血小板衍生生长因子BB促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2188

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (13): 1976-1981.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2188

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

血小板衍生生长因子BB促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖

姜涛1，吴硕2，李志强1，寿玺1，马依热·努尔买卖提1，马创2，魏琴1

1新疆医科大学动物实验中心，新疆医学动物模型研究重点实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；2新疆医科大学第一附属医院骨科中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2020-03-12 修回日期:2020-03-18 接受日期:2020-05-16 出版日期:2021-05-08 发布日期:2020-12-28
通讯作者: 魏琴，硕士，实验师，新疆医科大学动物实验中心，新疆医学动物模型研究重点实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:姜涛，男，1980年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，2012年新疆农业大学毕业，硕士，高级实验师，主要从事动物实验研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金 (2016D01C287)，项目负责人：魏琴

Platelet-derived growth factor BB promotes the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells of Sprague-Dawley rats

Jiang Tao1, Wu Shuo2, Li Zhiqiang1, Shou Xi1, Mayire·Nuermaimaiti1, Ma Chuang2, Wei Qin1

1Laboratory Animal Center of Xinjiang Medical University, Xinjiang Key Laboratory of Medical Animal Model Research, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Orthopedics Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2020-03-12 Revised:2020-03-18 Accepted:2020-05-16 Online:2021-05-08 Published:2020-12-28
Contact: Wei Qin, Master, Experimentalist, Laboratory Animal Center of Xinjiang Medical University, Xinjiang Key Laboratory of Medical Animal Model Research, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Jiang Tao, Master, Senior experimentalist, Laboratory Animal Center of Xinjiang Medical University, Xinjiang Key Laboratory of Medical Animal Model Research, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2016D01C287 (to WQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨髓间充质干细胞：是目前组织工程骨研究领域内最成熟也是运用最多的种子细胞，已经证实具有多向分化潜能，可以向成骨细胞、破骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞、成血管细胞等分化，并具有自身免疫原性弱、操作方便等特点。
血小板衍生生长因子BB：血小板衍生生长因子最初从血小板中分离出来，是间充质干细胞迁移和增殖的关键生长因子。血小板衍生生长因子BB是血小板衍生生长因子家族中的一员，主要由血小板、内皮细胞、巨噬细胞产生，有研究报道通过小鼠实验由前破骨细胞分泌的血小板衍生生长因子BB可以促进成骨细胞和血管内皮细胞的形成。

背景：研究报道小鼠前破骨细胞分泌的血小板衍生生长因子BB可以促进成骨细胞和成血管细胞形成，而应用血小板衍生生长因子BB干预骨髓间充质干细胞的最佳浓度及最佳时间尚不明确。
目的：探讨血小板衍生生长因子BB对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖作用的最佳干预质量浓度及最佳干预时间。
方法：体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，第3代细胞经流式鉴定其表面标记物CD45、CD29和CD34，选用纯度较高的骨髓间充质干细胞进行干预实验。将筛选好的细胞接种于96孔培养板中，对照组骨髓间充质干细胞用α-MEM完全培养基培养，其余各组在此基础上加入6.25，12.5，25，50，100 μg/L血小板衍生生长因子BB。干预1，3，5，7 d采用CCK-8法检测细胞增殖情况，筛选出血小板衍生生长因子BB干预骨髓间充质干细胞的最佳时间及质量浓度。
结果与结论：①经流式鉴定：CD29呈阳性表达(94.6%)，CD45呈阴性表达(3.3%)，CD34呈阴性表达(0.2%)，得到纯度较高的大鼠骨髓间充质干细胞；②采用重复测量方差分析，不同时间点间血小板衍生生长因子BB干预骨髓间充质干细胞的吸光度值改变不同，第3天增殖效果最强，差异有显著性意义(F=27.773，P < 0.001)，进一步采用LSD法对分组因素进行两两比较，25 μg/L 血小板衍生生长因子BB组与其他5组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；③结果表明，25 μg/L血小板衍生生长因子BB干预第3天对骨髓间充质干细胞有明显促增殖作用，血小板衍生生长因
https://orcid.org/0000-0003-0344-8305(魏琴)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 血小板衍生生长因子, 细胞增殖, 大鼠, 实验

Abstract: BACKGROUND: It has been reported that platelet-derived growth factor BB secreted by mouse osteoclasts can promote the formation of osteoblasts and vascular cells, but the optimal concentration and time of platelet-derived growth factor BB on bone marrow mesenchymal stem cells are not clear.
OBJECTIVE: To investigate the optimal concentration and intervention time of platelet-derived growth factor BB to promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in Sprague-Dawley rats.
METHODS: Sprague-Dawley rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro. The third generation of cells was identified by surface cytometry CD45, CD29 and CD34, and bone marrow mesenchymal stem cells with higher purity were selected for intervention experiments. The selected cells were seeded in 96-well culture plates. Cells in the control group were cultured with α-MEM complete medium. Cells in the remaining groups were cultured with α-MEM complete medium combined with 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 μg/L platelet-derived growth factor BB. CCK-8 method was used to detect the proliferation of cells in each group at 1, 3, 5, and 7 days, and the optimal time and concentration of platelet-derived growth factor BB for bone marrow mesenchymal stem cells intervention.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Flow cytometry: mesenchymal stem cells were positive for CD29 (94.6%), negative for CD45 (3.3%), and negative for CD34 (0.2%). Rat bone marrow mesenchymal stem cells with higher purity were obtained. (2) Repeated measurement analysis of variance showed that the absorbance of platelet-derived growth factor BB changed at different times after intervention with bone marrow mesenchymal stem cells. The proliferation effect was the strongest on the third day, and the difference was statistically significant (F=27.773, P < 0.001). LSD method for a pairwise comparison of the grouping factors showed that 25 μg/L platelet-derived growth factor BB group had statistically significant differences with the other five groups (P < 0.05). (3) It was concluded that the 25 μg/L platelet-derived growth factor BB group intervened bone marrow mesenchymal stem cells had a proliferation effect on cells on the third day. Platelet-derived growth factor BB concentration greater than 50 μg/L can promote apoptosis.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, platelet-derived growth factor, cell proliferation, rats, experiment

中图分类号:

姜涛, 吴硕, 李志强, 寿玺, 马依热·努尔买卖提, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 1976-1981.

Jiang Tao, Wu Shuo, Li Zhiqiang, Shou Xi, Mayire·Nuermaimaiti, Ma Chuang, Wei Qin. Platelet-derived growth factor BB promotes the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells of Sprague-Dawley rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(13): 1976-1981.

图/表（结果） 5

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞形态学变化细胞接种第3天，镜下即可见到贴壁细胞有触角伸出，有的伸出一边伪足，有的在细胞两端伸出2个伪足呈梭形，还有的呈多角形，见图1A-C；移动培养瓶即可见到视野中有大量死细胞，可能是骨髓中的原始红细胞，也可能是死亡的骨髓干细胞，换液去除大量死细胞。第1次换液时，镜下可见少量成簇生长的细胞团，可能是没有吹散的骨髓小粒，也可见大量贴壁细胞均已伸出伪足，细胞饱满，折光性很好。生长10 d左右，细胞即可铺满瓶底。随后细胞进入快速生长期，并且随着传代的次数增加，细胞形态越来越均一，生长排列整齐，有的呈漩涡状生长，见图1D-F。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞流式鉴定结果骨髓间充质干细胞的表面标志物经流式细胞仪鉴定，CD29呈阳性表达(94.6%)，CD45呈阴性表达(3.3%)，CD34呈阴性表达(0.2%)，见图2。结果符合间充质干细胞的特征，说明骨髓间充质干细胞的纯度较高。

2.3 血小板衍生生长因子BB干预后细胞形态的改变不同质量浓度血小板衍生生长因子BB干预后第1天，质量浓度>
50 μg/L时细胞发生了凋亡，可见培养瓶中出现大量漂浮细胞，瓶中余下的贴壁细胞形态上发生很大改变，由原来的片状多极化生长变成了两极化生长，并且伪足变成了细长的丝，质量浓度< 25 μg/L时细胞形态改变不是特别明显，细胞仍平铺密集生长，但可见瓶中均有不同程度的细胞凋亡。经不同质量浓度血小板衍生生长因子BB干预后第3天，质量浓度>
50 μg/L时细胞形态如第1天所见，瓶底可见的漂浮细胞越来越多，见图3B，100 μg/L组细胞基本不可见，见图3C；质量浓度为25 μg/L时仍可见部分凋亡的死细胞漂浮，但是细胞形态已经发生明显改变，细胞立体感更强，变成梭形呈多极化、团簇状生长，每个细胞伸出细长的伪足，高倍镜下细丝交织联结呈网状，见图3E-F。在第5，7天各组细胞形态改变均较少。

2.4 不同质量浓度血小板衍生生长因子BB对骨髓间充质干细胞增殖的影响采用重复测量方差分析的统计学方法进行分析，结果显示在不同时间点间血小板衍生生长因子BB干预骨髓间充质干细胞的吸光度值改变不同，差异有显著性意义(F=27.773，P < 0.001)，说明随着干预时间的改变，细胞增殖发生明显变化。不同质量浓度血小板衍生生长因子BB干预骨髓间充质干细胞的吸光度值改变不同，差异有显著性意义(F=134.702，P < 0.001)，说明不同质量浓度血小板衍生生长因子BB干预后细胞增殖发生明显变化。进一步采用LSD法对分组因素进行两两比较，结果表明：25 μg/L血小板衍生生长因子BB组与其他组比较差异均有显著性意义
(P < 0.05)；50，100 μg/L血小板衍生生长因子BB组与其他4组比较差异均有显著性意义(P < 0.001)；对照组与6.25 μg/L血小板衍生生长因子BB组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，与其他4组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。从表1，图4中可以看出，25 μg/L血小板衍生生长因子BB组在第3天的吸光度值明显高于其他各组，随后又呈下降趋势，由此说明25 μg/L血小板衍生生长因子BB组干预3天对细胞有增殖作用。血小板衍生生长因子BB质量浓度大于50 μg/L会促进细胞凋亡。

参考文献

[1] VERLINDEN CR, VAN DE VIJFEIJKEN SE, TUINZING DB, et al. Complications of mandibular distraction osteogenesis for developmental deformities: a systematic review of the literature. Int J Oral Maxillofac Surg. 2015;44(1):44-49.
[2] QI MC, ZOU SJ, HAN LC, et al. Expression of bone-related genes in bone marrow MSCs after cyclic mechanical strain: implications for distraction osteogenesis. Int J Oral Sci. 2009;1(3):143-150.
[3] QI MC, HU J, ZOU SJ, et al. Mechanical strain induces osteogenic differentiation: Cbfa1 and Ets-1 expression in stretched rat mesenchymal stem cells. Int J Oral Maxillofac Surg. 2008;37(5): 453-458.
[4] PEREZ JR, KOUROUPIS D, LI DJ, et al. Tissue Engineering and Cell-Based Therapies for Fractures and Bone Defects. Front Bioeng Biotechnol. 2018;6:105.
[5] DUCHAMP DE LAGENESTE O, JULIEN A, ABOU-KHALIL R, et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nat Commun. 2018;9(1):773.
[6] XIE H, CUI Z, WANG L, et al. PDGF-BB secreted by preosteoclasts induces angiogenesis during coupling with osteogenesis. Nat Med. 2014;20(11):1270-1278.
[7] SAILHAN F. Bone lengthening (distraction osteogenesis): a literature review. Osteoporos Int. 2011;22(6):2011-2015.
[8] ARONSON J, GOOD B, STEWART C, et al. Preliminary studies of mineralization during distraction osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 1990;(250):43-49.
[9] SARATH V,VENKATESWARLU C,RAO BN,et al. A study on functional outcome of Ilizarov fixation in the management of infected nonunion of long bones. J Evolution Med Dent. 2016;5(3):225-228.
[10] JIA Y, QIU S, XU J, et al. Exosomes Secreted by Young Mesenchymal Stem Cells Promote New Bone Formation During Distraction Osteogenesis in Older Rats. Calcif Tissue Int. 2020;106(5):509-517.
[11] CATANZANO AA JR, FITCH RD. The Use of Distraction Osteogenesis and a Taylor Spatial Frame in the Treatment of a Tibial Shaft Nonunion and Deformity in a Pediatric Patient with Osteopetrosis: A Case Report. JBJS Case Connect. 2018;8(4):e93-94.
[12] MONTES-MEDINA L, HERNÁNDEZ-FERNÁNDEZ A, GUTIÉRREZ-RIVERA A, et al. Effect of bone marrow stromal cells in combination with biomaterials in early phases of distraction osteogenesis: An experimental study in a rabbit femur model. Injury. 2018;49(11): 1979-1986.
[13] ZHOU ZC, CHE L, KONG L, et al. CKIP-1 silencing promotes new bone formation in rat mandibular distraction osteogenesis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 2017;123(1):e1-e9.
[14] LIU X, HOU W, HE L, et al. AMOT130/YAP pathway in topography-induced BMSC osteoblastic differentiation. Colloids Surf B Biointerfaces. 2019;182:110332.
[15] BANDARA N, GURUSINGHE S, KONG A, et al. Generation of a nitric oxide signaling pathway in mesenchymal stem cells promotes endothelial lineage commitment. J Cell Physiol. 2019;234(11):20392-20407.
[16] MOVAGHAR B, TIRAIHI T, JAVAN M, et al. Progesterone-induced transdifferentiation of bone marrow stromal cells into Schwann cells improves sciatic nerve transection outcome in a rat model. J Neurosurg Sci. 2017;61(5):504-513.
[17] DAVIES OG, GROVER LM, LEWIS MP, et al. PDGF is a potent initiator of bone formation in a tissue engineered model of pathological ossification. J Tissue Eng Regen Med. 2018;12(1):e355-e367.
[18] BHATTACHARJEE A, KUIPER JH, ROBERTS S, et al. Predictors of fracture healing in patients with recalcitrant nonunions treated with autologous culture expanded bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. J Orthop Res. 2019;37(6):1303-1309.
[19] 卫荣,温欣,魏志勇.中药补肾活血方提取物促进SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖作用的最佳浓度[J].中国组织工程研究,2019, 23(5):691-696.
[20] ZHANG Y, MA Y, WU C, et al. Platelet-derived growth factor BB gene-released scaffolds: biosynthesis and characterization. J Tissue Eng Regen Med. 2016;10(10):E372-E381.
[21] LI DQ, WAN QL, PATHAK JL, et al. Platelet-derived growth factor BB enhances osteoclast formation and osteoclast precursor cell chemotaxis. J Bone Miner Metab. 2017;35(4):355-365.
[22] ONWUKA E, BEST C, SAWYER A, et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regen Med. 2017;12(3):249-261.
[23] YANG X, DONG M, WEN H, et al. MiR-26a contributes to the PDGF-BB-induced phenotypic switch of vascular smooth muscle cells by suppressing Smad1. Oncotarget. 2017;8(44):75844-75853.
[24] MIHAYLOVA Z, TSIKANDELOVA R, SANIMIROV P, et al. Role of PDGF-BB in proliferation, differentiation and maintaining stem cell properties of PDL cells in vitro. Arch Oral Biol. 2018;85:1-9.
[25] LIN C, YUAN Y, COURTMAN DW. Differentiation of Murine Bone Marrow-Derived Smooth Muscle Progenitor Cells Is Regulated by PDGF-BB and Collagen. PLoS One. 2016;11(6):e0156935.

引言

材料方法

1.1 设计重复测量实验。
1.2 时间及地点实验于2017年9月至2018年12月在新疆医科大学实验室与设备管理处完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性健康SPF级SD大鼠10只，4周龄，体质量(120±20) g，购自新疆医科大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK(新)2013-0001。所有SD大鼠均在新疆医科大学动物实验室按照国际AAALAC标准统一管理，动物实验经过新疆医科大学第一附属医院实验动物与使用管理委员会审核，伦理审批号为IACUC20170706-02。
1.3.2 实验试剂及仪器 α-MEM培养基、澳洲胎牛血清(Gibco公司)；1%青链霉素、0.25%trypsin-0.02%EDTA消化液、PBS (Hyclone公司)；CCK-8(日本同仁化学研究所)；CD34抗体 (Abcam公司)；CD29抗体(BD公司)；CD45抗体(eBioscience
公司)；血小板衍生生长因子BB (Catalog: 520-BB； R&D公司)；CO2恒温培养箱、酶标仪(Thermo公司)；流式细胞仪(BD公司)；荧光倒置显微镜(Zeiss公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养雄性健康SD大鼠颈椎脱臼处死，置于无菌手术单上，用体积分数为75%乙醇喷洒全身，用组织剪剪开后肢皮肤、肌肉，取股骨，用无菌纱布剔除骨上的黏附组织，置于含有200 U/mL青链霉素的PBS中浸泡1 min，剪开两端骨骺端，暴露骨髓腔，用20 mL注射器吸取α-MEM培养液，换小号针头插入骨髓腔冲出骨髓，用20 mL注射器反复吹吸细胞悬液，将骨髓小粒尽可能冲散，吸取细胞悬液于50 mL离心管中，1 000 r/min
离心5 min，弃上清，再用α-MEM洗2遍，加入完全培养基(体积分数为10%胎牛血清+100 U/mL 青链霉素+1%谷氨酰胺+α-MEM)，重悬细胞接种于25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中，3 d换液 1次。
待原代细胞长至90%左右时进行传代，吸弃培养基，加入2 mL PBS清洗细胞2次，用0.25%胰蛋白酶+
0.02%EDTA消化细胞约2 min，细胞呈细沙状从瓶底脱落，以1∶2传代，接种后每3 d 换液1次，在荧光倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，并拍照记录，当细胞融合至90%左右时如上传代，余类推。

1.4.2 流式细胞鉴定取4瓶第3代骨髓间充质干细胞进行消化，待消化完全时，分别加入1 mL α-MEM完全培养基，每瓶细胞收集于单独的1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗细胞3次，最后用200目筛网过滤，每管计数细胞约1×109 L-1，分别加入CD45、CD34、CD29抗体，4 °C孵育30 min，PBS清洗细胞1次，重悬于1 mL PBS，上流式细胞仪检测CD29、CD34、CD45的抗原表达量。

1.4.3 CCK-8法筛选血小板衍生生长因子BB的最佳干预时间和最佳干预质量浓度选取第3代对数生长期的骨髓间充质干细胞，吸弃培养基，用PBS洗1遍，加入胰酶消化，所得细胞用完全培养基制成1×108 L-1的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，每组设6个复孔，接种完毕移至CO2培养箱继续培养，24 h后镜下观察，待细胞长至50%即可加入血小板衍生生长因子BB干预。用完全培养基配置不同质量浓度的血小板衍生生长因子BB，分别为6.25，12.5，25，50，100 μg/L，按每孔100 μL加入到96孔板中，对照组细胞只加入完全培养基，空白组没有细胞，只加入完全培养基，于干预后的1，3，5，7 d各取出1块板用于CCK-8检测。取出96孔板，避光下每孔加入10 μL CCK-8试剂，于普通恒温培养箱中37 ℃避光孵育3 h，用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度值，取6个孔平均值。以吸光度值的平均值为纵坐标，时间为横坐标，绘制趋势图，即骨髓间充质干细胞的吸光度值在不同时间随着血小板衍生生长因子BB质量浓度改变的折线图。
1.5 主要观察指标 ① SD大鼠骨髓间充质干细胞在培养不同时期的形态学改变；②SD大鼠骨髓间充质干细胞流式细胞鉴定结果；③不同质量浓度血小板衍生生长因子BB干预后的细胞形态变化；④CCK-8法检测不同质量浓度血小板衍生生长因子BB促进骨髓间充质干细胞增殖的作用，筛选最佳药物质量浓度及最佳干预时间。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0对实验数据进行统计学分析，计量资料采用x±s表示，检验水准α=0.05，各组数据经K-S检验符合正态分布(P > 0.05)，经Leven检验各组数据方差齐。数据分析主体效应检验采用重复测量方差分析，首先进行球形检验，如果球形检验P > 0.05，说明服从球形假设，各组间数据比较采用单因素方差分析。

讨论

牵张成骨技术是一种重要的骨再生技术，其基本原理是切开骨皮质并在骨皮质的断端两侧施加稳定而持续、缓慢的骨牵张应力，使骨组织中的成骨系细胞在张应力的微环境下增殖，并且向成骨分化，从而促进新骨生成[7-8]。牵张加力过程中，除了促进骨组织再生外，还伴有神经、肌肉、血管等骨周围软组织的生成。与传统的骨重建技术相比，牵张成骨技术是一种操作时间短、出血少、住院时间短、成本低、并发症风险低的简单方法[9-11]，但是也存在着它的局限性，牵张成骨技术的瓶颈是其过长的疗程以及由之而引起的易感染、神经损伤、牵引器易脱落等不足，患者也因长期佩戴牵引器而影响生活质量[6]。为了弥补牵张成骨技术的不良反应，试图寻找一种新的解决方法加快新的骨痂和血管生成来修复骨缺损。研究显示，骨髓间充质干细胞可以作为种子细胞应用于牵张成骨的骨再生[12-13]，骨髓间充质干细胞具有很强的增殖和分化能力，作为多能造血干细胞可以在不同诱导因子的作用下向成骨细胞[14]、血管细胞[15]、神经细胞[16]、骨骼肌细胞等方面分化[17]，这些细胞对于新骨的生成、牵张区结缔组织的构建、周围软组织的恢复以及牵张成骨新生骨痂的形成都具有重要作用。BHATTACHARJEE等[18]采用自体骨髓间充质干细胞治疗骨折愈合的研究表明，增殖的骨髓间充质干细胞有利于促进骨折愈合。
该研究首先进行了雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞的原代细胞分离与培养，根据实验结果可以看出，骨髓间充质干细胞具有较强的增殖能力，7-10 d即可长满培养瓶进行细胞传代。与文献报道一致[19]，第3代即可得到较为纯化的骨髓间充质干细胞。通过流式细胞仪得到阳性指标CD29表达为94.6%，而阴性指标 CD45和CD34表达分别是3.3%和0.2%，这就说明了获得的种子细胞纯度较高，可用于下一步的药物干预实验。
有学者发现，血小板衍生生长因子最初从血小板中分离出来，是间充质干细胞迁移和增殖的关键生长因子[20] ，大量实验证实血小板衍生生长因子BB在骨折愈合早期就开始出现，作用贯穿全程，各阶段均能够有效诱导软骨细胞及成骨细胞增殖，同时可提高破骨细胞活性、加速骨吸收，促进骨重塑。XIE等[6]报道由前破骨细胞分泌的血小板衍生生长因子BB促进骨细胞形成的同时促进骨组织中血管的形成。LI等[21]
发现血小板衍生生长因子BB能够增强体外和体内破骨细胞的形成，证实了血小板衍生生长因子BB对破骨细胞前体细胞和破骨细胞生成信号分子表达影响显著。ONWEKA等[22]
使用血小板衍生生长因子BB和血小板衍生生长因子BB基因敲除(PDGF-KO)的骨髓移植物植入野生型小鼠中发现，血小板衍生生长因子BB通过调节平滑肌细胞增殖，巨噬细胞凋亡和细胞外基质沉积而促进新生血管形成。
鉴于以上研究结果，课题组采用血小板衍生生长因子BB干预骨髓间充质干细胞以促进其成骨和成血管分化，但是尚未有明确的作用浓度及干预时间。首先根据文献[23-25]
设定血小板衍生生长因子BB的质量浓度梯度为0，6.25，12.5，25，50，100 μg/L，分别干预1，3，5，7 d。从细胞形态来看，在不同质量浓度血小板衍生生长因子BB作用下，细胞呈现不同程度的凋亡，质量浓度> 12.5 μg/L时开始出现悬浮细胞，可能是血小板衍生生长因子BB作用下细胞分化生成的代谢产物，质量浓度> 50 μg/L时细胞凋亡较为明显，可能是此浓度已经对细胞产生毒性作用。血小板衍生生长因子BB作为一把双刃剑，在合适的质量浓度下可以诱导骨髓间充质干细胞分化成所需要的靶细胞，超过一定的质量浓度则会对细胞产生毒性作用，导致细胞死亡。随着培养时间的延长，25 μg/L 血小板衍生生长因子BB诱导第3天可见细胞立体感更强，变成梭形呈多极化、团簇状生长，每个细胞伸出细长的伪足，这些伪足交织联结呈网状，四周的细胞紧紧聚集在一起，形成一个个管腔样结构。
采用CCK-8法检测不同质量浓度血小板衍生生长因子BB干预骨髓间充质干细胞以获得细胞增殖的最佳给药浓度及给药时间。经过统计学比较，从时间因素来看，不同时间点血小板衍生生长因子BB干预骨髓间充质干细胞的吸光度值改变差异有显著性意义，血小板衍生生长因子BB干预骨髓间充质干细胞会随着时间的延长而变化，并且时间越长，细胞增殖越慢，说明并不是血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞时间越长越好。不同质量浓度血小板衍生生长因子BB干预细胞的吸光度值差异也有显著性意义。从结果可以看出，低质量浓度的血小板衍生生长因子BB对骨髓间充质干细胞的增殖作用不明显，但是不会促进骨髓间充质干细胞凋亡，而随着血小板衍生生长因子BB质量浓度增加，>
50 μg/L的血小板衍生生长因子BB会对大鼠骨髓间充质干细胞起到凋亡作用，但是这还需要进一步实验验证。经分析得出25 μg/L 血小板衍生生长因子BB组干预3 d对细胞有增殖作用，且效果最佳。
综上所述，血小板衍生生长因子BB能有效促进骨髓间充质干细胞体外增殖，25 μg/L血小板衍生生长因子BB诱导3 d对细胞增殖作用最强，且效果最佳。低质量浓度的血小板衍生生长因子BB无法有效促进骨髓间充质干细胞增殖，而高质量浓度会促进细胞凋亡。文献报道血小板衍生生长因子BB干预细胞时间为0，3，6，12，24，48 h[23]，而该实验干预时间为1，3，5，7 d，也未能进行14 d的成骨诱导分化，这些可能是该实验存在的问题。根据该实验的结果，可进行下一步血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞成骨和成血管分化研究，并通过相关的通路来阐明血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞增殖及其凋亡的原因，进一步为加快牵张成骨动物模型的骨折愈合奠定研究基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

血小板衍生生长因子BB促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖

Platelet-derived growth factor BB promotes the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells of Sprague-Dawley rats

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张超, 吕欣. 髋臼骨折固定后的异位骨化：危险因素、预防及其治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1434-1439.
[4]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[5]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[6]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[7]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[8]	谭婧玉, 刘海文. 成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1243-1248.
[9]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[10]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[11]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[12]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[13]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[14]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[15]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.