胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2166

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (7): 1019-1025.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2166

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胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制

朱雪芬1，黄成1，丁健1，戴永平1，刘元兵1，乐礼祥1，王亮亮1，杨建东2

1如皋市人民医院，江苏省如皋市 226500；2江苏省苏北人民医院脊柱外科，江苏省扬州市 225000

收稿日期:2020-02-12 修回日期:2020-02-22 接受日期:2020-04-03 出版日期:2021-03-08 发布日期:2020-12-08
通讯作者: 杨建东，主任医师，副教授，硕士生导师，江苏省苏北人民医院脊柱外科，江苏省扬州市 225000
作者简介:朱雪芬，女，1992年生，江苏省如皋市人，汉族，2014年扬州大学毕业，主要从事临床护理专业研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81071466)；扬州市十三五科教兴卫领军人才计划资助(扬卫科教[2018]6号)；南通市科技局科研基金项目(GJZ16044)；如皋市科研计划项目 (SRG(15) 3015)

Mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells differentiation into functional neurons induced by glial cell line derived neurotrophic factor

Zhu Xuefen1, Huang Cheng1, Ding Jian1, Dai Yongping1, Liu Yuanbing1, Le Lixiang1, Wang Liangliang1, Yang Jiandong2

1Rugao People’s Hospital, Rugao 226500, Jiangsu Province, China; 2Department of Spine Surgery, Northern Jiangsu People’s Hospital, Yangzhou 225000, Jiangsu Province, China

Received:2020-02-12 Revised:2020-02-22 Accepted:2020-04-03 Online:2021-03-08 Published:2020-12-08
Contact: Yang Jiandong, Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Spine Surgery, Northern Jiangsu People’s Hospital, Yangzhou 225000, Jiangsu Province, China
About author:Zhu Xuefen, Rugao People’s Hospital, Rugao 226500, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81071466; the Science and Education Leading Talents Program for Invigorating Health of Yangzhou during 13th Five-Year Plan Period, No. [2018]6; the Science and Technology Program of Nantong City, No. GJZ16044; the Science and Technology Program of Rugao City, No. SRG(15)3015

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
FM4-64：FM4-64以其亲脂尾部插入脂膜外叶，给予高K+刺激触发递质释放后部分FM4-64可随突触囊泡的内吞作用成为突触囊泡膜的一部分并进入神经末梢，此时FM4-64的荧光强度显著增强，残留在膜外叶的FM4-64以及游离于缓冲液中的FM4-64荧光极弱。因此，胞内的FM4-64荧光强度就可在一定程度上定量地反映高钾离子激发下神经元轴突囊泡胞吞程度，再次给予高K+刺激，FM4-64可随囊泡的胞吐与递质释放到突触间隙，荧光强度明显减弱。根据FM4-64荧光强度的变化可反映神经元突触囊泡活性。
Wnt信号通路：主要由3种分支通路组成，分别为Wnt/β-Catenin通路、Wnt/Ca2+通路、Wnt/PCP通路，其中最为重要的是Wnt/β-Catenin通路。该通路信号的接收和转导的受体主要由Frizzled基因家族和低密度脂蛋白受体相关的蛋白家族组成。研究发现Wnt基因的编码产物(Wnt-1、Wnt-2、1 Wnt-3、Wnt-3a、Wnt-5a)与上述受体结合后，激活靶细胞内含有PDZ 结构域的蛋白Dsh，Dsh可抑制β-catenin的降解，促进β-catenin在胞浆中稳定积累，β-catenin进入细胞核内激活LEF/TCF转录因子，上调cyclin D1等基因蛋白表达量，进而调控细胞生长、分化。

背景：胶质细胞神经营养因子在诱导骨髓间充质干细胞体外定向分化及促进神经元轴突再生过程中起到重要作用。
目的：观察过表达胶质细胞神经营养因子基因诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化情况，检测分化后细胞突触功能及Wnt信号通路组分表达，初步探索骨髓间充质干细胞向成熟神经元分化机制。
方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，分为重组腺病毒载胶质细胞神经营养因子基因转染组(Ad-GDNF-BMSCs)、腺病毒转染对照组(Ad-BMSCs)及未转染对照组。Q-PCR检测各组骨髓间充质干细胞中胶质细胞神经营养因子基因相对表达量，免疫荧光技术检测各组细胞中β-catenin、cyclin D1、NeuN及MAP-2表达。高K+刺激诱导分化后细胞去极化反应，FM4-64标记分化后细胞突触囊泡活动。
结果与结论：①腺病毒载目的基因转染对骨髓间充质干细胞增殖无显著负面影响，转染后可有效促进骨髓间充质干细胞持续、高水平表达内源性胶质细胞神经营养因子基因；②在胶质细胞神经营养因子基因诱导作用下体外培养3 d，骨髓间充质干细胞可表达神经元特异性蛋白NeuN，且在细胞胞质中检测到β-catenin蛋白表达；体外培养7 d后，骨髓间充质干细胞表达成熟神经元标记蛋白MAP-2，细胞胞体皱缩明显，胞体周围出现神经元轴突样结构，并在细胞胞质中检测到β-catenin、胞核中检测到cyclin D1表达，而Ad-BMSCs组及未转染对照组未见NeuN、MAP-2、β-catenin、cyclin D1表达且细胞仍维持梭形形态；③体外培养11 d后，Ad-GDNF-BMSCs组细胞呈现典型的神经元突起或轴突并相互连接成网状结构，可被FM4-64标记显示红色荧光，给予高K+刺激诱发细胞产生动作电位后轴突发生突触囊泡活动，可见FM4-64红色荧光逐渐衰减，同条件下Ad-BMSCs转染组及未转染组细胞未见FM4-64荧光标记的突触囊泡活动；④结果表明，胶质细胞神经营养因子持续诱导作用可促进骨髓间充质干细胞分化为具备突触循环功能的成熟神经元，该作用可能是通过经典的Wnt/β-catenin信号通路进行的。
https://orcid.org/0000-0002-7433-0999(朱雪芬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 神经元, 因子, 突触, 轴突, 通路

Abstract: BACKGROUND: Glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) plays an important role in inducing the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in vitro and promoting the regeneration of neuron axons.
OBJECTIVE: To observe BMSCs differentiation induced by over-expression of GDNF gene, detect synaptic function of cells and expression of Wnt signaling pathway components after differentiation, and preliminarily explore the mechanism of BMSCs differentiation into mature neurons.
METHODS: Rat BMSCs were isolated and cultured, and further divided into recombinant adenovirus-containing GDNF gene transfection group (Ad-GDNF-BMSCs), adenovirus transfection control group (Ad-BMSCs), and untransfected control group. The relative expression of GDNF gene in BMSCs of each group was detected by Q-PCR, and the expression of β-catenin, cyclin D1, NeuN and MAP-2 was detected by immunofluorescence technology in each group. High K+ stimulation induced cell depolarization response after differentiation, and FM4-64 marks synaptic vesicle activity of differentiated cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The adenovirus-transfected gene had no significant negative effect on the proliferation of BMSCs. BMSCs could express endogenous GDNF gene continuously and at high levels. (2) Under the induction of GDNF gene, BMSCs could express neuron-specific protein NeuN after 3 days cultivation in vitro. The expression of β-catenin protein also could be detected in the cytoplasm of cells. After 7 days cultivation in vitro culture, BMSCs expressed the mature neuronal marker protein MAP-2, and the cell body contracted significantly. Neuron axon-like structures appeared around the cell body. Moreover, β-catenin and cyclin D1 were respectively detected in the cell cytoplasm and the nucleus, while the expression levels of NeuN, MAP-2, β-catenin, and cyclin D1 were not observed in Ad-BMSCs and untransfected control groups, and the cells remained spindle-shaped. (3) After 11 days of in vitro culture, the cells in the Ad-GDNF-BMSCs group showed typical neuronal processes or axons and connected to each other into a network structure, which could be labeled with FM4-64 to show red fluorescence, and induced by high K+ stimulation to induce action potentials in the cells. Synaptic vesicle activity in posterior axons showed FM4-64 red fluorescence gradually decaying. Under the same conditions, cells in the Ad-GDNF-BMSCs group and untransfected control group did not present FM4-64 fluorescently labeled synaptic vesicle activity. (4) Continuous GDNF induction can promote BMSCs differentiated into mature neurons with synaptic cycle function, and may be carried out through the classic Wnt/β-catenin signaling pathway.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, neurons, factors, synapses, axons, pathways

中图分类号:

朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.

Zhu Xuefen, Huang Cheng, Ding Jian, Dai Yongping, Liu Yuanbing, Le Lixiang, Wang Liangliang, Yang Jiandong. Mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells differentiation into functional neurons induced by glial cell line derived neurotrophic factor[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(7): 1019-1025.

图/表（结果） 7

2.1 骨髓间充质干细胞的形态变化大鼠骨髓冲洗液培养
48 h后出现群聚样贴壁生长细胞，通过连续半换液可逐步去除悬浮杂质细胞，持续体外培养条件下群聚贴壁生长细胞逐渐增多，至第3代贴壁生长细胞融合成片，以梭形或扁平样形态为主，见图1。

2.2 骨髓间充质干细胞分子表型鉴定结果流式细胞技术鉴定结果显示第3代贴壁生长细胞高表达CD29、CD90(99.6%，99.8%)，低表达CD34、CD11b(1.5%，1.4%)，见图2。

2.3 荧光定量PCR检测各组细胞中GDNF基因相对表达量 Ad-GDNF-BMSCs转染组在转染24 h后可见GDNF基因表达，随培养时间延长，GDNF基因表达量显著提高，并可持续至转染后11 d，其中转染7 d后Ad-GDNF-BMSCs转染组细胞GDNF表达量较对照组提高近5倍，与Ad-BMSCs转染组及未转染对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，而Ad-BMSCs转染组与未转染对照组在各检测时间点GDNF基因相对表达量无明显增高，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.4 各组骨髓间充质干细胞增殖活力 MTT检测结果表明Ad-GDNF-BMSCs转染组细胞增殖活力显著高于Ad-BMSCs转染组及未转染对照组(P < 0.05)，而Ad-BMSCs转染组与未转染对照组细胞增殖活力未见明显差异(P > 0.05)，见图4。

2.5 体外培养3 d骨髓间充质干细胞表达神经元特异性蛋白及Wnt信号通路组分蛋白免疫荧光检测结果表明Ad-GDNF- BMSCs转染组骨髓间充质干细胞体外培养3 d后可见神经元核蛋白NeuN及Wnt信号通路中β-catenin表达，但未见cyclin D1表达，该组内细胞胞体收缩，胞体周围可见神经元突触样结构，而Ad-BMSCs转染组及未转染组未见NeuN及β-catenin表达，见图5。

2.6 体外培养7 d骨髓间充质干细胞表达神经元特异性蛋白及Wnt信号通路组分蛋白免疫荧光检测结果表明Ad-GDNF- BMSCs转染组骨髓间充质干细胞体外培养7 d后可见成熟神经元标记蛋白MAP-2。经典Wnt信号通路激活后通路胞内信号转导蛋白β-catenin显著增加，而cyclin D1作为核内信号转导蛋白表达量亦明显增加，Ad-GDNF-BMSCs转染组细胞胞体皱缩明显，胞体周围可见神经元典型单级或双极轴突样结构。Ad-BMSCs转染组及未转染组未见MAP-2、β-catenin及cyclin D1表达，见图6。

2.7 FM4-64标记突触囊泡循环荧光显微镜观察Ad-GDNF-GFP转染组有神经细胞典型的双极或多极轴突样结构，且各细胞轴突样结构相互连接成网，给予K+刺激细胞后FM4-64标记显影的红色荧光多位于胞体近突起端、轴突及轴突连接处，呈致密点状分布，说明高钾刺激产生动作电位后发生胞吞作用；再次给予高钾激发后细胞发生胞吐作用5 min，同一视野下FM4-64标记的荧光强度显著衰减。Ad-BMSCs转染组及未转染组细胞仍维持梭形或扁平样形态，在高K+刺激条件下未见FM4-64标记红色荧光，见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学观察实验。
1.2 时间及地点实验于2019年1至11月在扬州大学医学院及苏北人民医院实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8周龄SD大鼠4只用于骨髓间充质干细胞原代细胞培养，雌雄不限，体质量100-150 g，由扬州大学比较医学中心实验动物中心提供，许可证号为SCXK (苏)2012-0004。
1.3.2 实验试剂 DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(加拿大WISENT公司)；CD34、CD29、CD11b、CD90(美国Abcam公司)；兔抗鼠NeuN、MAP-2抗体(美国Abcam公司)；兔抗鼠β-catenin、cyclin D1抗体(美国Abcam公司)；Cy3 Conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)(中国达文生物公司)；RNeasy mini kitt试剂盒、First Strand cDNA kit试剂盒(美国Sigma公司)；苯乙烯细胞膜染料FM4-64(美国Biotium公司)；HBSS缓冲液(中国碧云天生物公司)。
1.3.3 实验仪器恒温CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司)；酶标仪(美国BD公司)；倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定依据课题组前期实验方法从SD大鼠股骨骨髓中分离、提取骨髓冲洗液[6]，通过连续半换液法去除悬浮细胞、杂质，取第3代贴壁生长细胞，加入含EDTA的0.25%胰酶消化，4 ℃条件下1 000 r/min离心5 min，PBS清洗细胞2次后转入流式管，各管依次加入单克隆抗体CD34、CD29、CD11b、CD90，避光冰上孵育45 min，PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次，500 μL PBS(含1%BSA)重悬细胞，流式细胞仪检测分析。

1.4.2 荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞中GDNF基因相对表达量取第3代骨髓间充质干细胞，以1×105/孔细胞密度接种于6孔板，随机分为Ad-GDNF-GFP转染组、Ad-GFP转染组及未转染对照组。以感染复数为100，Ad-GDNF-GFP和Ad-GFP转染2 h，加入1 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液终止转染，空白对照组只加入1 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，于37 ℃体积分数5%CO2培养箱培养。培养1，3，5，7，9，11 d，依据RNeasy mini kit试剂盒提取各组细胞总RNA，采用First Strand cDNA kit试剂盒方法进行反转录为cDNA，以GAPDH为内参，进一步以Sybr-Green 法行实时荧光定量PCR扩增，对比检测各组细胞GDNF mRNA的表达。PCR 扩增条件：95 ℃
预变性10 min，95 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s。共45 次循环，PCR各引物序列(上海汉恒生物技术有限公司合成)见表1，ΔΔCt 法行PCR产物相对定量分析，重复实验5次，并以柱形图表示统计学分析结果。

1.4.3 MTT检测骨髓间充质干细胞增殖活性将第3代骨髓间充质干细胞以1×104/孔密度接种于12块96孔板，随机分为3组，每组10个复孔，按上述方法转染各组细胞，未转染组加入等体积培养液，同条件下在培养1，3，5，7 d时每组取出1块96孔板，避光下加入20 μL MTT，恒温箱中孵育4 h后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min，
酶标仪检测各孔吸光度值，重复3次实验，收集数据并进行统计学分析。
1.4.4 免疫荧光检测NeuN、MAP-2、β-catenin及cyclin D1表达将第3代骨髓间充质干细胞以2×104/孔密度接种于预先置有细胞爬片的24孔板中，实验分组及转染、培养方法同前。各组细胞体外培养3 d时取出细胞爬片，PBS洗涤2次，
40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，1 g/L Triton X-100作用15 min，PBS洗涤3次，山羊封闭血清室温孵育30 min，
PBS冲洗细胞爬片，分别加入兔抗鼠NeuN、β-catenin及cyclin D1一抗，避光湿盒中4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，分别加入生物素标记羊抗兔红色荧光二抗及绿色荧光二抗(1∶250， DW-A0516)工作液室温孵育2 h，PBS洗涤3次，加入DAPI染色10 min，封固、倒置荧光显微镜观察各组细胞NeuN、β-catenin及cyclin D1的表达。各组细胞体外培养7 d时采用相同方法检测MAP-2、β-catenin及cyclin D1的表达。
1.4.5 FM4-64检测分化后细胞突触活性将第3代骨髓间充质干细胞以1×104/孔密度接种于预先置有细胞爬片的24孔板中，实验分组及转染、培养方法同前，参考XIONG等[7]、TAKEDA等[8]实验染色方法，以HBSS缓冲液1∶1 000稀释 FM4-64制备染色工作液备用。体外培养11 d后取出各组细胞爬片，HBSS缓冲液冲洗细胞爬片2次，加入10 µL FM4-64染色工作液及含高钾离子(100 mmol/L KCl)的HBSS缓冲液诱发细胞发生动作电位，置于37 ℃恒温箱中孵育3 min后更换HBSS缓冲液(含3.5 mmol/L KCl)漂洗3次，荧光显微镜观察各组细胞FM4-64红色荧光表达情况，然后再次加入含高钾离子(100 mmol/L KCl)HBSS缓冲液诱导动作电位，荧光显微镜追踪观察分化后细胞突触胞吐作用情况下FM4-64红色荧光强度变化(同一视野每1 min摄片)。
1.5 主要观察指标 ①荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞内GDNF基因相对表达量变化；②过表达GDNF诱导作用下骨髓间充质干细胞体外分化情况；③骨髓间充质干细胞分化不同阶段Wnt信号通路组分表达变化；④骨髓间充质干细胞体外分化后轴突突触囊泡运输功能。
1.6 统计学分析计量数据采用x±s表示，以SPSS 17.0统计软件进行分析，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间比较采用独立样本t 检验；检验水准以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞作为一种成体干细胞由FRIEDENSTEIN等[9]首次提出，其来源广泛可从不同的成体组织中如骨髓、脂肪组织、羊水、羊膜、脐带或胎盘分离提取[10-11]，体外易于纯化、扩增且具备高分化潜能特点[12-13]，此外骨髓间充质干细胞可自体移植，无免疫原性且不受伦理学限制，近年来成为神经组织再生修复领域的研究热点。该实验获取大鼠骨髓冲洗液后进行接种培养，通过连续半换液方法逐渐分离悬浮杂质细胞并获取梭形或扁平样形态贴壁生长细胞，以流式细胞仪鉴定分子表型结果表明该方法可获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞。
研究发现神经营养因子诱导间充质干细胞分化以及分化后细胞移植治疗脊髓损伤有着良好的应用前景[14-15]。近年来国内外学者多以质粒、脂质体及重组病毒为载体采用基因修饰方法将神经营养基因导入靶细胞以实现其持续、稳定的诱导分化作用。NOORI-ZADEH等[16]在研究中以质粒为载体，将GDNF基因导入骨髓间充质干细胞，但转染48 h后有效转染率仅8%；DARABI等[17]研究发现脂质体可促进骨髓间充质干细胞持续、稳定过表达GDNF基因，但PCR结果显示GDNF基因表达量较对照组仅增加2倍，且过表达GDNF基因对骨髓间充质干细胞的存活及诱导分化作用尚缺乏进一步研究。该实验研究以载GDNF基因重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞，Q-PCR结果表明Ad-GDNF-BMSCs转染组GDNF基因相对表达量显著提高，转染7 d后该组细胞GDNF相对表达量较对照组提高近5倍，且GDNF基因增强表达可维持至转染后11 d，与质粒、脂质体载体相比较，腺病毒对靶细胞有更高转染效率，转染后靶细胞中目的基因的表达量显著提高且维持较长时间。已有研究证实腺病毒作为介导基因转移和表达的重要工具，高效率感染后目的基因在靶细胞胞质内复制表达，但不进入靶细胞核，并不影响靶细胞染色体正常基因程序性表达[18-19]。该实验通过MTT检测结果表明Ad-BMSCs转染组与未转染组细胞增殖活力无明显差异，而Ad-GDNF-BMSCs转染组GDNF表达量显著提高，细胞增殖活力显著高于Ad-BMSCs转染组与未转染组。
GDNF是近年来发现的一种神经营养因子，广泛分布于脊髓，是轴突再生的一种重要神经营养因子，对中枢神经系统退行性疾病、脊髓损伤后神经功能恢复以及诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化起到重要作用[20-22]。该实验Ad-GDNF-BMSCs转染组GDNF相对表达量显著提高，免疫荧光结果表明在无外源性诱导剂作用下，培养3 d后检测到神经元特异性标记蛋白NeuN表达，该组内细胞胞体收缩，胞体周围可见神经元突触样结构，而Ad-BMSCs转染组及未转染组GDNF相对表达量无明显增高，未见NeuN表达。体外培养7 d后Ad-GDNF-BMSCs转染组细胞表达成熟神经元标记蛋白MAP-2，该组内细胞胞体皱缩明显，胞体周围可见神经元典型单级或双极轴突样结构，而Ad-BMSCs转染组及未转染组细胞未见MAP-2表达。免疫荧光结果表明在无外源性诱导剂情况下过表达GDNF基因的骨髓间充质干细胞可自行向成熟神经元分化并实现满意的分化效率。已有研究证实MAP-2是成熟神经元的标志蛋白之一，广泛存在于胞浆和轴突，不仅为细胞的结构完整与功能正常运行提供重要保障，并且可以在一定程度上反映轴突活性[23]。实验结果表明在GDNF基因持续高表达作用下骨髓间充质干细胞分化过程中表达MAP-2的同时细胞胞体逐渐皱缩并产生神经元轴突样结构，具备了成熟神经元的结构特点及功能性蛋白组成基础。
Wnt信号通路可通过复杂的信号传导通路控制胚胎早期的发育，决定细胞分化、增殖及生长的调节。Wnts是由Wnt 基因编码的一类分泌型糖蛋白，为Wnt/β-catenin信号通路中的配体蛋白分子，通过自分泌或旁分泌与位于细胞膜上的受体相结合，最终激活细胞内相关靶基因表达[24-25]。Wnts 在细胞内的通路分为经典的Wnt/β-catenin信号通路、非经典通路包括Wnt/PCP通路、Wnt/Ca2+、Wnt/c-Jun和Wnt/Rho通路。经典的Wnt/β-catenin 信号传导通路是一条相对保守的信号通路，该信号通路激活后可引起胞质内未被磷酸化的游离β-catenin大量积聚、转位进入核内与LEF/TCF 转录因子形成异二聚体调控核内靶基因(c-myc、cyclin D1)表达，调控间充质干细胞向神经元分化[26-28]。GUO等[29]报道红景天苷通过激活Wnt/β-catenin 信号通路进而促使骨髓间充质干细胞表达神经元特异性蛋白并维持其分化状态，亦有研究采用Dkk-1特异性阻断Wnt/β-catenin信号通路后神经干细胞向神经元分化受到明显抑制[30]，可见Wnt信号通路与间充质干细胞向神经元分化密切相关。尽管如此，国内外研究鲜有报道GDNF诱导骨髓间充质干细胞分化为功能性神经元后Wnt信号通路组分蛋白表达情况。该实验结果发现，在GDNF诱导骨髓间充质干细胞表达神经元特性蛋白NeuN时仅在胞内检测到β-catenin蛋白表达，而骨髓间充质干细胞表达成熟神经元轴突标记蛋白MAP-2时免疫荧光检测Wnt信号通路中重要组分β-catenin与cyclin D1蛋白可在胞质及胞核实现共表达。结合FM4-64检测结果，可认为Wnt信号通路与GDNF诱导下骨髓间充质干细胞向功能性成熟神经元分化存在一定相关性。然而，骨髓间充质干细胞分化机制复杂，该实验仅初步发现Wnt/β-catenin信号传导通路与GDNF作用下骨髓间充质干细胞分化为功能性成熟神经元的相关性，仍需进一步实验证明该信号通路的阻断与激活是否显著影响GDNF对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用。
基于骨髓间充质干细胞的多向分化潜能，近年来不断有研究结果肯定了骨髓间充质干细胞移植治疗脑、脊髓损伤动物的可行性及有效性，并通过免疫荧光技术在脑、脊髓损伤局部发现由间充质干细胞分化而来的神经元及轴突再生迹象，但再生神经元的电生理功能以及再生轴突的突触功能重建目前仍缺乏足够的研究说明[31-33]，更鲜有研究报道GDNF作用下骨髓间充质干细胞分化后神经生理功能变化，然而新生神经元的电生理功能对替代损伤神经元以及重建轴突突触功能性连接具有重要作用，因此研究骨髓间充质干细胞分化后细胞是否为具有功能性成熟神经元特征对骨髓间充质干细胞移植治疗神经系统疾病具有重要意义。苯乙烯类染料(FM4-64、FM1-43等)作为一种活动依赖性的荧光染料可特异性地标记突触囊泡，是观察成熟神经元突触囊泡循环及递质转运功能的重要工具，与细胞膜片钳检测技术相比，在体现神经细胞电生理功能基础上进一步突出反映功能性神经细胞胞体及轴突的突触活性[34-36]。ANKOLEKAR等[37]在研究中发现FM4-64可标记海马锥体神经元胞体及突触前膜，给予高钾离子刺激诱发去极化反应促进突触前膜内吞作用导致FM4-64荧光强度呈指数衰减。DARABI等[38]与DARVISHI等[39]
在研究中证实间充质干细胞在一定条件下可分化为成熟多巴胺能神经元及运动神经元，实验中以苯乙烯类染料标记成熟神经元，在钙离子或高钾离子刺激后FM1-34荧光衰减过程与成熟神经元轴突发生功能性连接、突触递质转运过程密切相关。该研究中GDNF持续诱导骨髓间充质干细胞分化7 d后细胞可表达MAP-2蛋白、胞体明显收缩并出现轴突样结构，诱导11 d后细胞呈现出典型的单级或双极轴突结构，且相互连接成复杂网状，在高钾离子刺激下可被FM4-64染色，且红色荧光标记的突触小泡呈点状分布在分化后细胞突起及轴突连接处，再次给予高钾离子诱发分化后细胞去极化，FM4-64标记的突触小泡因胞吞作用红色荧光逐渐衰减。
Ad-GFP转染组及未转染组细胞因缺乏GDNF诱导分化作用，未见FM4-64红色荧光标记，对高钾离子刺激后无变化。结果说明在GDNF持续诱导作用下骨髓间充质干细胞分化后细胞呈现典型的单级或双极轴突样结构并表达轴突功能性蛋白，在对高钾离子刺激后神经样细胞胞体突起、轴突可发生去极化反应且展现轴突囊泡运输活性，一定程度上反映了骨髓间充质干细胞分化后神经样细胞为具备囊泡运输功能的成熟神经元。
尽管如此，对于GDNF诱导分化后骨髓间充质干细胞的分化方向、分化后细胞旁分泌功能等检测，如星形胶质细胞分化率、外泌体表达变化情况目前研究较少，而新近研究发现星形胶质细胞及外泌体可在促进脊髓损伤瘢痕形成及动物神经功能恢复过程中起到重要作用[40-41]；因此课题组后续研究中拟通过干预Wnt信号通路胞内及核内信号转导关键分子蛋白进而调控GDNF作用下骨髓间充质干细胞分化方向并检测分化后细胞外泌体组分表达变化，以期为探索GDNF诱导下骨髓间充质干细胞向神经元分化机制及修复脊髓损伤奠定一定的实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制

Mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells differentiation into functional neurons induced by glial cell line derived neurotrophic factor

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