞的影响。层层自组装技术通过在细胞表面沉积具有生物相容性的材料进行细胞表面修饰[13]，重塑细胞外基质微环境[5]。层层自组装技术中常用的明胶为聚合阳离子生物材料，海藻酸钠为聚合阴离子材料[14]，互相反应能在细胞表面交替沉积形成外基质层，以实现恢复细胞微观环境的目的；而且以往研究已证明这两种材料的生物相容性较好，应用到不同类型的细胞上均有促进细胞功能的作用，因此在组织工程领域被广泛使用[15-16]。
综上所述，实验着力于寻求一种商品化超低吸附培养板的替代方案，对重塑细胞宏观和微观环境的方法进行探索与比较，为未来细胞球培养应用于骨组织工程领域提供思路和依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，采用单因素 ANOVA进行统计分析。
1.2 时间及地点实验于2019年12月至2020年11月在重庆医科大学附属口腔医院口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞小鼠前体成骨细胞(MC3T3-E1，中科院上海细胞库)。
1.3.2 主要实验试剂胎牛血清(GeneX公司)；0.25%胰酶-EDTA、α-MEM培养基、明胶、海藻酸钠、PKH26染色试剂盒(Sigma公司)；琼脂糖(索莱宝科技公司)；青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液、DPBS溶液(Hyclone公司)；无水氯化钙 (麦克林有限公司)；Live/Dead染色试剂盒(贝博试剂公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒、DAPI染色试剂(碧云天公司)；CCK-8试剂盒(MCE公司)；细胞裂解液Trizol、RNA反转录试剂盒、SYBR定量PCR试剂盒、无酶水(TaKaRa公司)。
1.3.3 主要仪器和耗材激光共聚焦显微镜、荧光倒置显微镜(徕卡公司)；酶标仪(Enspir公司)；实时荧光定量PCR仪(赛默飞公司)；细胞培养皿、细胞培养板、离心管(洁特生物公司)；针式过滤器(Millipore公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 孔板的制备精密称量琼脂糖，加入一定量的α-MEM培养基，制成1.5%的琼脂糖悬液，加热沸腾至琼脂糖充分融解，使用针式过滤器过滤。首先，制备琼脂糖凝胶涂层培养板，在每孔细胞培养板(6孔板)中添加1 mL琼脂糖溶液，待其完全凝固后作为对照组备用。随后制备琼脂糖凝胶微孔板，聚丙烯酸模具(自行车反射器经拆除后的反光片部分)紫外光照消毒，用2 mL琼脂糖溶液完全覆盖模具表面，待其冷却成凝胶后，用无菌刀片将凝胶修剪成6孔细胞培养板每孔大小，作为实验组使用。
1.4.2 层层自组装-小鼠前体成骨细胞的制备 1×106个小鼠前体成骨细胞收集于离心管中，离心去除旧培养基后加入 5 mL 0.1%明胶溶液(称取0.1 g明胶溶解于100 mL去离子水中)，置于4 ℃条件下孵育10 min。待孵育结束后以1 500 r/min离心5 min，去掉明胶溶液。加入5 mL DPBS溶液洗涤细胞，再次离心、去除上清液。然后加入5 mL 0.1%海藻酸钠溶液(称取0.1 g海藻酸钠溶解于100 mL去离子水中)重悬细胞，4 ℃环境下再次孵育10 min，重复离心、去上清、洗涤步骤。最后明胶和海藻酸钠的涂层过程各自依次重复一次，至此层层自组装-小鼠前体成骨细胞制备完成。使用相同的涂层手法制备仅为明胶包裹的明胶-小鼠前体成骨细胞和仅为海藻酸钠包裹的海藻酸钠-小鼠前体成骨细胞。
1.4.3 细胞球制备将3种涂层处理的小鼠前体成骨细胞或未经处理的小鼠前体成骨细胞重悬后，制备成细胞浓度为2×108 L-1的悬液，在对照组和实验组6孔板中每孔加入2 mL细胞悬液和 0.1 mol/L的氯化钙溶液10 µL，置于37 ℃细胞培养箱中培养24 h，光学显微镜下观察细胞成球效果。

1.4.4 制备流程采用层层自组装技术处理小鼠前体成骨细胞，以及利用聚丙烯酸模具制备琼脂糖凝胶微孔板及细胞球的流程如图1a所示。聚丙烯酸模具见图1b，其内部为整齐排列的倒金字塔结构。而以聚丙烯酸模具为模板制备的琼脂糖凝胶微孔板完整复刻出倒金字塔结构，见图1c，可进一步用于细胞球的培养。

1.4.5 细胞膜荧光标记消化细胞前，使用PKH26染色试剂盒对小鼠前体成骨细胞胞膜进行荧光标记，随后进行上述层层自组装处理，随后以0.5×108 L-1的细胞浓度制备成细胞球，成球后使用DAPI染色试剂标记细胞核，激光共聚焦显微镜下观察并采集图片。
1.4.6 细胞活性检测以0.5×108 L-1的细胞浓度制备出层层自组装-小鼠前体成骨细胞球和小鼠前体成骨细胞球后，用DPBS溶液将细胞球清洗2遍，根据Live/Dead染色试剂盒说明书配制成染色工作液，加入细胞球中，避光孵育20 min，荧光显微镜下观察并采集图片。对细胞球内细胞活力、死细胞占比进行统计分析，细胞活力=活细胞数/细胞总数，死细胞占比=死细胞数/细胞总数。
1.4.7 氯化钙溶液细胞毒性检测取处于对数生长期的小鼠前体成骨细胞用胰蛋白酶消化，配制成细胞浓度为0.5×108 L-1的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100 µL细胞悬液，然后置于37 ℃细胞培养箱中培养24 h。24 h后，去除每孔中的培养基，换入新鲜培养基，每孔再加入0.625 µL不同浓度的氯化钙溶液(浓度分别为0，0.05，0.1，0.2 mol/L)，每组设置5个复孔。氯化钙溶液处理4 d后，再次去除每孔旧培养基，加入含有10%CCK-8溶液的新鲜培养基，培养箱中继续孵育2 h。孵育结束后，使用酶标仪测定激发波长450 nm处光吸收值。
1.4.8 细胞增殖检测层层自组装-小鼠前体成骨细胞和小鼠前体成骨细胞重悬后，制备成细胞浓度为0.25×108 L-1的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100 µL细胞悬液，然后置于37 ℃细胞培养箱中分别培养24，96 h。去除每孔中的培养基，加入含有10%CCK-8溶液的新鲜培养基，培养箱中继续孵育2 h。孵育结束后，使用酶标仪测定激发波长 450 nm处光吸收值。
1.4.9 细胞成骨活性检测以0.5×108 L-1的细胞浓度制备出层层自组装-小鼠前体成骨细胞球和小鼠前体成骨细胞球，于完全培养基中继续培养4 d，将细胞球收集于离心管中，离心并去除培养基，用DPBS溶液清洗2遍。根据碱性磷酸酶染色试剂盒说明书配制染色工作液，加入离心管中，避光孵育15 min，光学显微镜下观察并采集图片。统计分析碱性磷酸酶染色结果，碱性磷酸酶染色百分比=染色阳性区域面积/细胞球总面积×100%。
细胞球在完全培养基中继续培养4 d后，将细胞球收集于离心管中，1 500 r/min离心5 min，去掉旧培养基。每只离心管中加入1 mL Trizol试剂，反复吹打，然后按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA。根据反转录试剂盒说明书和各组RNA浓度计算应用于反转录的各样本加样量，采用10 µL体系将RNA反转录为cDNA，然后进行real-time PCR实验。反应体系为10 µL，即cDNA 0.8 µL、上下游引物各0.4 µL、SYBR 5 µL、无酶水3.4 µL；按SYBR说明书设定相应反应程序：95 ℃反应3 min；之后95 ℃反应10 s，60 ℃反应1 min，该反应过程循环40次；然后65 ℃反应5 s；最后95 ℃处理5 s结束反应。每个样品设3个复孔。引物序列如下，GADPH 为内参。引物设计见表1。

1.5 主要观察指标显微镜下观察琼脂糖凝胶微孔板的成球效果及成球效率，染色比较球体内部细胞活性及细胞成骨活性。
1.6 统计学分析 Image J软件用于图片分析，所有数据表示为x±s，组间比较使用SPSS 19.0软件，进行单因素 ANOVA分析。P < 0.05被认为差异有显著性意义。Graph pad Prism 5软件用于绘制统计图表。

讨论

细胞之间互相黏附聚集成团块是发生在胚胎形成和器官形成中的一种自然现象[17]，细胞球三维培养模型还原了这一生理过程，使细胞特性得以更好地维持[3，18]，因此该模型在骨组织工程领域得到广泛认可[19]。
此次实验基于商品化超低吸附培养板的成球原理，对不同培养条件进行摸索和组合，见图6，结果表明只有琼脂糖凝胶微孔板能形成大小均匀、形态规则且致密的细胞团块，即细胞球。首先，聚丙烯酸模具内部结构与商品化超低吸附培养板相似，整齐排列的倒金字塔微孔结构为细胞聚集提供空间。琼脂糖凝胶具有良好的可塑性，其表面缺乏细胞黏附位点[7，20]，通过复刻聚丙烯酸模具内部结构制备出培养细胞成球的凝胶微孔板。细胞成球过程中分配到每个微孔中的细胞数量恒定，形成的细胞球大小均匀、形态规则，有利于实验的展开；一次实验中能批量形成细胞球，实现量产；通过改变细胞密度实现细胞球大小的精准调控，可以满足不同的实验需求。上述实验结果均验证了琼脂糖凝胶微孔板在提高实验效率方面的可行性。其次，在节约经济成本方面，聚丙烯酸模具和琼脂糖均价格低廉、易获取，且可以反复消毒和使用。此外，在节约时间成本方面，制备一块琼脂糖凝胶微孔板大约需要15 min，在较短的时间内可以并行制备多块，提高了细胞球的成球效率，进一步提升了琼脂糖凝胶微孔板的性价比。综上所述，此次实验中构建的琼脂糖凝胶微孔板可以作为商品化超低吸附培养板的良好替代品。

在琼脂糖凝胶微孔板的辅助下细胞聚集成球，恢复了生理条件下的空间结构，但这也只是在宏观层面上对细胞的生存环境进行了重塑，还原了宏观环境，而细胞所处的细胞外基质也可以在微观层面上影响其命运，调节其功能[21]。因此为了恢复细胞外微观环境，实验中采取了层层自组装技术，利用明胶和海藻酸钠进行细胞表面修饰[4]。明胶是一类生物安全性良好的胶原水解产物，与生理性细胞外基质相
似[22-23]，带正电荷的明胶虽然能沉积在带负电荷的细胞表面，为细胞重塑细胞外基质，但是细胞之间缺乏相互聚集黏附的条件，因此不适合单独应用于细胞球培养。而海藻酸钠是一种广泛应用到组织工程中的聚合阴离子生物材料[24-25]，能与钙离子交联形成凝胶，但电荷相斥导致海藻酸钠不能沉积在细胞表面，不能进行细胞外基质的重塑。二者联合应用时，明胶既能与细胞表面结合，也可以与海藻酸钠反应，在细胞表面形成明胶/海藻酸钠超薄基质层，并在氯化钙作用下细胞互相聚集黏附形成细胞球，实现宏观环境和微观环境的双重重塑。此外，明胶和海藻酸钠还具备细胞因子负载和释放的能力，可以进一步用于细胞改造，改善细胞状态及功能[26-28]。
在培养过程中明胶/海藻酸钠基质层一定程度上限制了细胞的伸展，使其更接近于那些生理条件下在无定形外基质中的细胞。而明胶/海藻酸钠基质层的加入使细胞间的连接更紧密，球体的力学强度得到改善，形成的细胞球在染色过程中不易分解，这一性能的改善也为后续实验的展开带来了更多的可操作性。通过层层自组装技术获得的细胞外基质层增大了单个细胞的表面积/体积比，在球内撑开了细胞间的间隙，为氧气、营养物质和代谢产物在球内的交换和运输提供了通道[5，26，29]，从而改善了细胞球内部的细胞死亡现象，更好地维持了细胞的成骨能力。
实验也存在一定的局限性：尽管证明了层层自组装技术和琼脂糖凝胶微孔板可应用于小鼠前体成骨细胞球三维培养，并改善了球体内部细胞的活性，但其在体外培养过程中的成骨能力还有待进一步验证，能否应用于体内骨组织再生还有待进一步研究。由于理想的骨组织再生涉及血管重建问题[30-31]，因此在未来使用基于层层自组装-小鼠前体成骨细胞和上皮细胞的三维共培养模型，可能有助于进一步探索骨组织再生策略。
综上所述，实验结合琼脂糖凝胶和聚丙烯酸模具成功建立了一种新的细胞球三维培养模型，即琼脂糖凝胶微孔板，该方法成本低廉、实验条件简单，是商品化超低吸附培养板的良好替代品。进一步使用层层自组装技术及明胶和海藻酸钠进行细胞外基质重塑，在此基础上成功构建细胞球，同时还原了细胞宏观及微观生理环境，并验证了明胶/海藻酸钠基质层改善细胞球内部氧气、营养物质及代谢产物转运困难的能力，为骨组织工程进一步研究提供依据和思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法

Method of constructing cell spheroids based on agarose and polyacrylic molds

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