2.1   细胞膜片的制备方法   目前，构建细胞膜片的方法多种多样，包括：温度反应系统、机械系统、磁反应系统、光反应系统、pH系统等[11-21]，见图3。各种制备方法有其各自的优劣势，下面详细介绍每一种制备方法。



2.1.1   温度反应系统   温度反应系统是最先提出并用于制备细胞膜片的方法，也是目前应用最广泛的制备方法。温度敏感型聚异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)通常以共价结合的方式结合到细胞培养皿的底部，该温敏型材料在不同的温度条件下表现出不同的性能。当环境温度为37 ℃时，温度敏感型聚异丙基丙烯酰胺具有疏水特性，可促进细胞黏附和增殖，从而有助于促进细胞膜片的形成；当温度低于32 ℃时，温度敏感型聚异丙基丙烯酰胺表现出亲水性，通过在培养皿表面和细胞膜片之间形成水合层，从而将培养的细胞膜片与培养皿完全分离[17]。
2.1.2   机械系统   机械系统是制备细胞膜片最简单的一种方法，只需向培养基中加入一定量的抗坏血酸即可，而不需要特定的培养基质或技术，但是其制备细胞膜片所需的时间较长，通常在2周左右可以观察到细胞膜片的形成。该方法的原理主要是通过抗坏血酸刺激细胞分泌大量的细胞外基质，通过连续培养从而形成膜片，当大量的细胞外基质沉积时，可观察到细胞膜片的形成。当细胞膜片形成后，通过细胞刮和镊子轻轻的将膜片从培养板里剥离并分离[18，22]。在骨组织工程中，细胞膜片还可通过将制备的细胞膜片成骨诱导从而制备成骨细胞膜片。最近，KIM等[23]提出了一种将明胶添加到成骨培养基中制备成骨细胞膜片的新型机械系统。与传统的成骨细胞膜片相比，明胶诱导的成骨细胞膜片具有极强的细胞增殖能力和丰富的细胞外基质，可形成较厚、机械性能较强的细胞膜片。
2.1.3   磁反应系统   磁反应系统在制备多层细胞膜片方面具有较大的优势。首先通过细胞内吞作用，将带有磁性的粒子内吞到细胞内，然后在外加磁场的作用下细胞可以快速地黏附在培养板上并形成细胞膜片。当单层细胞膜片形成后，可以继续向磁反应系统添加细胞，从而构建多层细胞膜片。此外，磁反应系统不仅能够制备单一的细胞膜片，同时还能制备不同类型细胞的复合细胞膜片[19]。
2.1.4   光反应系统   光反应系统通过将细胞培养在二氧化钛(TiO2)纳米涂层的培养板上，然后通过紫外光介导培养板亲水性和疏水性的变化，从而形成细胞膜片。用365 nm的紫外光照射20 min后，90%以上的细胞能从培养板上分离。在此基础上，研究者还通过在培养板上添加其他成分促进细胞的黏附从而来促进细胞膜片的形成，形成的细胞膜片在紫外光的照射下能够从培养板上分离[20，24]。
2.1.5   pH系统   GUILLAUME-GENTIL等[21]采用聚4-苯乙烯磺酸盐和聚烯丙胺盐酸盐两种聚合物制备电解质多层膜涂层，通过调节局部和整体的pH值来获取细胞膜片。当培养液缓冲基pH值达5.0以上时，细胞附着于表面；当pH值降低至4.0时，培养的间充质干细胞膜片则在两三分钟内完整脱离。由于该技术需要严格控制环境的pH值，否者会造成细胞的损伤，因此该技术的应用受到了一定的限制。同时，对于pH敏感的细胞，同样不适合用该方法来制备细胞膜片。
2.2  细胞膜片的类型  根据细胞来源的不同，细胞膜片可分为骨髓间充质干细胞膜片、脂肪间充质干细胞膜片、软骨细胞膜片等；根据细胞膜片层数和厚度的不同，细胞膜片可分为单层细胞膜片、双层细胞膜片和多层细胞膜片，其中，双层和多层细胞膜片根据细胞来源是否相同又可分为单一细胞膜片和混合细胞膜片。间充质干细胞是目前广泛应用的种子细胞之一，其具有广泛的来源和多系分化的能力，同时还具有潜在的抗炎、抗免疫的作用。通过对比骨髓、脂肪和脐带来源的间充质干细胞膜片，NAKAO等[25]发现不同来源的间充质干细胞膜片其转化生长因子β、白细胞介素10、前列素E2等细胞因子的表达不同，因此，在不同的疾病中，可选取不同细胞来源的细胞膜片来治疗相应的疾病。YOU等[18]采用单层人羊膜间充质干细胞膜片修复兔关节软骨缺损，取得了不错的效果。但是，单纯细胞膜片的机械强度较弱，在培养的过程中容易出现收缩，因此操作具有一定的难度。通过构建多层细胞膜片，可以促进细胞分泌更多的细胞外基质，加强细胞间的相互联系，从而提高膜片的机械强度。但是，多层细胞膜片由于其厚度的增加会导致营养物质渗透不足，容易导致细胞死亡的风险。SILVA等[19]通过磁反应系统制备了多层细胞膜片，该膜片分3层，最下面一层是脂肪间充质干细胞膜片层，中间层是人脐静脉内皮细胞膜片层，最上面一层为脂肪间充质干细胞层，体内外实验均证实该多层细胞膜片具有成骨能力，同时还具有成血管的特点，因此，在修复骨缺损方面具有不错的应用价值。
2.3  细胞膜片在骨组织工程中的应用  



随着细胞膜片技术的快速发展，目前该技术已经广泛应用于各大领域，包括：骨损伤修复、软骨再生、角膜修复、腱-骨愈合[7-10，26-30]。该文重点介绍细胞膜片技术在骨组织工程的应用。
2.3.1   单层细胞膜片在骨组织工程中的应用   细胞膜片由于具有大量的细胞外基质，保留了完整的细胞间连接，目前在骨组织工程领域取得了不错的成果，见表1。



在骨组织工程领域的研究，首先是通过皮下移植观察其异位成骨的潜能。AKAHANE等[31]通过机械法成功制备了骨髓间充质干细胞膜片，成骨诱导后皮下移植到大鼠体内，在不使用其他支架的条件该膜片能明显促进新骨形成。此外，MA等[32]同样通过机械法制备了兔骨髓间充质干细胞膜片，将该膜片移植到裸鼠皮下可观察到新骨的形成。随后，研究者将研究的方向转向骨缺损的修复，通过建立骨缺损模型更好地模拟临床上的骨损伤，从而观察单层细胞膜片对骨缺损的修复效果。在骨缺损的研究中，常用的动物模型是颅骨缺损模型，其制备方法简单，在研究骨损伤修的复中具有重要的意义。KAZUNORI等[33]通过磁反应系统制备了细胞膜片，然后将其移植到大鼠颅骨缺损部位，可观察到缺损的部位几乎完全修复。UEYAMA等[34]用机械法制备了成骨细胞膜片，移植到兔下颌骨骨缺损部位，结果显示该膜片填充于缺损的部位能够明显促进缺损部位的骨再生。骨折的愈合是一个动态的过程，虽然骨折后大部分患者能够达到完全愈合，但是仍有一部分患者会发生骨折的延期愈合甚至不愈合，这可能与很多复杂的因素有关。因此，骨折后除了积极有效的复位和固定，还需要进行一定的干预加速骨折的愈合，避免骨折不愈合的发生。目前，大量的研究通过机械系统构建骨髓间充质干细胞膜片用于治疗骨折的治疗。NAKAMURA等[35]将成骨细胞膜片移植到骨折大鼠股骨中，可增强骨折部位的骨形成，并形成稳定的新生骨。SHIMIZU等[36]在大鼠股骨骨折愈合模型中注射成骨细胞膜片，可促进骨再生，最终导致骨愈合。MA等[37]包裹成骨分化的兔骨髓间充质干细胞膜片在下颌骨2 mm的骨折间隙处，可观察到骨折延迟愈合的改善并可见新生骨的形成。
2.3.2   多层细胞膜片在骨组织工程中的应用   骨膜是覆盖在骨外表面的一层薄膜，在骨的发育和再生中起着重要作用。骨膜主要由外层纤维层和内层成骨层组成，外层纤维层含有成纤维细胞、胶原纤维和血管，滋养内骨；内层成骨层含有间充质干细胞和骨祖细胞，负责骨的发育和再生[38]。因此，多层细胞膜片能够很好地模拟骨膜的结构和功能(外层膜片成血管、内层膜片成骨)，通过构建多层细胞膜片来模拟骨膜的结构和功能为骨缺损的修复提供了新的思路，见表2。



ZHANG等[39]通过构建双层细胞膜片制备了血管化的组织工程骨，首先提取兔脂肪间充质干细胞，然后将其分别诱导成骨和成血管，体内用于兔大段桡骨缺损的修复，实验结果显示，该复合细胞膜片能够促进大段骨缺损的修复。在另外一项研究中，ZHANG等[40]利用机械法成功构建了成骨和成血管膜片，然后将两者复合在一起制备复合细胞膜片，该复合细胞膜片体外具有明显的成骨和成血管潜能；然后将该复合膜片与包裹在羟基磷灰石表面，体内实验探究其成骨和成血管能力，结果同样证实了该复合细胞膜片具有成骨和成血管的潜力，因此其在骨再生方面具有很大的应用前景。ZHANG等[41]也通过机械法制备了多层细胞膜片从而来构建仿生骨膜，用于骨缺损的修复：首先制备大鼠骨髓间充质干细胞膜片，然后将其诱导为成骨细胞膜片，接着将骨髓干细胞诱导分化成内皮样细胞并将其接种到骨髓间充质干细胞膜片上，从而构建成血管细胞膜片；将成骨细胞膜片和成血管细胞膜片复合制备复合细胞膜片，模拟骨膜的结构；体内外实验均证实该仿生骨膜结构(复合细胞膜片)具有成血管和成骨能力，能够明显促进骨再生。KANG等[22]通过机械法制备了仿生骨膜结构的双层结构的细胞膜片，用于体内成骨的研究，外层构建了人来源的间充质干细胞膜片，并将人脐静脉内皮细胞种植到膜片上从而得到了具有血管化的细胞膜片；内层构建成骨细胞膜片并将其包裹在多孔磷酸三钙支架上，并将其移植到小鼠体内观察其成骨和成血管能力；体外结果显示血管化细胞膜片具有成血管的能力，体内实验证实该复合支架具有显著的成血管和成骨能力，是一种新的骨缺损修复的方法。
2.3.3   细胞膜片结合其他材料在骨组织工程中的应用   虽然细胞膜片具有丰富的细胞外基质，并且保留了完整的细胞间的连接，但是，由于其力学性能较差，单用细胞膜片无法起到骨支撑的作用，因此，许多研究者通过将制备的细胞膜片与骨组织工程支架相结合来修复骨缺损，充分发挥了骨组织工程支架和细胞膜片各自的优势，见表3。



ZHOU等[42]首先将细胞膜片与聚已酸内酯和磷酸三钙复合材料复合用于骨缺损的修复，结果发现既有血管化的松质骨形成同时又有皮质骨的形成，并且新生的骨组织的抗压强度显著高于未与膜片复合的对照组。UEHA等[43]同样利用机械法制备了成骨细胞膜片，然后将该成骨膜片与磷酸三钙支架复合，体内外结果均证实该复合支架具有较强的成骨能力。AKAHANE等[44]比较了不同年龄阶段来源的骨髓间充质干细胞膜片在成骨方面的差异，通过提取7周龄和1岁龄的大鼠骨髓间充质干细胞并构建成骨细胞膜片，然后将膜片与磷酸三钙支架复合，结果显示：不管是7周龄和1岁龄来源的骨髓间充质干细胞膜片均能促进骨缺损的骨再生。除了磷酸三钙支架外，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)也常用于细胞膜片的复合材料。SHAN等[45]通过将骨髓间充质干细胞膜片成骨诱导后与聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合构建复合支架材料，将其填充于犬下颌骨缺损处，结果显示具有良好的成骨能力，能够很好地促进缺损部位的骨再生。静电纺丝技术制备的纳米纤维膜对细胞的生长和增殖具有明显的促进作用，因此，也有研究以静电纺丝纳米纤维膜作为基质，将种子细胞种植在其表面，从而构建支架-细胞膜片的复合支架材料。静电纺纳米纤维膜除了具有可操作性外，还可以作为构建细胞膜片的支撑材料，通过纳米纤维特性调节细胞行为。REN等[46]将聚左旋乳酸(PLLA)和明胶(gelatin)以1∶1的比例混合，通过静电纺丝技术分别制备了无序结构和网状结构的静电纺丝纤维膜，然后将大鼠的骨髓间充质干细胞分别接种到培养板和不同结构的纳米纤维膜上并诱导成膜片。体外实验结果表明网状结构的纳米纤维膜能够明显促进大鼠的骨髓间充质干细胞成骨分化，而两种结构的纳米纤维膜对细胞的增殖无明显差异；随后将骨髓间充质干细胞膜片与纳米纤维膜复合用于大鼠颅骨缺损的修复，体内实验结果提示纳米纤维膜复合细胞膜片在促进骨缺损修复方面明显强于对照组，而不同结构的纳米纤维膜复合细胞膜片两者之间的差异不大。
2.3.4   细胞膜片复合生长因子或小分子物质在骨组织工程中的应用   生长因子在组织再生中起着关键作用，其在骨损伤修复的过程中同样发挥着重要的作用。因此，近年来越来越多的研究者向细胞膜片中加入适当的生长因子或小分子物质用于促进骨再生从而来修复骨缺损，见表4。



富血小板血浆(PRP)是自体血经过离心后而获得的血小板浓缩物，其富含有大量的生长因子，包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β1，TGF-β2)、胰岛素样生长因子(IGF-1，IGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)等[47]。QI等[48]通过机械法制备了兔骨髓间充质干细胞膜片，并将该膜片包裹富血小板血浆凝胶/CaP微粒，富血小板血浆能够持续释放细胞因子，有利于骨缺损的修复。体外研究表明包裹富血小板血浆/CaP的细胞膜片其成骨相关基因表达明显提高，体内实验也证实经富血小板血浆/CaP处理的细胞膜片较其他组能够明显的促进骨缺损的修复。DANG等[49]将人骨髓间充质干细胞膜片与纳米微粒相结合，该纳米微粒早期能够释放转化生长因子β1，促进软骨形成，晚期持续释放骨形态发生蛋白2，促进骨的形成和释放，体内影像学和组织学检测均提示该系统能够促进兔颅骨缺损的修复，持续的细胞因子释放对加速骨愈合起着重要的作用。ZHANG等[50]发现nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒由于富含大量的羧基，因此能够很好地结合生长因子，并且能够被牙髓干细胞内吞而对细胞的增殖没有影响，因此，他们通过细胞内吞的作用将结合骨形态发生蛋白2的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒导入到牙髓干细胞内细胞内，然后在磁反应系统的作用下成功制备牙髓干细胞膜片，该膜片能够持续释放骨形态发生蛋白2，在成骨方面具有不错的应用前景，为以后构建骨组织工程细胞膜片提供了新的思路。QI等[51]将小分子物质辛伐他汀(simvastatin)加入到间充质干细胞膜片中，结果证实细胞膜片复合小分子物质simvastatin能够明显促进兔骨折愈合，其效果较单用细胞膜片更好。

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[12]	袁加斌, 朱宗东, 唐孝明, 魏 丹, 谭 波, 肖成伟, 赵淦琳炜, 廖 锋. 难复性股骨转子间骨折的解剖分型与复位策略[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1341-1345.
[13]	张吉超, 董跃福, 牟志芳, 张 震, 李冰言, 徐祥钧, 李佳意, 任 梦, 董万鹏. 骨关节炎患者在不同步态角度下膝关节内部生物力学变化的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1357-1361.
[14]	刘 峰, 冯 毅. 步态周期下不同克氏针张力带治疗髌骨横行骨折的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1367-1371.
[15]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.

骨缺损一直是骨科临床工作的一项难题，每年有数百万的病例寻求临床治疗。如果骨缺损部位不能得到很好的修复，不仅对患者的美观造成一定的影响，同时严重者影响患者的功能。临床上治疗骨缺损首选的方法是自体骨移植，但是自体骨来源有限，并且会对供区造成新的缺损；而异体骨存在免疫原性及潜在传染病原体等缺点；金属类、合成塑料类、陶瓷类等人工材料则缺乏骨诱导性[1-3]。
由于传统治疗方法存在不足，当前利用组织工程学技术修复骨缺损、骨不连等疾病，在临床上具有愈来愈广阔的应用前景，在过去的20年时间里，骨组织工程的快速发展为临床上骨缺损的治疗提供了很大的帮助。传统的骨组织工程技术主要包括注射细胞悬液和支架-种子细胞的移植。但是，当注射细胞悬液时很难控制注射后细胞悬液的形状和大小，并且注射后的细胞悬液也很难定位，一次注射可输送的细胞数量非常有限，而且注射后细胞很容易丢失，因此单纯的依靠细胞注射的方法很难满足当前骨组织工程的要求。此外，虽然目前应用于骨缺损修复的支架材料很多，并且也取得了一定的效果，但是现有的支架材料都存在一定的缺陷，包括：生物活性不足、降解率不稳定、移植后产生免疫反应和炎症等[4-5]。用于骨再生的理想支架材料要具备以下特性：①有足够的孔隙率，能够有效地促进细胞黏附、增殖和细胞外基质(ECM)的分泌；②稳定可控的降解率；③具有合适的力学性能[6]。
细胞膜片技术是一种新型的获取种子细胞的方法，与传统的酶消化法相比，细胞膜片技术具有以下优点：在获取种子细胞的同时还完整保存细胞外基质、细胞间连接以及细胞表面相关蛋白，因此，细胞膜片在骨缺损修复方面具有良好的应用前景，其不仅可以单独应用于骨组织工程促进缺损部位的骨再生，还可与骨组织工程中的支架材料结合，共同发挥相应的作用从而促进骨再生。目前，细胞膜片技术已经广泛应用于骨组织工程，在促进骨缺损的修复方面取得了不错的结果[7-10]。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

1.1   资料来源   
1.1.1   检索人及检索时间   第一作者在2021年7月进行检索。
1.1.2   检索文献时限   检索时间起点为2000年1月，止点为2021年7月。
1.1.3   检索数据库   CNKI数据库、PubMed数据库及Elsevier数据库。
1.1.4   检索词   中文检索词为“细胞膜片技术，细胞膜片，骨，骨缺损，骨修复，组织工程，骨组织工程”；英文检索词为“Cell sheet technology，Cell sheet，Bone，Bone defect，Bone repair，Tissue engineering，Bone tissue engineering”。
1.1.5   检索文献类型   研究原著、综述、病例报告、荟萃分析等。
1.1.6   文献检索策略   见图1。

1.1.7   检索文献量   计算机检索初检得到213篇文献。
1.2   入选标准
纳入标准：①有关细胞膜片技术在骨组织工程中应用的实验性或基础研究；②同一领域中论点、论据可靠的文献。
排除标准：①重复性研究且与研究目的无相关性的文章；②资料无法提取的部分文献。
1.3   数据的提取   研究内容由3人独立提取并通过讨论解决分歧。信息记录侧重于细胞膜片技术在骨组织工程中的应用的实验性或基础研究。
1.4   文献证据综合提炼   计算机检索初检得到213篇文献，通过阅读文题和摘要进行初步筛选，排除与文章主题不相关的文献，根据纳入标准和排除标准，最后纳入51篇文献(中文2篇，英文49篇)进行综述。检索流程图，见图2。

目前，细胞膜片技术在除骨组织工程外的其他各大组织工程中的应用也越来越广泛，并取得了一定进展。细胞膜片技术虽然有很多优点，但其也面临着一些问题有待解决，例如：使用细胞膜片技术构建具有复杂结构和形态的组织或器官目前还比较困难；细胞膜片的机械强度不够，在一定程度上增加了其操作难度并限制了其临床应用；多层细胞膜片由于大量细胞堆积缺乏营养物质从而导致细胞容易坏死等。因此，在以后的研究中还需要将新的技术应用到细胞膜片技术上来，以克服目前膜片技术所面临的问题。同时，还应深入研究细胞膜片技术修复骨缺损的分子机制，充分发挥膜片技术所具有的优势，以便更好地符合临床需求并广泛应用于临床。因此，在骨组织工程中，为了充分利用各种膜片及生物材料的优势，将不同细胞膜片复合以及将细胞膜片与新型的骨组织工程支架材料相结合可能是未来骨组织工程研究的一个新方向。 
该文详细阐述了细胞膜片技术在骨组织工程研究中的应用，与其他关于细胞膜片技术在骨科相关领域应用的综述相比，该文不仅介绍了细胞膜片的制备方法、细胞膜片的类型，还重点介绍了单层细胞膜片、多层细胞膜片、细胞膜片复合其他支架材料以及细胞膜片复合生长因子和小分子物质在骨组织工程中的应用。该文章的重要意义在于将前期细胞膜片技术在骨组织工程中的研究进行详细的概括，并提出了目前细胞膜片技术应用存在的一些问题，对研究者后续相关的研究和临床转换具有一定的指导意义。该综述的不足之处：在阐述细胞膜片复合其他支架材料部分不够详细。因此，未来还需要更进一步的阐述并概括细胞膜片技术和不同支架材料在骨组织工程中的应用，旨在发现并推广有效的用于骨组织工程的复合支架材料。 
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

文题释义：
细胞膜片技术：是一种新型的获取种子细胞的技术，在不破坏细胞外基质和细胞间连接的前提下可以获取想要的种子细胞，在组织再生和修复方面具有广阔的应用前景。
骨组织工程：是通过将种子细胞接种到支架材料上，在特定的细胞因子的作用下促进细胞的生长和分化，然后将支架-细胞-细胞因子复合物移植到体内修复骨缺损。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

根据细胞来源的不同，细胞膜片可分为骨髓间充质干细胞膜片、脂肪间充质干细胞膜片、软骨细胞膜片等；根据细胞膜片层数和厚度的不同，细胞膜片可分为单层细胞膜片、双层细胞膜片和多层细胞膜片，其中，双层和多层细胞膜片根据细胞来源是否相同又可分为单一细胞膜片和混合细胞膜片。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

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