硫酸钡灌注联合micro-CT扫描实现大鼠颈脊髓微血管的三维可视化和量化分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1999

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (36): 5836-5840.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1999

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硫酸钡灌注联合micro-CT扫描实现大鼠颈脊髓微血管的三维可视化和量化分析

刘雅普^1，2，林俊育¹，杨舟¹，吴秀华¹，吴晓亮¹，朱青安¹

¹南方医科大学附属南方医院脊柱外科，广东省广州市 510515；²漯河医学高等专科学校第二附属医院脊柱外科，河南省漯河市 462300

出版日期:2019-12-28 发布日期:2019-12-28
通讯作者: 朱青安，博士，教授，南方医科大学附属南方医院脊柱外科，广东省广州市 510515
作者简介:刘雅普，男，1985年生，河南省禹州市人，汉族，南方医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81472084)，项目负责人：朱青安|国家自然科学基金(81601904)，项目负责人：吴晓亮|漯河市青年拔尖人才项目(2018QNBJRC01004)，项目负责人：刘雅普

Three-dimensional visualization and quantitative analysis of microvessels in rat cervical spinal cord using barium sulfate perfusion combined with micro-CT scanning

Liu Yapu^{1, 2}, Lin Junyu¹, Yang Zhou¹, Wu Xiuhua¹, Wu Xiaoliang¹, Zhu Qing’an¹

¹Department of Spinal Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China;²Department of Spinal Surgery, Second Affiliated Hospital of Luohe Medical College, Luohe 462300, Henan Province, China

Online:2019-12-28 Published:2019-12-28
Contact: Zhu Qing’an, MD, Professor, Department of Spinal Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Liu Yapu, MD, Attending physician, Department of Spinal Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; Department of Spinal Surgery, Second Affiliated Hospital of Luohe Medical College, Luohe 462300, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81472084 (to ZQA)| the National Natural Science Foundation of China, No. 81601904 (to WXL)| the Luohe Youth Talents Fund of China, No. 2018QNBJRC01004 (to LYP)

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

Micro-CT：是一种分辨率极高的CT设备，通过锥形X射线束扫描重建后，可实现样本内部显微结构的清晰显示，分辨率达到微米级，通过软件辅助可细致分析样本内部不同截面的信息。

三维可视化：是描绘和理解模型的一种手段，是数据体的一种表征形式，以大量数据为基础，检查研究对象的连续性，发现并提出异常，为分析、理解及重复数据提供依据。

摘要

背景：血管结构是维持颈脊髓功能的重要基础，为了评估微血管在颈脊髓损伤及治疗过程中的参与程度，首先需要对正常颈脊髓微血管结构进行良好的三维可视化和精确的量化分析，但目前相关研究报道较少。

目的：探讨硫酸钡灌注联合micro-CT扫描对大鼠正常颈脊髓微血管结构的三维可视化和量化分析效果，为后期评估微血管在颈脊髓损伤中的参与程度及衡量治疗效果奠定基础。

方法：实验纳入5只成年雄性SD大鼠，体质量280-320 g，所有动物操作程序均根据国家相关实验动物使用准则施行，并获得南方医科大学动物使用伦理委员会的批准。大鼠深度麻醉后，经心脏穿刺使用温肝素生理盐水、多聚甲醛、硫酸钡灌注剂进行血管灌注，取颈脊髓组织置于micro-CT中进行扫描及三维重建，量化分析血管体积与组织体积比值、血管表面积与组织体积比值、血管数目、血管直径、血管分离度、连接密度、结构模型指数以及不同直径微血管的数量、百分比及体积等指数。

结果与结论：①颈脊髓微血管经三维重建可视化后，颈脊髓内微血管结构清晰可见，可以清晰显示出颈脊髓的前、后动脉以及几级分支动脉；②通过量化分析微血管指数，结果显示，血管体积与组织体积比值为0.022±0.002，血管表面积与组织体积比值为(52.370±6.271) mm^-1、血管数目为(0.604±0.076) mm^-1、血管直径为(0.040±0.005) μm、血管分离度为(1.762±0.255) μm、连接密度为(2.661±0.757) mm^-3、结构模型指数为4.400±0.129，并成功量化了不同直径颈脊髓微血管的数量、百分比及体积等；③结果表明，硫酸钡灌注联合micro-CT扫描可实现对大鼠正常颈脊髓微血管结构良好的三维可视化和精确的量化分析，为后期评估微血管在颈脊髓损伤过程中的参与程度及衡量治疗效果奠定了良好基础。

ORCID: 0000-0001-9954-4785(刘雅普)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 微血管, 颈脊髓, 三维可视化, 量化分析, 大鼠, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Vascular structure is an important basis for maintaining cervical spinal cord function. To evaluate the involvement of microvessels in cervical spinal cord injury and treatment, it is necessary to carry out a good three-dimensional visualization and accurate quantitative analysis of the normal cervical spinal cord microvascular structure, but there are few reports about it.

OBJECTIVE: To investigate the three-dimensional visualization and quantitative analysis of normal cervical spinal cord microvascular structure in rats by barium sulfate perfusion combined with micro-CT scanning, and to lay a foundation for the later evaluation of the involvement degree of microvessels in cervical spinal cord injury and the measurement of therapeutic effect.

METHODS: Five adult male SD rats weighing 280-320 g were included. All animal operation procedures were implemented in accordance with the relevant national guidelines for the use of laboratory animals, and were approved by the Animal Use Ethics Committee of Southern Medical University. After rats were deeply anesthetized, vascularization was performed with warm heparin normal saline, polyformaldehyde and barium sulfate perfusion through cardiac puncture. Cervical spinal cord tissue was taken and placed in micro-CT for scanning and three-dimensional reconstruction. Quantitative analysis of the ratio of microvascular volume to tissue volume, ratio of vascular surface area to tissue volume, number of blood vessels, diameter of blood vessels, separation degree of blood vessels, connectivity density, structural model index and the number, percentage and volume of microvessels with different diameters were quantitatively analyzed.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) After three-dimensional reconstruction and visualization, the microvascular structure in the cervical spinal cord was clearly visible, showing the anterior and posterior arteries of the cervical spinal cord as well as several branch arteries. (2) Quantitative analysis results of microvascular index showed that ratio of microvascular volume to tissue volume was 0.022±0.002; ratio of vascular surface area to tissue volume was (52.370±6.271) mm^-1; number of blood vessels was (0.604±0.076) mm^-1; diameter of blood vessels was (0.040±0.005) μm; separation degree of blood vessels was (1.762±0.255) μm; connectivity density was (2.661±0.757) mm^-3; structural model index was (4.400±0.129). The number, percentage and volume of microvessels in cervical spinal cord with different diameters were quantified successfully. (3) Barium sulfate perfusion combined with micro-CT scanning can achieve three-dimensional visualization and accurate quantitative analysis of normal cervical spinal cord microvascular structure in rats, laying a good foundation for the later evaluation of the involvement of microvessels during cervical spinal cord injury and the measurement of therapeutic effect.

Key words: microvessels, cervical spinal cord, three-dimensional visualization, quantitative analysis, rats, the National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318|R445|R744

刘雅普，林俊育，杨舟，吴秀华，吴晓亮，朱青安. 硫酸钡灌注联合micro-CT扫描实现大鼠颈脊髓微血管的三维可视化和量化分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(36): 5836-5840.

Liu Yapu, Lin Junyu, Yang Zhou, Wu Xiuhua, Wu Xiaoliang, Zhu Qing’an. Three-dimensional visualization and quantitative analysis of microvessels in rat cervical spinal cord using barium sulfate perfusion combined with micro-CT scanning[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(36): 5836-5840.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 三维可视化与量化分析实验。

1.2 时间及地点 于2018年10至12月在南方医科大学南方医院脊柱脊髓损伤研究实验室完成。

1.3 材料 5只成年雄性Sprague-Dawleley大鼠，体质量280-320 g，均购于南方医科大学实验动物中心，许可证号：NFYY-2016-119。所有动物操作程序均根据国家相关实验动物使用准则施行，并获得南方医科大学动物使用伦理委员会的批准。

1.4 方法

1.4.1 灌注剂制备将生理盐水、硫酸钡粉末(Sachtleben公司，德国)、医用明胶(Aladdin公司，中国)按照20∶5∶1混合，置于37 ℃恒温磁力搅拌器(科尔公司，中国)持续搅拌，直到明胶完全溶解且混合液均匀混合，约为2 h。硫酸钡参数对比见表1。

1.4.2 血管灌注采用的灌注材料和方法参考既往相关报道^[10-11]。具体步骤如下：①腹腔注射戊巴比妥钠对大鼠进行深度麻醉，采用胸腹切口立即暴露心脏、肝脏和肠道，将22号钝性穿刺针经心尖插入主动脉；②肝素生理盐水灌注冲洗，直至循环血液被有效清除，血管内流动液体清亮，肝脏表面变为白色；③采用40 g/L多聚甲醛对大鼠进行灌洗固定，直至身体及尾巴的明显硬化；④注射灌注剂混合液, 直到肝小叶和肠壁血管完全呈白色。(所有灌注溶液、肝素化盐水、甲醛和硫酸钡均预热至37 ℃，灌注过程中采用恒压灌注)；⑤然后取出钝性穿刺针，将主动脉结扎，防止灌注液渗漏，将灌注后的大鼠置于在4 ℃过夜；⑥行颈后正中切口，逐层分离，显露颈椎，咬除椎板，切取C₃-C₇节段脊髓组织。取材操作在显微镜下进行，避免损伤脊髓结构。

1.4.3 三维可视化与量化分析将颈脊髓组织置于micro-CT中(μCT 80，Scanco公司，AG，瑞士)，扫描层厚为10 μm，参数设定为55 kV，145 μA，300 ms。脊髓组织扫描后定义围绕脊髓外缘为脊髓轮廓，通过调节灰度阈值联合三维高斯噪声滤波器，将灌注微血管结构与脊髓组织分离，采用距离变换法计算血管直径，将不同直径血管赋以相应伪彩。对相应节段颈脊髓微血管进行量化分析，分析指标包括：血管体积与组织体积比值、血管表面积与组织体积比值、血管数目、血管直径、血管分离度、连接密度、结构模型指数以及不同直径微血管的数量、百分比及体积。

1.5 主要观察指标 利用硫酸钡灌注联合micro-CT扫描对正常大鼠颈脊髓微血管进行三维可视化和量化分析。

讨论

保持完整的微血管结构是维持颈脊髓正常功能的重要基础的关键基础，在急性脊髓损伤后，脊髓组织切片染色表现为损伤区域的基本结构残存，而微血管系统出现中断、移位、扭曲^[12]，组织学切片染色是检测脊髓微血管变化的重要方法，但存在显著的不足：组织冰冻切片及染色过程通常耗时较多^[13]；该方法破坏了脊髓标本的三维结构完整性，只能提供血管系统的二维图像，无法实现脊柱微血管网络的三维成像和精确定量分析^[6，10]。目前脊髓微血管的三维可视化已成为一个极具吸引力的研究领域^[4]。在成像研究中，造影剂灌注通常用于显示血管网的形态结构^[2，14]。用于micro-CT成像的血管造影剂必须具有较低的黏度，并具有较高分子质量，以便能够将填充对比剂的微血管与周围的软组织区分开^[11，15-16]。许多材料可用做对比剂，例如碘、液态油脂、树脂、金纳米颗粒和3种最常用的铅氧化物、硫酸钡和microfil^[17-20]。此次研究通过硫酸钡灌注联合micro-CT扫描，实现了对大鼠正常颈脊髓微血管结构良好的三维可视化和精确的量化分析研究。

国内学者报道了采用氧化铅灌注联合micro-CT扫描检测大鼠颈脊髓慢性压迫模型中颈椎的血管变化情况^[6，21]，灌注后通过micro-CT扫描重建了椎动脉及脊髓前动脉，但脊髓内部的微血管灌注效果相对较差，血管结构不连续，大量的颈脊髓微血管无法显示，这种方法对脊髓内部微血管结构的研究价值相对较小，同时氧化铅具有一定的毒性，对研究人员和环境具有潜在的危害，实验操作过程中需进行特殊防护，操作后的废液等需进行专业处理，以防止发生铅污染和中毒事件发生。

在此次研究中，采用硫酸钡灌注后大鼠颈脊髓微血管的三维结构清晰，血管网各分支连续性良好，而且硫酸钡是一种无毒的造影剂，不会对研究人员及环境造成潜在危害，相较于氧化铅，硫酸钡更加适合用于微血管的灌注研究。Kingston等^[11]对比了硫酸钡和氧化铅灌注后的大鼠的下肢血管成像效果，研究显示硫酸钡与氧化铅灌注在血管分支代数上无显著性差异，而他们采用最薄扫描层厚为59 μm，无法满足微血管三维重建的要求，大量的微血管结构无法显示，同时该研究未对微血管结构进行准确的量化分析，无法监测微血管的分布情况。在此次研究中，不仅将大鼠颈脊髓的血管网结构实现三维可视化，同时将微血管结构通过血管体积与组织体积比值、血管表面积与组织体积比值、血管数目、血管直径、血管分离度、连接密度、结构模型指数，并采用距离变换法计算出脊髓微血管的直径，将不同直径的血管赋以相应伪彩，进一步对不同直径微血管的数量、百分比及体积等参数指标对颈脊髓微血管进行了精准的量化分析，发现直径为40 μm的微血管数量、百分比及体积等最高，此次研究为后期评估微血管在颈脊髓损伤过程中的参与程度及衡量治疗策略的效果提供了较好的参考。

Microfil是一种含硅的铬酸铅材料，能很好地灌注进入组织中，目前大多数研究均采用microfil灌注用于成像微血管结构^[18，22-25]。采用microfil灌注后，脊髓血管连续性良好，微血管结构相对清晰，对脊髓微血管研究具有较高的应用价值，但microfil价格相对昂贵，特别是在大量用于大鼠或其他大型动物实验时, 研究成本将大幅增加，此次研究中所采用的血管灌注剂硫酸钡的价格低廉，可大量应用于大鼠或其他大型动物实验中；microfil灌注后成像的最小血管约为 8 μm，而此次研究中硫酸钡灌注后重建获得的最小血管直径与microfil的灌注效果相当，而价格更为低廉，此前也有报道认为硫酸钡灌注是血管三维成像的更佳选择^[2⁶^-2⁷^]，Blery等^[2⁸^]采用硫酸钡和氧化铅进行了大量对比测试，硫酸钡已被证明具有更好的灌注效果^[27，29-30]，在此次研究中，参考使用了类似的灌注方法，同时将灌注液温度设定为37 ℃，使灌注液温度接近大鼠的正常体温，以防止灌注过程中因低温引起微血管痉挛，从而影响血管灌注效果和三维重建结果。

此次研究通过硫酸钡灌注联合micro-CT扫描，实现了对大鼠正常颈脊髓微血管结构良好的三维可视化和精确的量化分析研究，为后期评估微血管在颈脊髓损伤过程中的参与程度及衡量治疗策略的效果奠定了实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

硫酸钡灌注联合micro-CT扫描实现大鼠颈脊髓微血管的三维可视化和量化分析

Three-dimensional visualization and quantitative analysis of microvessels in rat cervical spinal cord using barium sulfate perfusion combined with micro-CT scanning

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