猪骨髓间充质干细胞抑制脂多糖诱导炎症反应改善猪胰岛细胞功能损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2195

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (13): 1969-1975.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2195

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猪骨髓间充质干细胞抑制脂多糖诱导炎症反应改善猪胰岛细胞功能损伤

袁宝红，赵维山，王若天，管傲然，王珏，李汝红

昆明市延安医院(昆明医科大学附属延安医院)普通外科一科，云南省昆明市 650051

收稿日期:2020-01-07 修回日期:2020-01-14 接受日期:2020-04-27 出版日期:2021-05-08 发布日期:2020-12-28
通讯作者: 李汝红，博士，主任医师，博士生导师，昆明市延安医院(昆明医科大学附属延安医院)普通外科一科，云南省昆明市 650051
作者简介:袁宝红，男，1988年生，2014年广西医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事肝胆胰外科方向研究。赵维山，男，1973年生，副主任医师，主要从事肝胆胰外科方向研究。
基金资助:
云南省科技厅-昆明医科大学联合专项[2019FE001(-099)]，项目负责人：袁宝红

Bone marrow mesenchymal stem cells from pigs inhibit inflammatory response induced by lipopolysaccharide and improve islet cell dysfunction in pigs

Yuan Baohong, Zhao Weishan, Wang Ruotian, Guan Aoran, Wang Yu, Li Ruhong

First Department of General Surgery, Yan’an Hospital of Kunming City (Affiliated Yan’an Hospital of Kunming Medical University), Kunming 650051, Yunnan Province, China

Received:2020-01-07 Revised:2020-01-14 Accepted:2020-04-27 Online:2021-05-08 Published:2020-12-28
Contact: Li Ruhong, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, First Department of General Surgery, Yan’an Hospital of Kunming City (Affiliated Yan’an Hospital of Kunming Medical University), Kunming 650051, Yunnan Province, China
About author:Yuan Baohong, Master, Attending physician, First Department of General Surgery, Yan’an Hospital of Kunming City (Affiliated Yan’an Hospital of Kunming Medical University), Kunming 650051, Yunnan Province, China Zhao Weishan, Associate chief physician, First Department of General Surgery, Yan’an Hospital of Kunming City (Affiliated Yan’an Hospital of Kunming Medical University), Kunming 650051, Yunnan Province, China
Supported by:
the Joint Project of Yunnan Science and Technology Department and Kunming Medical University, No. 2019FE001(-099) (to YBH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨髓间充质干细胞改善猪胰岛细胞功能损伤：骨髓间充质干细胞是从骨髓基质中分离出来的干细胞，具有易用性、可扩展性和多分化潜能性，可直接分化为受损伤的组织细胞或旁分泌一些物质来调控疾病的进展。骨髓间充质干细胞已被证实与胰岛联合移植可通过调控胰岛细胞中miRNAs的表达来改善移植物的功能。
JNK/C-Jun信号通路：JNK(c-Jun氨基末端激酶)是MAPK家族成员之一，其磷酸化常被一些炎性因子激活，因此常作为抗炎治疗的分子靶点。JNK是c-Jun的上游因子，不仅可调控c-Jun表达，还可激活磷酸化c-Jun，c-Jun在调控细胞增殖、分化、侵袭和凋亡方面起关键作用。

背景：猪胰岛移植是治疗糖尿病的常用手段，但炎症反应和氧化应激会导致猪胰岛移植的远期效果欠佳。猪骨髓间充质干细胞已被证实与胰岛联合移植可改善移植物的功能。但关于猪骨髓间充质干细胞通过调节胰岛细胞中miR-299-5p的表达来调控胰岛β细胞功能和存活率还尚未被报道。
目的：探讨猪骨髓间充质干细胞通过miR-299-5p/SIAH1分子轴调控JNK/C-Jun信号通路对猪胰岛细胞功能损伤的影响。
方法：用脂多糖诱导猪胰岛细胞功能损伤，然后与骨髓间充质干细胞共培养24 h，采用ELISA检测猪胰岛细胞中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、活性氧、超氧化物歧化酶及胰岛素水平，Hoechst 33258染色观察猪胰岛细胞凋亡情况，Annexin V-FITC/PI检测猪胰岛细胞凋亡率，Western blot检测SIAH1和JNK/C-Jun信号通路相关蛋白表达；qPCR检测猪胰岛细胞中与胰岛细胞功能损伤有关的miRNAs表达；双荧光素酶报告基因验证miR-299-5p和SIAH1的靶向关系。
结果与结论：①猪骨髓间充质干细胞抑制脂多糖引起的白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、活性氧上调和促凋亡作用，同时也抑制脂多糖引起的超氧化物歧化酶、胰岛素分泌量下调作用；②猪骨髓间充质干细胞显著上调miR-299-5p表达，miR-299-5p可通过靶向下调SIAH1表达抑制JNK/C-Jun信号通路激活；③结果表明，猪骨髓间充质干细胞通过调控miR-299-5p/SIAH1分子轴抑制JNK/C-Jun信号通路激活，抑制脂多糖诱导的炎症反应、氧化应激和猪胰岛细胞凋亡，并促进胰岛素分泌，从而改善猪胰岛细胞功能。
https://orcid.org/0000-0001-8313-0086(袁宝红)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 胰岛细胞, 脂多糖, 炎症, 氧化应激, 猪, 实验

Abstract: BACKGROUND: Porcine pancreatic islet transplantation is a common treatment for diabetes mellitus, but inflammatory reaction and oxidative stress can lead to poor long-term effect. It has been confirmed that transplantation of porcine bone marrow mesenchymal stem cells with islets can improve graft function. However, it has not been reported that porcine bone marrow mesenchymal stem cells regulate the expression of miR-299-5p in islet cells to regulate the function and survival rate of islet β cells.
OBJECTIVE: To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells in pigs on functional impairment of islet in pig by regulating the JNK/C-Jun pathway through the miR-299-5p/SIAH1 molecular axis.
METHODS: Lipopolysaccharide was used to induce functional impairment of porcine islet cells, which were co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells for 24 hours. Interleukin-6, interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, reactive oxygen species, superoxide dismutase and insulin levels in islet cells were detected by ELISA. Hoechst 33258 staining was used to observe apoptosis. Annexin V-FITC/PI was used to detect the apoptosis rate of porcine islet cells. Western blotting was used to detect the expression of SIAH1 and proteins associated with JNK/C-Jun pathway. The expression of miRNAs in porcine islet cells was detected by qPCR. The dual-luciferase reporter gene assay verified the targeting relationship between miR-299-5p and SIAH1.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Bone marrow mesenchymal stem cells in pigs inhibited the up-regulation of interleukin-6, interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, reactive oxygen species and pro-apoptotic effects, and also inhibited the down-regulation of superoxide dismutase and insulin secretion induced by lipopolysaccharide. (2) Bone marrow mesenchymal stem cells of pigs significantly upregulated miR-299-5p expression. miR-299-5p inhibited activation of the JNK/C-Jun pathway by down-regulating SIAH1 expression. (3) Results indicate that bone marrow mesenchymal stem cells of pigs inhibit the activation of the JNK/C-Jun pathway, inhibit the inflammatory response, oxidative stress and apoptosis of islet cells in pigs, and promote the secretion of insulin by regulating the miR-299-5p/SIAH1 axis, hereby improving the functional damage of porcine islet cells.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, islet cells, lipopolysaccharide, inflammation, oxidative stress, pig, experiment

中图分类号:

袁宝红, 赵维山, 王若天, 管傲然, 王珏, 李汝红. 猪骨髓间充质干细胞抑制脂多糖诱导炎症反应改善猪胰岛细胞功能损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 1969-1975.

Yuan Baohong, Zhao Weishan, Wang Ruotian, Guan Aoran, Wang Yu, Li Ruhong. Bone marrow mesenchymal stem cells from pigs inhibit inflammatory response induced by lipopolysaccharide and improve islet cell dysfunction in pigs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(13): 1969-1975.

图/表（结果） 5

2.1 猪骨髓间充质干细胞改善脂多糖引起的胰岛细胞功能损伤如图1所示，脂多糖处理猪胰岛细胞12 h后，细胞中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α及活性氧水平显著上调，超氧化物歧化酶及胰岛素水平显著下调(均P < 0.01)；猪骨髓间充质干细胞与脂多糖处理12 h后的胰岛细胞共培养后，恢复了脂多糖对猪胰岛细胞的促炎和促氧化应激的作用(均P < 0.05)。
如图1D所示，Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下可见正常对照组猪胰岛细胞被均匀染色，没有明显的凋亡荧光信号；脂多糖处理猪胰岛细胞12 h后，细胞凋亡荧光信号明显增强；猪骨髓间充质干细胞与脂多糖处理12 h后的胰岛细胞共培养后，恢复了脂多糖对猪胰岛细胞凋亡荧光信号的促进作用。
如图1E所示，Annexin V-FITC/PI检测猪胰岛细胞凋亡率，脂多糖处理猪胰岛细胞12 h后，猪胰岛细胞凋亡率显著增加(均P < 0.05)；猪骨髓间充质干细胞与脂多糖处理12 h后的胰岛细胞共培养后，恢复了脂多糖对猪胰岛细胞凋亡的促进作用(均P < 0.05)。由此可知，猪骨髓间充质干细胞改善了脂多糖引起的胰岛细胞功能损伤。

2.2 猪骨髓间充质干细胞上调miR-299-5p表达如图2所示，脂多糖显著抑制了与胰岛细胞功能损伤修复有关的miRNAs表达[4，13-15]，而骨髓间充质干细胞与脂多糖处理12 h后的胰岛细胞共培养后，发现这些miRNAs的表达较脂多糖组显著上调，且miR-299-5p表达上调最为显著(P < 0.01)。由此可知，猪骨髓间充质干细胞可上调猪胰岛细胞中与胰岛细胞功能损伤修复有关的miRNAs的表达，尤其是miR-299-5p表达。

2.3 miR-299-5p靶向下调SIAH1表达生物信息学数据库Starbase预测miR-299-5p和SIAH1靶向关系，如图3A所示，SIAH1是miR-299-5p的潜在靶基因。如图3B所示，双荧光素酶报告基因检测过表达miR-299-5p显著降低WT质粒荧光素酶活性(P < 0.01)，而对MUT质粒荧光素酶活性无显著影响。如图3C所示，过表达miR-299-5p显著抑制胰岛细胞中SIAH1表达(P < 0.01)。由此可知，miR-299-5p靶向下调SIAH1表达。

2.4 miR-299-5p抑制SIAH1表达进而抑制JNK/C-Jun信号通路激活 Western blot检测结果如图4所示，单独转染
miR-299-5p mimic或si-SIAH1显著抑制SIAH1、p-JNK、p-C-Jun表达，共转染miR-299-5p inhibitor和si-SIAH1恢复单独转染miR-299-5p mimic或si-SIAH1对SIAH1、JNK和C-Jun磷酸化的抑制作用(均P < 0.01)。由此可知，过表达miR-299-5p通过抑制SIAH1表达，进而抑制JNK/C-Jun信号通路激活。

2.5 猪骨髓间充质干细胞通过miR-299-5p/SIAH1分子轴抑制JNK/C-Jun信号通路改善脂多糖引起的猪胰岛细胞功能损伤 ELISA检测结果如图5所示，与脂多糖处理组相比，脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理组、脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后同时敲降miR-299-5p和SIAH1组、SP600125干预脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后敲降miR-299-5p组的胰岛细胞中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α及活性氧水平显著降低，超氧化物歧化酶表达及胰岛素水平显著增加(均P < 0.05)；而脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后敲降miR-299-5p组、脂多糖和骨髓间充质干细胞及Anisomycin共同处理组、SP600125干预脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后同时敲降miR-299-5p和SIAH1组胰岛细胞中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、活性氧、超氧化物歧化酶及胰岛素水平与脂多糖处理组无显著差异。
Hoechst 33258染色结果如图5D所示，脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理组、脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后同时敲降miR-299-5p和SIAH1组、SP600125干预脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后敲降miR-299-5p组的胰岛细胞被均匀染色，没有明显的凋亡荧光信号，而脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后敲降miR-299-5p组、脂多糖和骨髓间充质干细胞及Anisomycin共同处理组、SP600125干预脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后同时敲降miR-299-5p和SIAH1组的胰岛细胞中凋亡荧光信号明显增强。
Annexin V-FITC/PI 检测结果如图5E所示，与脂多糖处理组相比，脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理组、脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后同时敲降miR-299-5p和SIAH1组、SP600125干预脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后敲降miR-299-5p组的胰岛细胞凋亡率显著降低(均P < 0.05)；而脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后敲降miR-299-5p组、脂多糖和骨髓间充质干细胞及Anisomycin共同处理组、SP600125干预脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后同时敲降miR-299-5p和SIAH1组的胰岛细胞凋亡率与脂多糖处理组无显著差异。由此可知，猪骨髓间充质干细胞通过调控
miR-299-5p/SIAH1分子轴抑制JNK/C-Jun信号通路，从而改善脂多糖引起的猪胰岛细胞功能损伤。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞分组对照观察实验。
1.2 时间及地点实验于2019年3月至2020年1月在昆明市延安医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物云南小耳猪6只购买于昆明医科大学实验动物学部，雄性，猪龄2-4个月，体质量20-30 kg，检查无异常，毛色光亮，无脱毛，身体无炎性疾病，无传染性疾病，体内外无寄生虫。
1.3.2 实验试剂胎牛血清、含双抗的RPMI1640培养基(上海信裕生物科技有限公司)；Lipofectamine 2000(规格：
1.5 mL，货号：11668-019)转染试剂(上海翊圣生物科技有限公司)；JNK特异性激活剂Anisomycin(规格：10 mg，货号：HY-18982)和JNK特异性抑制剂SP600125(规格：10 mg，货号：HY-12041)(MedChemExpress公司)；ELISA试剂盒及SIAH1抗体(北京义翘神州科技有限公司)；Hoechst 33258(规格：100 mg，货号：A3466)(美国APExBIO公司)；一步法反转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)；RIPA裂解液、Trizol试剂盒(Thermo Fisher公司)；双荧光素酶报告基因试剂盒(江苏科特生物技术有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 猪胰岛细胞和骨髓间充质干细胞分离、培养及转染根据以前报道的方法分离和培养猪胰岛细胞[8]、猪骨髓间充质干细胞[9]。取处于对数生长期的猪胰岛细胞，接种于6孔板，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，待细胞汇合度到70%-80%时按Lipofectamine 2000转染试剂说明书将miR-299-5p mimics/inhibitor、NC-mimics及si-SIAH1转染至猪胰岛细胞，并于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中继续培养48 h待用。
猪骨髓间充质干细胞改善脂多糖引起的胰岛细胞功能损伤实验分组：①正常对照组：猪胰岛细胞正常培养；②脂多糖处理组：猪胰岛细胞用10 mg/L脂多糖处理12 h；③脂多糖和猪骨髓间充质干细胞共同处理组：猪骨髓间充质干细胞与脂多糖处理12 h后的胰岛细胞共培养24 h。各组细胞分别进行ELISA检测、Hoechst 33258染色、Annexin V-FITC/PI检测。
猪骨髓间充质干细胞通过miR-299-5p/SIAH1分子轴抑制JNK/C-Jun信号通路改善脂多糖引起的猪胰岛细胞功能损伤实验分组：①脂多糖处理组；②脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理组；③脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后敲降miR-299-5p组；④脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后同时敲降miR-299-5p和SIAH1组；⑤脂多糖和骨髓间充质干细胞及Anisomycin共同处理组；⑥SP600125干预脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后敲降miR-299-5p组；⑦SP600125干预脂多糖和骨髓间充质干细胞共同处理后同时敲降miR-299-5p和SIAH1组。各组细胞分别进行ELISA检测、Hoechst 33258染色、Annexin V-FITC/PI检测。
miR-299-5p抑制SIAH1表达进而抑制JNK/C-Jun信号通路激活实验分组：①正常对照组；②过表达miR-299-5p组；③敲降SIAH1组；④同时敲降miR-299-5p和SIAH1组。Western blot检测各组胰岛细胞中SIAH1和JNK/C-Jun信号通路相关蛋白的表达。
1.4.2 脂多糖诱导猪胰岛细胞功能损伤取处于对数生长期的猪胰岛细胞，根据文献[10]用10 mg/L脂多糖处理12 h，模拟移植胰岛细胞所处的炎症和氧化应激环境，诱导猪胰岛细胞功能损伤。
1.4.3 骨髓间充质干细胞和猪胰岛细胞Transwell共培养分别取第3代骨髓间充质干细胞与用脂多糖处理12 h后的猪胰岛细胞，将骨髓间充质干细胞按1×106密度接种于Transwell共培养系统的上室，在37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养过夜，再将猪胰岛细胞按1×106密度接种于Transwell共培养系统的下室，加入含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基1 mL，让上下室的培养液相互通融，从而建立起骨髓间充质干细胞与猪胰岛细胞的共培养体系，在37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中共培养24 h后检测猪胰岛细胞相关指标。
1.4.4 JNK特异性激活剂Anisomycin和JNK特异性抑制剂SP600125分别激活和抑制JNK信号通路取脂多糖单独处理或者脂多糖和猪骨髓间充质干细胞共同处理后的胰岛细胞，过表达miR-299-5p、敲降SIAH1或同时敲降miR-299-5p和SIAH1，然后分别加入0.4 mg/L Anisomycin[11]和50 mmol/L SP600125[12]，继续培养12 h后检测各项指标。
1.4.5 ELISA检测猪胰岛细胞中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、活性氧、超氧化物歧化酶及胰岛素水平收集各组待测猪胰岛细胞并制备成细胞悬液，根据相应的ELISA试剂盒说明检测猪胰岛细胞中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、活性氧、超氧化物歧化酶及胰岛素水平。
1.4.6 Hoechst 33258染色检测猪胰岛细胞凋亡情况收集各组猪胰岛细胞，在室温下用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次，然后在室温下用Hoechst 33258(10 mg/L)避光染色5 min，PBS冲洗细胞3次，使用Eclipse TS100荧光显微镜观察各组猪胰岛细胞的核形态变化，明亮的蓝色核染表明核固缩。
1.4.7 Annexin V-FITC/PI检测猪胰岛细胞凋亡率收集各组猪胰岛细胞，用0.25%胰酶消化后，1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用500 μL Buffer液重悬细胞后加入5 μL Annexin V-FITC，充分混匀后室温避光孵育15 min，再加入5 μL PI染色液，混匀后室温避光孵育5 min，使用流式细胞仪检测猪胰岛细胞凋亡水平。
1.4.8 Western blot检测猪胰岛细胞中SIAH1和JNK/C-Jun信号通路相关蛋白的表达水平收集各组猪胰岛细胞，PBS洗涤2次，加入RIPA裂解液，37 ℃水浴30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，使用BCA法测蛋白浓度。按50 μg蛋白量对应体积加入SDS-PAGE凝胶加样孔中，用电转移法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h后加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜；次日，TBST洗涤3次，加入HRP标记的二抗(均1∶5 000)，室温孵育2 h；TBST洗涤3次后加入ECL化学发光液进行显影，然后在凝胶成像仪上拍照，采用Image J灰度分析软件分析灰度值，计算相对表达量。
1.4.9 RT-qPCR检测猪胰岛细胞中与胰岛细胞功能损伤修复有关的miRNAs表达水平通过查询文献，发现miR-29a、
miR-181c、miR-96、miR-299-5p均为促进胰岛细胞功能损伤修复的miRNAs，因此使用qPCR检测各组细胞中这些miRNAs
的表达水平。收集各组猪胰岛细胞，使用Trizol Reagent分别提取各细胞中总RNA，用一步法反转录试剂盒将全部RNA反转录成cDNA，以U6为内参，进行PCR扩增，扩增程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共50个循环，引物序列见表1，结果采用2-ΔΔCt表示。

1.4.10 双荧光素酶报告基因验证miR-299-5p和SIAH1的靶向关系 StarBase数据库预测miR-299-5p和SIAH1的结合位点，并导入pmirGLO luciferase载体中，获得SIAH1野生型载体(WT)；应用基因突变技术改变miR-299-5p和SIAH1的结合位点，用同样的方法构建SIAH1突变型载体(MUT)。将WT、MUT分别和miR-299-5p mimics或miR-NC转染到猪胰岛细胞内，培养48 h后用双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组荧光素酶活性。
1.5 主要观察指标 ①各组猪胰岛细胞中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、活性氧、超氧化物歧化酶、胰岛素水平；②各组猪胰岛细胞凋亡率；③各组猪胰岛细胞中miR-299-5p、SIAH1的表达以及JNK/C-Jun信号通路相关蛋白的表达。
1.6 统计学分析实验均重复3次，数据以x±s表示。采用GraphPad Prism 7进行数据分析和相关图片绘制，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

糖尿病是一种代谢异常疾病，这些代谢异常在较长时间内与高血糖水平有关，并可能引起许多并发症[16]。据报道，糖尿病的主要病因是继发胰岛破坏和其他影响剩余β细胞功能的因素导致胰岛素相对不足[17]，因此胰岛移植成为治疗糖尿病的手段之一。然而，胰岛移植后会受各种不利于移植物生长的微环境影响[18]，导致胰岛移植的治疗效果受到极大影响。
间充质干细胞是结缔组织衍生的干细胞，具有自我更新和多向分化能力，可通过分泌免疫调节细胞因子、组织修复生长因子和小膜泡来介导多种癌症细胞的生物学过程，被认为具有重要的治疗潜力[19]。此前已有研究证实，骨髓间充质干细胞与胰岛细胞一起移植较单独移植胰岛细胞的降糖功效更好[20]。此外，骨髓间充质干细胞还具有保护人胰岛免受促炎因子和氧化应激的影响，进而促进胰岛细胞功能损伤修
复[21]。该研究发现骨髓间充质干细胞可抑制脂多糖诱导的炎症反应和氧化损伤，并促进胰岛细胞分泌胰岛素。
众所周知，miRNA失调在多种疾病中均有发生，且异常表达的miRNA还可调节细胞凋亡、自噬[22]、细胞炎症反应及氧化应激等[22-23]，进而调控细胞生理、病理过程。例如，miR-34a在高葡萄糖和棕榈酸酯(HG/PA)诱导的INS-1细胞中异常高表达，而敲降miR-34a可抑制HG/PA诱导的氧化应激和INS-1细胞凋亡[24]；miR-299-5p在糖脂毒性条件下的胰岛细胞中低表达，且其抑制作用会引起胰岛细胞功能障碍和凋亡[4]。此前有研究报道，骨髓间充质干细胞可通过上调细胞中多种miRNA表达，调控细胞微环境，进而调控细胞生物学进程。例如，骨髓间充质干细胞可通过上调miR-223表达抑制炎症反应，保护肝损伤[25]。但骨髓间充质干细胞对miR-299-5p的调控作用还尚未被报道。该研究发现，miR-299-5p在脂多糖诱导的胰岛细胞中异常低表达，骨髓间充质干细胞可上调miR-299-5p表达。
miRNA可通过阻断蛋白质翻译或诱导mRNA降解来调节基因的表达，从而调控转录后网络而参与多种病理过程[26]。SIAH1作为miR-299-5p靶基因可参与细胞多种过程，包括有丝分裂、神经元可塑性、血管生成、炎症和细胞死亡等[27]。例如，抑制星形胶质细胞中SIAH1表达可减轻炎症反应[28]。SIAH1可通过调控JNK/C-Jun信号通路参与疾病发生发展过程，例如，SIAH1通过激活JNK信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡，进而抑制乳腺癌恶性生物学行为[29]。还有研究报道，JNK/C-Jun信号通路的激活可诱导胰岛细胞凋亡[28]，还会引起胰岛细胞功能障碍[30]。此外，骨髓间充质干细胞可通过调控JNK/C-Jun信号通路发挥其治疗作用，例如，VAHIDINIA等[31]发现骨髓间充质干细胞可抑制JNK信号通路的激活，以此在缺血性脑损伤中起神经保护作用。该研究发现，miR-299-5p靶向下调SIAH1表达，进而抑制JNK/C-Jun信号通路激活。
综上所述，猪骨髓间充质干细胞可通过上调miR-299-5p对SIAH1表达的抑制作用，进而抑制JNK/C-Jun信号通路的激活，抑制脂多糖诱导的炎症反应和氧化损伤，改善猪胰岛细胞功能损伤。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

猪骨髓间充质干细胞抑制脂多糖诱导炎症反应改善猪胰岛细胞功能损伤

Bone marrow mesenchymal stem cells from pigs inhibit inflammatory response induced by lipopolysaccharide and improve islet cell dysfunction in pigs

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