电针刺激脊髓损伤大鼠足阳明胃经脊髓受损节段Bax、Bcl-2的mRNA和蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2764

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (26): 4169-4175.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2764

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电针刺激脊髓损伤大鼠足阳明胃经脊髓受损节段Bax、Bcl-2的mRNA和蛋白的表达

吴凡¹，许权¹，周宾宾²，魏卫兵³，王珠¹，严潮浪¹

¹江西中医药大学附属医院，江西省南昌市 330000；²广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530000；³柳州市中医医院，广西壮族自治区柳州市 545000

收稿日期:2019-09-05 修回日期:2019-09-07 接受日期:2019-10-19 出版日期:2020-09-18 发布日期:2020-09-01
通讯作者: 周宾宾，主任医师，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530000
作者简介:吴凡，男，1991年生，江西省樟树市人，汉族，2016年江西中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事中西结合预防和治疗骨与关节损伤。魏卫兵，男，1989年生，江西省丰城市人，汉族，2019年广西中医药大学毕业，硕士，医师，主要从事颈椎病的诊治与研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81660814)

Electroacupuncture stimulation of Foot-Yangming Stomach Meridian regulates mRNA and protein expression of Bax and Bcl-2 in spinal cord injury rats

Wu Fan¹, Xu Quan¹, Zhou Binbin², Wei Weibing³, Wang Zhu¹, Yan Chaolang¹

¹Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330000, Jiangxi Province, China; ²First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; ³Liuzhou Traditional Chinese Medicine Hospital, Liuzhou 545000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2019-09-05 Revised:2019-09-07 Accepted:2019-10-19 Online:2020-09-18 Published:2020-09-01
Contact: Zhou Binbin, Chief physician, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang
About author:Wu Fan, Master, Attending physician, Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330000, Jiangxi Province, China Wei Weibing, Master, Physician, Liuzhou Traditional Chinese Medicine Hospital, Liuzhou 545000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81660814

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脊髓损伤大鼠模型：用于研究脊髓损伤而制作的大鼠模型，良好的动物模型是实验成功的重要基础，经过不断的研究发展，其造模方法也多种多样，包括钳夹法、打击法、半横切法、完全横切法等，各种方法在稳定性及死亡率方面各有优劣，研究者应当根据自身需求选择合适的造模方式。

细胞凋亡：是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。凋亡是多基因严格控制的过程，当脊髓损伤发生时，Bcl-2家族、caspase家族等开始发生调控作用。

背景：中医自《内经》开始就提出了“治痿独取阳明”之理论，但是有关电针干预足阳明胃经治疗脊髓损伤的报道相对较少，该课题研究从细胞凋亡因子Bax、Bcl-2的角度出发，初步探讨电针干预足阳明胃经对脊髓损伤神经修复的相关机制。

目的：探讨电针刺激足阳明胃经对脊髓损伤大鼠受损节段Bax、Bcl-2表达的影响。

方法：将64只SPF级SD雌性大鼠随机分为4组：对照组、预标记组、损伤后标记组和电针组，每组16只。对照组及预标记组在操作前给予Brdu(5 mg/kg)连续10 d腹腔注射，以标记脊髓内保持分化活力的细胞，对照组于第11天行T₁₀节段椎板切除，预标记组于第11天采用钳夹法造成脊髓损伤缺血模型；损伤后标记组、电针组在制作脊髓损伤模型后连续10 d腹腔注射Brdu(5 mg/kg)标记损伤后活化增殖的细胞，电针组于造模后第3天开始电针干预足阳明胃经足三里、伏兔穴，每周5次。造模后3，10，17，24 d(电针0，7，14，21 d)，每个时间点取4只大鼠，采用BBB评分评估运动功能恢复情况，qRT-PCR和Western blot检测脊髓组织Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白的表达。

结果与结论：①术后3-24 d时，预标记组、损伤后标记组、电针组大鼠神经功能评分低于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，电针组神经功能评分高于预标记组、损伤后标记组，差异均有显著性意义(P < 0.05)；②随着脊髓损伤时间的延长，Bax mRNA及蛋白表达先升高后降低，Bcl-2 mRNA及蛋白表达先降低后升高，Bax/Bcl-2比值随着电针干预时间的推移逐渐减少；③结果表明，电针刺激足阳明胃经可以通过调节Bcl-2、Bax的表达减少神经细胞凋亡，促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。

ORCID: 0000-0001-6069-4997(魏卫兵)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脊髓损伤, 电针干预, 足阳明胃经, Bax, Bcl-2

Abstract:

BACKGROUND: Traditional Chinese medicine has proposed the theory that “treatment for flaccidity aims at Yangming meridian” in the Internal Canon of Medicine. However, relatively few reports focus on electroacupuncture at the Stomach Meridian of Foot-Yangming for the treatment of spinal cord injury. From the perspectives of Bcl-2 and Bcl-2 expression, the mechanism of electroacupuncture intervention at the Stomach Meridian of Foot-Yangming for the treatment of spinal cord injury was preliminarily explored in this study.

OBJECTIVE: To investigate the effect of electroacupuncture on the expression of Bax and Bcl-2 in injured segments of spinal cord injury rats.

METHODS: Sixty-four Sprague-Dawley female rats (SPF level) were randomly divided into four groups: control group, pre-labeling group, post-injury labeling group and electroacupuncture group, with 16 rats in each group. The control group and the pre-labeling group were given intraperitoneal injection of Brdu (5 mg/kg) for 10 continuous days prior to the operation to label the cells that had differentiation ability and vitality in the spinal cord. The control group underwent laminectomy at T₁₀ segment on the 11^th day of labeling, while a model of spinal cord injury was induced by the clamp method in the pre-labeling group. The post-injury labeling group and the electroacupuncture group were injected intraperitoneally with BrdU (5 mg/kg) for 10 continuous days to mark the activated and proliferated cells. In the electroacupuncture group, electroacupuncture stimulation was done at Zusanli and Futu acupoints of Foot-Yangming Stomach Meridian on the 3^rd day after modeling, 5 times a week. Four rats were taken from each group at 3, 10, 17, and 24 days after modeling (0, 7, 14, and 21 days after electroacupuncture stimulation). Basso, Beattie and Bresnahan scores were used to evaluate the motor function, and the expressions of Bax and Bcl-2 protein and gene in the spinal cord were detected using qRT-PCR and western blot.

RESULTS AND CONCLUSION: At 3-24 days after surgery, the neurological scores in the pre-labeling group, post-injury labeling group, and electroacupuncture group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). The neurological scores of the electroacpuncture group were significantly higher than those in the pre-labeling group and post-injury labeling group (P < 0.05). With the prolongation of spinal cord injury time, the mRNA and protein expressions of Bax increased first and then decreased, while the mRNA and protein expression of Bcl-2 decreased first and then increased. The ratio of Bax/Bcl-2 decreased gradually with the lapse of electroacupuncture intervention time. To conclude, electroacupuncture stimulation of the Stomach Meridian of Foot-Yangming can reduce apoptosis of nerve cells, and promote recovery of motor function in spinal cord injury rats by regulating the expression of Bcl-2 and Bax.

Key words: spinal cord injury, electroacupuncture intervention, Stomach Meridian of Foot-Yangming, Bax, Bcl-2

中图分类号:

吴凡, 许权, 周宾宾, 魏卫兵, 王珠, 严潮浪. 电针刺激脊髓损伤大鼠足阳明胃经脊髓受损节段Bax、Bcl-2的mRNA和蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(26): 4169-4175.

Wu Fan, Xu Quan, Zhou Binbin, Wei Weibing, Wang Zhu, Yan Chaolang.

Electroacupuncture stimulation of Foot-Yangming Stomach Meridian regulates mRNA and protein expression of Bax and Bcl-2 in spinal cord injury rats [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(26): 4169-4175.

图/表（结果） 10

1.4.2 实验大鼠造模采用钳夹法造成脊髓损伤缺血模型：①腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)，充分麻醉后行俯卧位，可摸见大鼠背部T₉、T₁₀、T₁₁棘突靠近，同时T₁₀棘突在水平方向，以此即可定位T₁₀脊髓节段，以T₁₀为中心消毒；②碘伏消毒后切开皮肤逐层拨开筋膜及棘间肌，逐渐暴露T₉-T₁₁椎板，小心咬开T₉-T₁₁椎板，并将T₁₀两侧椎弓根完全咬断，清晰地暴露硬脊膜包裹的脊髓；③以微型血管夹夹闭脊髓，保持夹闭状态20 s制作脊髓夹伤模型，造模结束后可见夹伤处有一肉眼可见淤血痕迹即为造模成功标志；④造模成功后，分层缝合肌肉和皮肤。术后给予青霉素腹腔注射，以防感染的发生，减少死亡率。造模方法见图1。

2.2 BBB评分预标记组、损伤后标记组、电针组大鼠术后3-24 d的神经功能评分均低于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，其中损伤后标记组与预标记组仅在10 d和17 d差异有显著性意义(P < 0.05)，其他时间点差异无显著性意义；术后3-24 d，电针组神经功能评分高于预标记组、损伤后标记组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.3 Brdu蛋白阳性表达对照组术后3，10，17，24 d均有少量Brdu蛋白表达，各组间差异不明显；术后3 d预标记组Brdu阳性表达高于对照组，从10 d开始逐渐升高，17 d时到达最高峰，至24 d有所下降，但仍高于对照组，各组间差异有显著性意义(P < 0.05)；术后3 d和10 d时标记组Brdu阳性表达高于预标记组，差异有显著性意义(P < 0.05)，至术后17 d时开始下降，17 d时预标记组表达高于损伤后标记组；术后3 d时电针组稍高于损伤后标记组，从10 d开始逐渐上升，至17 d时又开始下降，24 d降至最低，但同期均高于损伤后标记组、预标记组和对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2及表2。

2.4.1 Bax基因表达随着脊髓损伤时间的延长，Bax mRNA在预标记组和损伤后标记组表达呈现先升高后下降的趋势。与对照组相比，预标记组和损伤后标记组Bax mRNA表达整体升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与预标记组相比，损伤后标记组3 d和10 d时Bax mRNA表达升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与预标记组相比，损伤后标记组17 d和24 d时Bax mRNA表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；与预标记组和损伤后标记组相比，电针组Bax mRNA表达整体明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3，表3。

2.4.2 Bcl-2基因表达 Bcl-2 mRNA表达在预标记组呈现逐渐下降的趋势，与对照组相比明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；Bcl-2 mRNA表达在损伤后标记组呈现先下降后上升的趋势，17 d降至最低，24 d有所回调，与对照组相比，Bcl-2 mRNA表达整体降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。与预标记组相比，损伤后标记组mRNA表达水平降低，但差异无显著性意义。与预标记组和损伤后标记组相比，电针组均有一定程度的升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3，表4。

2.5.1 Bax蛋白表达随着脊髓损伤时间的延长，Bax蛋白在预标记组和损伤后标记组呈现先升高后下降的趋势。与对照组相比，预标记组和损伤后标记组Bax蛋白表达升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；预标记组与损伤后标记组整体差异不明显。与预标记组和损伤后标记组相比，电针组Bax蛋白表达明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表5，图4，5。

2.5.2 Bcl-2蛋白表达 Bcl-2蛋白在预标记组和损伤后标记组呈现逐渐下降的趋势，与对照组相比明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，第24天表达基本稳定，Bcl-2蛋白表达量和第17天相当。预标记组与损伤后标记组整体差异不明显，差异无显著性意义。与预标记组和损伤后标记组相比，电针组均有一定程度的升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表6，图4，图5。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年1至3月在广西医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠64只，体质量180-220 g，由广西医科大学动物实验中心提供，饲养环境：湿度40%-47%，温度20-25 ℃，光照10 h阴暗14 h。

1.3.2 实验试剂和仪器电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；半干转膜仪(日本ATTO公司)；ABI7500荧光定量PCR仪、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、PMSF(碧云天生物技术有限公司)；RIPE蛋白裂解液(索莱宝科技生物有限公司)；Trizol(大连宝生物有限公司)；SYBR Green mix(南京诺维赞生物科技有限公司)；反转录试剂盒(Fermentas公司)；微型血管夹、血管夹夹持器、持针器、缝合针等器械(深圳瑞沃德生命科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验大鼠分组 64只SD大鼠随机分为4组，即对照组、预标记组、损伤后标记组、足阳明胃经电针干预组(以下简称电针组)，每组16只。对照组及预标记组在操作前给予Brdu(5 mg/kg)连续10 d腹腔注射，以标记脊髓内保持分化活力的细胞，对照组于第11天行T₁₀节段椎板切除，预标记组于第11天制作脊髓损伤模型，分别于造模后第3，10，17，24天取材，每个时间点4只大鼠；损伤后标记组、电针组在制作脊髓损伤模型后连续10 d腹腔注射Brdu (5 mg/kg)标记损伤后活化增殖的细胞，电针组用电针干预足阳明胃经足三里、伏兔穴，分别于造模后第3，10，17，24天(即电针第0，7，14，21天)取材，每个时间点4只大鼠。

1.4.3 造模后大鼠的电针干预对照组、预标记组、损伤后标记组大鼠造模后不予任何干预措施，电针组参照《实验针灸学》穴位图谱选取足三里及伏兔穴^[12]，每个穴位各刺入1枚毫针，进针深度为穿皮后再进针约2 mm，刺激强度为12-15 mV(C6805-Ⅰ型电针治疗仪)，刺激频率为2 Hz，波形选择为疏密波，留针时间为30 min，每周5次。电针组造模后3 d开始干预，共治疗3周即在造模后第24天取材完毕。

1.4.4 实验大鼠取材造模后第3，10，17，24天(电针第0，7，14，21天)取材，每个时间点4只大鼠，给予10%水合氯酸过量麻醉后迅速打开胸腔，左心室插管至主动脉，使用足量生理盐水持续灌注，剪开右心房，至右心房流出液清亮后提取脊髓组织，提取损伤部位上下1 cm脊髓组织放置于冻存管，立即置于液氮罐中，随后转移至-80 ℃冰箱予以保存。

1.5 主要观察指标

1.5.1 BBB评分大鼠下肢功能评分(BBB评分)是研究脊髓损伤动物实验广泛采用的评分标准，对于严重脊髓损伤的神经功能研究具有重要的意义^[13]。运用BBB评分评价各组大鼠不同时间段运动功能的变化。

1.5.2 免疫组化检测Brdu蛋白的表达经石蜡制作、脱蜡、水化、清洗、脱水、透明、封固、镜检等过程后检测各组脊髓组织中Brdu蛋白的表达；染色结果根据免疫组化半定量评分标准^[1⁴^]：高倍镜(×400)下随机截取每张图片3个视野，统计每个视野的阳性细胞数量，观察其阳性细胞表达强度。

1.5.3 实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测Bax和Bcl-2 mRNA表达将脊髓组织研磨加裂解液后混合均匀，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，去上清，加入异丙醇混匀后-20 ℃沉淀20 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，去上清，加入等体积乙醇洗涤沉淀，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，去上清，室温干燥，加入20 µL RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度，将RNA反转录成cDNA。Bax引物序列：上游引物：5’-TTC ATC CAG GAT CGA GCA GA-3’；下游引物：5’-TGT TGT TGT CCA GTT CAT CGC-3’；Bcl-2引物序列：上游引物：5’-CTG GTG GAC AAC ATC GCT CT-3’；下游引物：5’-CAT CCC AGC CTC CGT TAT CC-3’；内参基因GAPDH，上游引物：5’-CAC TGA GCA TCT CCC TCA CAA-3’，下游引物：5’-GTA TTC GAG AGA AGG GAG GGC T-3’，采用∆∆Ct法进行Bcl-2及Bax基因表达的相对定量分析。

1.5.4 Western blot检测Bax和Bcl-2 蛋白表达将脊髓组织混合物充分研磨，加入裂解液后4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清置于新的离心管中，加入蛋白缓冲液100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心1 min，备用。根据不同蛋白分子量大小配置不同浓度的胶，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样，电泳：恒压80 V 30 min后恒压120 V 1 h，加入一抗(Bax蛋白抗体稀释比1∶400，Bcl-2蛋白抗体稀释比1∶400)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min；二抗用封闭液稀释各蛋白一抗对应的二抗(1∶3 000)室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，曝光，拍照记录。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，采用t 检验、单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脊髓损伤后长期功能障碍和神经细胞难以再生修复与细胞凋亡有着重要关系^[15]，细胞凋亡也可称程序性细胞死亡，已被确定为脊髓损伤后影响神经元组织损伤发展的关键过程^[16]。先前研究已经确定线粒体自噬途径可以诱导细胞凋亡^[17]，Bcl-2家族成员可通过线粒体途径中的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2介导凋亡信号^[18-20]，包括两类功能相反的基因，一类是抑制细胞凋亡的基因，以Bcl-2为代表，另一类是促进细胞凋亡的基因，以Bax为代表，Bax和Bcl-2表达的比例在一定程度上决定细胞是生存还是凋亡，因此Bax及Bcl-2是决定细胞生存还是凋亡的最具代表性及最重要因子^[21-22]。

在传统医学当中，脊髓损伤古称“体惰”，属“痿病”之范畴。《灵枢·根结》亦云“痿疾者，取之阳明”。足阳明胃经五脏六腑之海也，是为气血化生之源，儒养筋骨，主司关节，由此可知足阳明胃经在痿病治疗当中的重要性。针刺治疗强调平衡气血、调和阴阳，遵循的是补虚泻实原则，故能够成为治疗痿病的主要方法。“足三里”为胃经之合穴，又为胃腑之下合穴，《景岳全书》有言：“灸手足不遂、偏枯等证：曲池、足三里等穴”，“伏兔”足阳明胃经之属穴，主治腰腿痛，配合足三里可治疗下肢痿痹^[23]；故选取“足三里”、“伏兔”作为针刺干预足阳明胃经之代表穴位。目前，公认的细胞凋亡信号通路主要包括内源性线粒体和外源性死亡受体两条途径^[24]，FAN等^[25-26]研究显示电针刺激可以减少氧化应激反应，抑制炎症，减轻水肿，减轻肌肉萎缩和神经纤维化，减少细胞凋亡，促进神经元存活，调节内源性生物介质的表达和活性，通过增加神经再生干细胞治疗脊髓损伤。李长明等^[27]研究显示电针干预对神经细胞修复的机制可能是通过反馈到大脑皮质的损伤信号，改善局部微环境，激活线粒体，恢复神经内外的电位梯度，诱导轴突生长，从而促进Bcl-2的表达，降低Bax的表达，降低凋亡程度。该实验通过评估脊髓损伤大鼠运动功能，免疫组化统计Brdu阳性细胞表达、荧光定量PCR测定Bax、Bcl-2 mRNA表达、Western blot测定Bax、Bcl-2蛋白表达，结果发现脊髓损伤发生时Bax的表达量逐渐升高(预标记组、损伤后标记组和电针组均较对照组升高，差异有显著性意义)，当进行电针干预以后，随着时间推移Bax的表达量逐渐下降，与未经干预的对照组、预标记组及损伤后标记组相比较差异有显著性意义(P < 0.05)；而当脊髓发生时Bcl-2的表达量逐渐下降(与预标记组、损伤后标记组和电针组相比差异有显著性意义)，进行电针干预后Bcl-2的表达量逐渐上升，与未经干预的预标记组及损伤后标记组相比较差异有显著性意义(P < 0.05)，Bax/Bcl-2比值逐渐减少。同时结合Brdu蛋白阳性细胞表达及脊髓损伤大鼠运动神经功能BBB评分，证明电针干预可以增加脊髓神经细胞的数量，在第17天时达到最大值；脊髓损伤大鼠的运动功能评分在不断改善，电针组与对照组、预标记组及损伤后标记组相比差异显著，证明电针干预足阳明胃经可通过上调Bcl-2/Bax比值，逐渐减少细胞凋亡，进而促进脊髓神经的再生修复。

总之，通过大鼠运动功能评分及Bax、Bcl-2的表达来证明电针干预确实可以减少细胞凋亡，促进脊髓神经细胞的修复。但是具体通过何种途径来达到修复的机制尚未研究清楚，是课题后续研究目标。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

电针刺激脊髓损伤大鼠足阳明胃经脊髓受损节段Bax、Bcl-2的mRNA和蛋白的表达

Electroacupuncture stimulation of Foot-Yangming Stomach Meridian regulates mRNA and protein expression of Bax and Bcl-2 in spinal cord injury rats

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