1.1 设计 体外细胞学实验,采用单因素 ANOVA进行统计分析。
1.2 时间及地点 实验于2019年12月至2020年11月在重庆医科大学附属口腔医院口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞 小鼠前体成骨细胞(MC3T3-E1,中科院上海细胞库)。
1.3.2 主要实验试剂 胎牛血清(GeneX公司);0.25%胰酶-EDTA、α-MEM培养基、明胶、海藻酸钠、PKH26染色试剂盒(Sigma公司);琼脂糖(索莱宝科技公司);青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液、DPBS溶液(Hyclone公司);无水氯化钙 (麦克林有限公司);Live/Dead染色试剂盒(贝博试剂公司);碱性磷酸酶染色试剂盒、DAPI染色试剂(碧云天公司);CCK-8试剂盒(MCE公司);细胞裂解液Trizol、RNA反转录试剂盒、SYBR定量PCR试剂盒、无酶水(TaKaRa公司)。
1.3.3 主要仪器和耗材 激光共聚焦显微镜、荧光倒置显微镜(徕卡公司);酶标仪(Enspir公司);实时荧光定量PCR仪(赛默飞公司);细胞培养皿、细胞培养板、离心管(洁特生物公司);针式过滤器(Millipore公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 孔板的制备 精密称量琼脂糖,加入一定量的α-MEM培养基,制成1.5%的琼脂糖悬液,加热沸腾至琼脂糖充分融解,使用针式过滤器过滤。首先,制备琼脂糖凝胶涂层培养板,在每孔细胞培养板(6孔板)中添加1 mL琼脂糖溶液,待其完全凝固后作为对照组备用。随后制备琼脂糖凝胶微孔板,聚丙烯酸模具(自行车反射器经拆除后的反光片部分)紫外光照消毒,用2 mL琼脂糖溶液完全覆盖模具表面,待其冷却成凝胶后,用无菌刀片将凝胶修剪成6孔细胞培养板每孔大小,作为实验组使用。
1.4.2 层层自组装-小鼠前体成骨细胞的制备 1×106个小鼠前体成骨细胞收集于离心管中,离心去除旧培养基后加入 5 mL 0.1%明胶溶液(称取0.1 g明胶溶解于100 mL去离子水中),置于4 ℃条件下孵育10 min。待孵育结束后以1 500 r/min离心5 min,去掉明胶溶液。加入5 mL DPBS溶液洗涤细胞,再次离心、去除上清液。然后加入5 mL 0.1%海藻酸钠溶液(称取0.1 g海藻酸钠溶解于100 mL去离子水中)重悬细胞,4 ℃环境下再次孵育10 min,重复离心、去上清、洗涤步骤。最后明胶和海藻酸钠的涂层过程各自依次重复一次,至此层层自组装-小鼠前体成骨细胞制备完成。使用相同的涂层手法制备仅为明胶包裹的明胶-小鼠前体成骨细胞和仅为海藻酸钠包裹的海藻酸钠-小鼠前体成骨细胞。
1.4.3 细胞球制备 将3种涂层处理的小鼠前体成骨细胞或未经处理的小鼠前体成骨细胞重悬后,制备成细胞浓度为2×108 L-1的悬液,在对照组和实验组6孔板中每孔加入2 mL细胞悬液和 0.1 mol/L的氯化钙溶液10 µL,置于37 ℃细胞培养箱中培养24 h,光学显微镜下观察细胞成球效果。
1.4.4 制备流程 采用层层自组装技术处理小鼠前体成骨细胞,以及利用聚丙烯酸模具制备琼脂糖凝胶微孔板及细胞球的流程如图1a所示。聚丙烯酸模具见图1b,其内部为整齐排列的倒金字塔结构。而以聚丙烯酸模具为模板制备的琼脂糖凝胶微孔板完整复刻出倒金字塔结构,见图1c,可进一步用于细胞球的培养。
1.4.5 细胞膜荧光标记 消化细胞前,使用PKH26染色试剂盒对小鼠前体成骨细胞胞膜进行荧光标记,随后进行上述层层自组装处理,随后以0.5×108 L-1的细胞浓度制备成细胞球,成球后使用DAPI染色试剂标记细胞核,激光共聚焦显微镜下观察并采集图片。
1.4.6 细胞活性检测 以0.5×108 L-1的细胞浓度制备出层层自组装-小鼠前体成骨细胞球和小鼠前体成骨细胞球后,用DPBS溶液将细胞球清洗2遍,根据Live/Dead染色试剂盒说明书配制成染色工作液,加入细胞球中,避光孵育20 min,荧光显微镜下观察并采集图片。对细胞球内细胞活力、死细胞占比进行统计分析,细胞活力=活细胞数/细胞总数,死细胞占比=死细胞数/细胞总数。
1.4.7 氯化钙溶液细胞毒性检测 取处于对数生长期的小鼠前体成骨细胞用胰蛋白酶消化,配制成细胞浓度为0.5×108 L-1的细胞悬液,96孔细胞培养板中每孔加入100 µL细胞悬液,然后置于37 ℃细胞培养箱中培养24 h。24 h后,去除每孔中的培养基,换入新鲜培养基,每孔再加入0.625 µL不同浓度的氯化钙溶液(浓度分别为0,0.05,0.1,0.2 mol/L),每组设置5个复孔。氯化钙溶液处理4 d后,再次去除每孔旧培养基,加入含有10%CCK-8溶液的新鲜培养基,培养箱中继续孵育2 h。孵育结束后,使用酶标仪测定激发波长450 nm处光吸收值。
1.4.8 细胞增殖检测 层层自组装-小鼠前体成骨细胞和小鼠前体成骨细胞重悬后,制备成细胞浓度为0.25×108 L-1的细胞悬液,96孔细胞培养板中每孔加入100 µL细胞悬液,然后置于37 ℃细胞培养箱中分别培养24,96 h。去除每孔中的培养基,加入含有10%CCK-8溶液的新鲜培养基,培养箱中继续孵育2 h。孵育结束后,使用酶标仪测定激发波长 450 nm处光吸收值。
1.4.9 细胞成骨活性检测 以0.5×108 L-1的细胞浓度制备出层层自组装-小鼠前体成骨细胞球和小鼠前体成骨细胞球,于完全培养基中继续培养4 d,将细胞球收集于离心管中,离心并去除培养基,用DPBS溶液清洗2遍。根据碱性磷酸酶染色试剂盒说明书配制染色工作液,加入离心管中,避光孵育15 min,光学显微镜下观察并采集图片。统计分析碱性磷酸酶染色结果,碱性磷酸酶染色百分比=染色阳性区域面积/细胞球总面积×100%。
细胞球在完全培养基中继续培养4 d后,将细胞球收集于离心管中,1 500 r/min离心5 min,去掉旧培养基。每只离心管中加入1 mL Trizol试剂,反复吹打,然后按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA。根据反转录试剂盒说明书和各组RNA浓度计算应用于反转录的各样本加样量,采用10 µL体系将RNA反转录为cDNA,然后进行real-time PCR实验。反应体系为10 µL,即cDNA 0.8 µL、上下游引物各0.4 µL、SYBR 5 µL、无酶水3.4 µL;按SYBR说明书设定相应反应程序:95 ℃反应3 min;之后95 ℃反应10 s,60 ℃反应1 min,该反应过程循环40次;然后65 ℃反应5 s;最后95 ℃处理5 s结束反应。每个样品设3个复孔。引物序列如下,GADPH 为内参。引物设计见表1。
1.5 主要观察指标 显微镜下观察琼脂糖凝胶微孔板的成球效果及成球效率,染色比较球体内部细胞活性及细胞成骨活性。
1.6 统计学分析 Image J软件用于图片分析,所有数据表示为x±s,组间比较使用SPSS 19.0软件,进行单因素 ANOVA分析。P < 0.05被认为差异有显著性意义。Graph pad Prism 5软件用于绘制统计图表。