2.2  苏木精-伊红染色观察结果  光镜观察可见，正常对照组骨骼肌肌纤维排列规则、整齐，肌间隙均匀一致；模型组和电刺激前大鼠肌纤维排列紊乱、断裂、扭曲，局部肌纤维纤维化、挛缩增粗，肌间隙大小不一；局部肌纤维玻璃样脆性改变。电刺激干预7 d大鼠肌纤维形态及排列较电刺激前有明显改善，局部可见大量新生小血管；电刺激干预15 d可见肌纤维排列有序，但局部结节膨大尚未消失；但明显可见局部微小血管数目减少，管径增粗，趋向于成熟毛细血管。病理变化表明，电刺激能改善局部肌纤维的病理状态，促进局部微小血管形成和成熟，有助于肌筋膜激痛点局部肌纤维修复(图1)。

2.3  免疫组织化学染色观察及微血管密度计数分析  ①CD34在正常骨骼肌纤维几乎不表达，免疫组织化学染色成弱阳性，模型组和电刺激前大鼠CD34也呈现弱表达(图2)；②采用免疫组织化学法标记CD34分子进行微血管密度定量分析表明，干预前(0 d)，模型组和电刺激组微血管密度计数低于正常对照组；干预7，15 d电刺激组微血管密度计数显著高于其他2组(均P < 0.01)；组内比较，电刺激7 d微血管密度计数显著高于电刺激前(P < 0.01)，电刺激15 d显著高于电刺激7 d(P < 0.01)；正常对照组和模型组各时间点间组内比较差异均无显著性意义(均P > 0.05)。上述结果表明，电刺激干预能够上调CD34表达，进而促进血管再生，并在一定时限内表达逐渐增强(图3)。

2.3  免疫组织化学染色观察及微血管密度计数分析  ①CD34在正常骨骼肌纤维几乎不表达，免疫组织化学染色成弱阳性，模型组和电刺激前大鼠CD34也呈现弱表达(图2)；②采用免疫组织化学法标记CD34分子进行微血管密度定量分析表明，干预前(0 d)，模型组和电刺激组微血管密度计数低于正常对照组；干预7，15 d电刺激组微血管密度计数显著高于其他2组(均P < 0.01)；组内比较，电刺激7 d微血管密度计数显著高于电刺激前(P < 0.01)，电刺激15 d显著高于电刺激7 d(P < 0.01)；正常对照组和模型组各时间点间组内比较差异均无显著性意义(均P > 0.05)。上述结果表明，电刺激干预能够上调CD34表达，进而促进血管再生，并在一定时限内表达逐渐增强(图3)。

2.4  各组大鼠血浆中内皮素1和一氧化氮水平检测与分析  根据ELISA实验结果，采用CurveExpert 2.20软件拟合方程 (拟合方法参照POWERS等^[15]提出的技术方法)            

(内皮素1)和            (一氧化氮)分别计算各组大鼠血浆中内皮素1(图4)和一氧化氮水平(图5)并进行统计分析。

2.4  各组大鼠血浆中内皮素1和一氧化氮水平检测与分析  根据ELISA实验结果，采用CurveExpert 2.20软件拟合方程 (拟合方法参照POWERS等^[15]提出的技术方法)            

(内皮素1)和            (一氧化氮)分别计算各组大鼠血浆中内皮素1(图4)和一氧化氮水平(图5)并进行统计分析。

肌筋膜疼痛综合征(myofascial pain syndrome, MPS)，又称肌筋膜痛(myofascial pain，MP)，是一种慢性全身性的疼痛性综合征，临床上以局部肌肉紧张性束带、高度局限且易激惹的扳机点——肌筋膜激痛点(myofascial trigger points, MTrPs)及其他区域的牵涉痛或牵涉性抑制为主要特征^[1-3]。该病发病率高，其在普通人群一生中某个阶段的发病率高达85%，而估计总体流行率约为46%^[4-5]。此外，该病常伴有焦虑、抑郁和睡眠障碍，心理状态反过来又可加重疼痛和功能障碍^[6]。因而肌筋膜疼痛综合征常使患者长期处于亚健康状态或慢性病变状态，是导致患者生活质量显著下降和有效工作时间损失的主要原因之一。研究表明，肌筋膜痛症状产生起因于肌筋膜激痛点，并强调肌筋膜激痛点是了解、诊断和治疗肌筋膜疼痛综合征的关键^[7]。1980年，SIMONS等^[8]提出“能量代谢危机学说”，认为肌筋膜激痛点形成的原因是由于肌肉损伤或微损伤后发生持续性的肌纤维收缩，可导致局部能量消耗和抑制局部血液循环，使ATP供给不足而发病。

      研究表明，电刺激可以促进局部血管生长，改善局部循环^[9-10]。此外，电刺激在临床上治疗肌筋膜疼痛综合征也具有良好的疗效，但其具体机制尚未明确^[11]。课题旨在通过建立肌筋膜激痛点大鼠模型，采用电刺激肌筋膜激痛点局部干预，观察干预后肌筋膜激痛点局部组织形态改变，并检测肌筋膜激痛点局部组织血管内皮标志物CD34及血浆中血管活性物质内皮素和一氧化氮的变化，探讨电刺激干预对肌筋膜激痛点局部组织形态、微血管再生及血流状态的影响，为临床电刺激治疗肌筋膜疼痛综合征提供科学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年3月在南方医科大学完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  健康8周龄雄性SD大鼠54只，体质量(265.5±16.5)g，SPF级，由南方医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(粤)20160041，动物正常饲养，恒温(22.0 ℃)，恒湿(55.0%)，自由饮水、饮食。

1.3.2  实验试剂与仪器  电刺激治疗仪(威海市博华医疗设备有限公司，BHD-2L)；段氏动物实验跑台(上海欣软信息科技有限公司，XR-PT-10A)；自制打击器1台；自制打击器：主要部分是长度为50 cm的木棒，下端为钝头锥形，打击面积为1 cm×1 cm，木棒顶端加有重物，总质量为1 200 g，打击高度为20 cm，动能为2.352 J；全波长多功能读数酶标仪(美国 Thermo，Varioskan LUX)；光学显微镜(日本OLYMPUS，BX-53)；石蜡轮转切片机(德国莱卡Leica， RM2235)；一次性病理刀片(日本Feather羽毛，A35)。

1.4  实验方法

1.4.1  实验动物分组、造模及电刺激干预  将54只健康雄性SD大鼠随机(随机数字表法)分为3组：正常对照组18只；模型组18只；电刺激组(造模+电刺激干预)18只，每组再分为3个时间点测量：分别为干预前(0 d)、干预7 d和干预15 d，每个时间点6只。

模型组和电刺激组两组大鼠参照HUANG等^[12]提出的打击联合离心运动法建立肌筋膜激痛点动物模型，即建模开始前3 d，将大鼠置于动物实验跑台上适应性跑步(参数：坡度0°，跑步机速度16 m/min，时间15 min/次，频次1次/d)；正式建模：建模前用体积分数10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后，将大鼠仰卧位固定于大机器下方，将右侧后肢外展，定位其股内侧肌中上段，剃毛并用记号笔标记，以确保与打击器下落点一致，再将质量为1 200 g的打击器从20 cm高度自由落下，造成股内侧肌打击局部肌肉钝挫伤；打击后次日，将大鼠置于动物实验跑台进行下坡跑训练(参数：坡度-16°，速度16 m/min，频次1次/周，时间50 min/次，共8周)。

待模型组和电刺激组大鼠造模结束后，模型组不给予任何干预，正常饲养。电刺激组大鼠给予电刺激干预，麻醉后的大鼠仰卧位固定于固定板上，并将右侧后肢外展固定，触摸定位肌筋膜激痛点并用记号笔标记，标记部位予以电刺激干预(参数参照PAN等^[13]实验参数调整：直刺2 mm，电压强度6 V，频率20 Hz，脉冲宽度160 ms)，每次干预30 min，1次/d，干预15 d。

1.4.2  采用ELISA法检测大鼠血浆中内皮素1和一氧化氮的水平  造模后于电刺激前，各组大鼠腹腔注射体积分数10%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血4 mL。电刺激后正常组和模型组大鼠正常饲养；待电刺激组大鼠采用电刺激干预7 d和 15 d后，于2个时间点分别麻醉各组大鼠，腹主动脉取血    4 mL。将每次所取血标本加入含有60 μL 10% EDTA和80 μL抑肽酶的无菌离心管中混匀，3 000 r/min离心15 min，分离血浆。取上清液置于-70 ℃冰箱中保存待测。检测内皮素1和一氧化氮时，严格按照各样本ELISA试剂盒说明书中操作步骤实施检测。检测完成后，采用CurveExpert 2.20软件进行标准曲线拟合，绘制标准曲线并确定曲线方程，计算样本各指标水平值进行统计分析。

1.4.3  取材、制片与苏木精-伊红染色  各组大鼠在取血后以脊髓脱臼法处死，解剖分离股内侧肌，在肌筋膜激痛点局部取下1 cm×1 cm×1 cm肌组织块，用生理盐水漂洗两三次，再投入40 g/L的多聚甲醛4 ℃下固定24 h。将固定好的组织常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4 µm厚切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察股内侧肌肌筋膜激痛点局部组织形态及其病理变化。

1.4.4  免疫组织化学染色  将组织切片进行免疫组织化学染色，观察扳机点局部CD34的表达情况。染色步骤：①切片常规脱蜡至水；②滴加体积分数3%H₂O₂灭活内源性过氧化酶10 min，微波炉加热至沸腾后断电，自然冷却至室温；③将切片至于0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液中(pH 7.4)10 min，室温；④滴加5%BSA封固，37 ℃反应30 min；⑤滴加一抗(分别为兔抗大鼠CD34多克隆抗体，浓度200 mg/L，美国abcam公司)，37 ℃反应2 h，PBS(pH 7.4)洗5 min×3次；⑥滴加二抗(美国abcam公司，500 μg，1∶100稀释)，37 ℃ 反应30 min，PBS(pH 7.4)洗5 min×3次；⑦滴加SABC，37 ℃反应30 min，PBS(pH 7.4)洗5 min×4 次；⑧滴加 DAB 试剂，室温下显色，显微镜下控制反应时间15 min；⑨蒸馏水洗涤；⑩苏木精复染，脱水、透明、封固，光学显微镜下观察。

1.5  主要观察指标  ①苏木精-伊红染色大鼠扳机点局部组织形态及病理变化观察；②微血管密度计数(参照PEREIRA等^[14]提出的微血管密度计数方法)分析；③大鼠血浆中内皮素1和一氧化氮水平。

1.6  统计学分析  应用 SPSS 20.0软件进行统计分析，所采集数据均用x(_)±s表示。采用levene法进行方差齐性检验，方差齐性时，同一时间不同组间和同一组不同时间点间各指标比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q法比较，方差不齐时，采用Welch法进行近似方差分析，组间比较采用Dunnett’s T3和Dunnett’s C法比较；P < 0. 05表示差异有显著性意义(α=0.05)。

肌筋膜疼痛综合征是一种以存在一个或多个肌筋膜激痛点为特征的骨骼肌疼痛综合征^[16-17]。研究发现，肌筋膜激痛点局部组织区域内循环灌注不佳，即有缺血情形^[18-20]；局部区域缺氧，出现氧耐量及氧适应降低的病理特点。BENGTSSON等^[21]1986年对57例患者进行了77次活检的同时，对9名正常对照者进行了17次活检，发现“虫蚀”纤维和“破碎的红纤维”在患者的斜方肌明显高于对照组，认为在纤维肌痛压痛点区域出现的肌肉变化也许与肌肉缺氧有关。经实验和临床证实，电刺激治疗能够增加脑外伤后局部缺血病灶局部血流灌注量^[22]、促进血管内皮细胞与内皮祖细胞间的黏附，进而促进血管新生和提高缺血性糖尿病足溃疡性创面缺氧诱导因子1和血管内皮生长因子的表达^[23]，促进缺血性糖尿病足溃疡创面血管新生而促进创面的愈合^[24]。此外，电刺激疗法还具有缓解疼痛、减少肌萎缩、增强肌力及促进神经再生和功能恢复的作用^[25-27]。故该课题选择在肌筋膜激痛点局部实施电刺激干预，探讨干预前后肌筋膜激痛点局部微血管密度变化及血管活性物质量的改变，以及电刺激对肌筋膜激痛点局部组织缺血缺氧性病理改变的影响，为电刺激治疗肌筋膜疼痛综合征提供科学依据。

     CD34是一种高度糖基化的I型跨膜蛋白，属于表面分子延酸黏蛋白家族成员之一，是一种稳定性、敏感性和特异性均较高的成熟血管内皮细胞标记物^[28-29]。研究表明，微血管密度是衡量组织血管形成能力的主要指标^[30]，即微血管计数定量高时，表明组织生成血管能力强。因此，研究中经常使用CD34标记免疫组织化学法测算肿瘤等组织中微血管密度^[30-31]。故此次研究采用CD34免疫组织化学染色作为微血管密度检测指标，检测肌筋膜激痛点局部组织与非肌筋膜激痛点组织微血管密度变化及其肌筋膜激痛点局部组织电刺激干预后微血管密度变化，探讨局部电刺激干预对肌筋膜激痛点局部组织血管再生的影响。实验结果显示，电刺激组干预前，模型组和电刺激组微血管密度计数低于正常对照组(均P < 0.01)，而模型组和电刺激组组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，表明肌筋膜激痛点模型建立后局部组织CD34表达减少，局部微血管密度降低，符合肌筋膜激痛点病理模型特点。电刺激组干预后，电刺激组微血管密度计数水平明显增高，正常对照组和模型组其计数水平无明显变化；同一时间不同组间比较，干预7 d和15 d电刺激组均显著高于正常对照组和模型组(均P < 0.01)，电刺激组组内比较均显著高于前一个时间点(均P < 0.01)；正常对照组和模型组不同时间点组内比较差异均无显著性意义(均P > 0.05)，表明除干预以外的因素对微血管密度计数的影响较小，作为同期对照组符合统计学规律；且电刺激组微血管密度计数水平不断增加。上述结果表明电刺激干预能够上调CD34表达，进而促进血管再生，并在一定时限内表达逐渐增强。即表明电刺激干预能够促进肌筋膜激痛点局部组织微血管形成，从而改善局部血液循环和血流灌注。病理观察可见模型大鼠电刺激干预组肌纤维排列整齐，肌纤维直径较粗，微血管形成增多，表明电刺激干预有助于肌筋膜激痛点局部肌纤维修复，从形态学上证实了这种改善肌筋膜激痛点局部缺血并促进局部组织修复的作用。

内皮素是一种由21个氨基酸组成的活性多肽，主要由血管内皮细胞内所合成，具有强烈的收缩血管作用^[32-33]。内皮素家族主要有3个成员，即内皮素1、内皮素2及内皮素3，分布各异，生理功能不尽相同，内皮素1可以强烈的收缩局部微血管，使局部组织缺血，参加组织损伤过程^[34-35]。反之，组织缺血、缺氧状态诱导了内皮素1的产生^[36-37]。实验结果显示，电刺激组干预前，正常对照组大鼠血浆中内皮素1水平较低，模型组、电刺激组大鼠血浆中内皮素1水平高于正常对照组(均P < 0.01)，而模型组、电刺激组组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，表明肌筋膜激痛点模型建立后局部组织内皮素1表达增加，使局部微血管收缩，符合肌筋膜激痛点缺血缺氧的病理特点。电刺激组干预后，电刺激组内皮素1浓度呈现持续1周后下降趋势，正常对照组和模型组其计数水平无明显变化；干预7 d，模型组、电刺激组大鼠血浆中内皮素1水平高于正常对照组(均P < 0.01)，模型组与电刺激组组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，这与电刺激干预早期微血管再生，其内皮细胞重塑活跃有关，这与RAMMOS等^[38]研究结果一致；干预15 d，电刺激组显著低于模型组(P < 0.01)，组内比较显著低于0 d和7 d(均P < 0.01)；正常对照组和模型组不同时间点组内比较差异均无显著性意义(均P > 0.05)。电刺激组内皮素1浓度干预2周后显著下降，这表明电刺激干预能够下调内皮素1的表达。

一氧化氮是内皮舒张因子之一，一氧化氮可舒张血管调节血管张力， 抑制血小板聚集，抑制嗜中性粒细胞和单核细胞聚集黏附于血管内皮，抑制血管平滑肌细胞增生^[33，39]。因此，一氧化氮具有拮抗内皮素1的作用，在正常生理状态下共同调节血管内皮舒缩平衡，维持正常血管张力和器官血液供应^[40-41]。实验结果显示，电刺激组干预前，正常对照组大鼠血浆中一氧化氮水平较低，模型组、电刺激组大鼠血浆中一氧化氮水平均高于正常对照组(均P < 0.01)，模型组与电刺激组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；这与肌筋膜激痛点病理模型建立后局部损伤组织应激性保护有关^[42]。电刺激组干预后，电刺激组一氧化氮水平呈现持续增加趋势，正常对照组和模型组其计数水平无明显变化；干预7 d和15 d，电刺激组一氧化氮水平均高于模型组和正常对照组(均P < 0.01)，电刺激组不同时间点组内比较均显著高于前一个时间点 (P < 0.01)。上述表明电刺激干预能有效提高肌筋膜激痛点局部组织一氧化氮的表达。

      综上所述，电刺激在肌筋膜激痛点局部干预可促进CD34分子表达，进而促进局部微血管再生；此外，电刺激干预还能够调节肌筋膜激痛点局部组织中血管活性物质内皮素1和一氧化氮的分泌，进而改善局部组织微血管血流灌注状态，从而调节肌筋膜激痛点局部组织血供而改善其缺血缺氧的病理状态，促进肌筋膜激痛点局部病变肌组织的修复。

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文题释义：

内皮素：是一种由21个氨基酸组成的活性多肽，主要由血管内皮细胞所合成，具有强烈的收缩血管作用。内皮素家族主要有3个成员，即内皮素1、内皮素2及内皮素3，分布各异，生理功能不尽相同，内皮素1可以强烈收缩局部微血管，使局部组织缺血，参加组织损伤过程。

CD34：是一种高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，属于表面分子延酸黏蛋白家族成员之一，是一种稳定性、敏感性和特异性均较高的成熟血管内皮细胞标记物。

肌筋膜激痛点是由局部组织存在缺血、缺氧而导致局部组织能量匮乏所致，是肌筋膜疼痛综合征的的主要病理特征。课题选择在肌筋膜激痛点局部实施电刺激干预，探讨干预前后肌筋膜激痛点局部微血管密度变化及血管活性物质量的改变，以及电刺激对肌筋膜激痛点局部组织缺血缺氧性病理改变的影响，为电刺激治疗肌筋膜疼痛综合征提供科学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程