自然衰老大鼠不同部位骨组织形态、骨密度及骨代谢指标的变化

doi:10.12307/2021.108

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (26): 4118-4122.doi: 10.12307/2021.108

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自然衰老大鼠不同部位骨组织形态、骨密度及骨代谢指标的变化

游斌，黄秀珠，林煜，黄浠

厦门大学附属福州第二医院，福建省福州市 350007

收稿日期:2020-08-12 修回日期:2020-08-14 接受日期:2020-09-21 出版日期:2021-09-18 发布日期:2021-04-25
通讯作者: 游斌，厦门大学附属福州第二医院，福建省福州市 350007
作者简介:游斌，男，1969年生，福建省平潭市人，汉族，1992年福建医学院毕业，副主任医师，主要从事骨肿瘤影像与骨质疏松症方面的研究。

Changes in bone morphology, bone mineral density and bone metabolism in different parts of natural aging rats

You Bin, Huang Xiuzhu, Lin Yu, Huang Xi

Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University, Fuzhou 350007, Fujian Province, China

Received:2020-08-12 Revised:2020-08-14 Accepted:2020-09-21 Online:2021-09-18 Published:2021-04-25
Contact: You Bin, Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University, Fuzhou 350007, Fujian Province, China
About author:You Bin, Associate chief physician, Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University, Fuzhou 350007, Fujian Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
自然衰老：又称为内源性衰老或固有性衰老，是由于生物体内在因素引起的身体内各组织器官的衰老。
骨代谢：骨的功能是为肌肉收缩提供附着处及保护内脏等重要的生命器官。一般认为骨在细胞水平上是不活跃的，事实上骨细胞在不停地进行着细胞代谢，不仅骨细胞之间会相互作用，还存在骨髓中的红细胞生成细胞和基质细胞相互作用，以进行骨的改建和重建。

背景：大鼠是四足啮齿动物，其骨骼负重方面与直立行走的人类并不相同，且大鼠最大寿限内出现骨稳态破坏的时程变化与人也是不一致的。
目的：分析不同大鼠自然衰老过程中骨代谢的变化。
方法：将SD大鼠分为雌性组与雄性组，各40只。其中雌性组随机分为雌性7，10，15，20月龄组，各10只；雄性组随机分为雄性7，10，15，20月龄组，各10只。实验于2016年6月经厦门大学附属福州第二医院动物实验伦理委员会批准，批准号20160012。
结果与结论：①雌性及雄性SD大鼠在7-10月龄时腰椎、股骨头及胫骨上段骨小梁排列规则，形成均匀致密网状；雌性SD大鼠在15-20月龄骨小梁纤细，间距增宽，排列散乱稀疏，可见多处中断；雄性SD大鼠在15月龄骨小梁稍细小，间距增宽，排列仍较整齐，20月龄骨小梁出现部分中断。②雌性及雄性SD大鼠各部位骨小梁面积百分比在10月龄起随月龄增加而下降，在20月龄达到最低值。骨密度结果也呈现相同趋势。③雌性及雄性SD大鼠骨碱性磷酸酶水平随着月龄增加逐渐降低。雌性SD大鼠1型胶原羧基末端肽水平随着月龄增加逐渐升高，雄性SD大鼠1型胶原羧基末端肽水平自10月龄起随着月龄增加逐渐降低。④提示SD大鼠骨骼7月龄处于生长平衡，10月龄开始衰退，15月龄衰退加速，20月龄完全衰退；其中雌性SD大鼠在15-20月龄骨代谢处于高转换状态，雄性SD大鼠在15-20月龄骨代谢处于低转换状态。

https://orcid.org/0000-0003-4405-0942 (游斌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: SD大鼠, 性别, 骨质疏松, 衰老, 骨密度, 骨代谢, 组织形态, 骨形成, 骨吸收

Abstract:

BACKGROUND: Rats are a kind of quadruped rodents, with the bone weight being different from that of humans who walk upright, and the time course of bone homeostasis damage within the maximum life span of rats is also inconsistent with that of humans.

OBJECTIVE: To explore the changes inbone metabolism in different rats during natural aging.
METHODS: A total of 80 Sprague-Dawley (SD) rats (male and female half) were randomly assigned into 7-,10-,15-,20-month groups according to their sex (n=10 per group). The study protocol was approved by the Animal Ethics Committee of Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University with an approval No. 20160012 in June 2016.
RESULTS AND CONCLUSION: The bone trabeculae of female and male SD rats at 7 to 10 months of age arranged regularly and formed a uniform dense network.The bone trabeculae of femaleSD rats at 15 to 20 months of age were fine, the spacing was widened, the arrangement was scattered and sparse, and there were many discontinuities.The bone trabeculae of male SD rats at 15 months of age were slightly smaller, the spacing was widened, and the arrangement was still orderly, and the bone trabeculae of male SD rats at 20 months of age were partially interrupted.The percentage of bone trabecular area in all parts of female and male SD rats began to decrease at 10 months of age, and reached the lowest value at 20 months of age.The bone mineral density also showed the same trend.The bone alkaline phosphatase level of female and male SD rats decreased gradually with the increase of month age.The level oftype 1 collagen carboxy terminal peptide in female SD rats increased gradually with the increase of month age, while that of male SD rats began to decrease gradually at 10 months of age with the increase of month age.To conclude, 7, 10, 15, and 20 months old can represent four different stages: bone growth balance, beginning to decline, decline accelerated, and complete decline, respectively.Female SD rats at 15-20 months of agewere in a high-transition state of bone metabolism. Male SD rats at 15-20 months of agewere in a low-transition state.

Key words: Sprague-Dawleyrat, sex, osteoporosis, natural aging, bone mineral density, bone metabolism, histomorphology, bone formation, bone absorption

中图分类号:

游斌, 黄秀珠, 林煜, 黄浠. 自然衰老大鼠不同部位骨组织形态、骨密度及骨代谢指标的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(26): 4118-4122.

You Bin, Huang Xiuzhu, Lin Yu, Huang Xi. Changes in bone morphology, bone mineral density and bone metabolism in different parts of natural aging rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(26): 4118-4122.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验过程中各组大鼠均无脱失，全部进入结果分析。
2.2 不同性别自然衰老大鼠骨形态的变化苏木精-伊红染色结果显示，雌性及雄性大鼠7-10月龄时，腰椎、股骨头及胫骨上段骨小梁排列规则，形成均匀致密网状；其中雌性大鼠15-20月龄时，骨小梁纤细，间距增宽，排列散乱稀疏，可见多处中断；雄性大鼠15月龄时，骨小梁稍细小，间距增宽，排列仍较整齐，20月龄时，骨小梁出现部分中断。大鼠骨丢失以胫骨近端显著，股骨近端次之，腰椎最迟出现，见图1和2。

2.3 不同性别自然衰老大鼠骨小梁面积百分比的变化雌性大鼠第二腰椎骨小梁百分比随着月龄的增加而降低，其中7月龄组骨小梁百分比最高，20月龄组骨小梁百分比最低。雌性大鼠股骨头及胫骨上段骨小梁面积百分比变化趋势与第二腰椎骨相同，见表1。雄性大鼠第二腰椎骨小梁百分比在7-10月龄时随着月龄的增加而增加，10-20月龄时随着月龄的增加而降低，其中10月龄组骨小梁百分比最高，20月龄组骨小梁百分比最低。雄性大鼠股骨头及胫骨上段骨小梁面积百分比变化趋势与第二腰椎骨相同，见表1。

2.4 不同性别自然衰老大鼠骨密度的变化雌性大鼠第一腰椎骨密度在7-10月龄时随着月龄增加而增加，10-20月龄时随着月龄增加而降低，其中10月龄时骨密度最高，20月龄时骨密度最低。雌性大鼠右侧股骨及右侧胫骨的骨密度的变化趋势与第一腰椎相同，见表2。

雄性大鼠第一腰椎骨密度在7-10月龄时随着月龄增加而增高，10-20月龄时随着月龄增加而降低，其中10月龄时骨密度最高，20月龄时骨密度最低。同月龄雄性大鼠第一腰椎骨密度明显高于雌性大鼠(P < 0.05)。雄性大鼠右侧股骨及右侧胫骨的骨密度的变化趋势与第一腰椎，见表2。

2.5 不同性别自然衰老大鼠血清骨碱性磷酸酶的变化 7-20月龄大鼠血清骨碱性磷酸酶水平随着月龄增加而降低。其中在7月龄时血清骨碱性磷酸酶水平最高， 20月龄时血清骨碱性磷酸酶水平最低，见表3。

2.6 不同性别自然衰老大鼠血清1型胶原羧基末端肽的变化雌性大鼠血清1型胶原羧基末端肽水平随着月龄增加而增加，其中7月龄血清1型胶原羧基末端肽水平最低，20月龄血清1型胶原羧基末端肽水平最高。雄性大鼠血清1型胶原羧基末端肽水平在7-10月龄时随着月龄增加而增加，在10-20月龄随着月龄增加而减少，其中10月龄血清1型胶原羧基末端肽水平最高，20月龄血清1型胶原羧基末端肽水平最低。雄性大鼠血清1型胶原羧基末端肽水平高于雌性大鼠，见表3。

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引言

骨质疏松是一种通过骨平衡破坏导致骨代谢障碍的疾病，其主要特征为骨组织微小结构的退化和骨量的降低[1]。过度的骨吸收和/或不充分的骨形成易导致骨脆性增加和骨折[2]。有研究表明，中国骨质疏松总体患病率为6.6%-19.3%，平均约为13%，推测到2050 年中国骨质疏松或骨密度低患者数量将达到2.21亿[3]，由此可见骨质疏松患者基数的庞大。在骨质疏松中，原发性骨质疏松占绝大多数，而原发性骨质疏松又可分为绝经后骨质疏松和老年骨质疏松。其中，绝经后骨质疏松属于高转化型骨质疏松，而老年骨质疏松属于低转换型骨质疏松。
目前绝经后骨质疏松及老年骨质疏松动物模型主要以大鼠为对象。其中对雌性大鼠行双侧卵巢切除是制备绝经后骨质疏松模型的经典方法[4]。由于20个月龄接近SD大鼠的最大寿命，其出现骨量减少和骨强度衰退的迹象，此时与人类老年期表现相似，可作为自然衰老模型。还有研究发现，雌性SD大鼠在15个月龄时，卵巢生殖功能完全散失，此时其表现与人类女性绝经期的表现颇为相似[5]。因此，15个月龄的雌性SD大鼠也可作为绝经后骨质疏松的动物模型。由于大鼠是四足啮齿动物，其骨骼负重方面与直立行走的人类并不相同。因此，在骨质疏松不同分型研究中，需要观察的区域与人发生的疏松部位应是不一致的，且大鼠最大寿限内出现骨稳态破坏的时程变化与人也是不一致的[6-9]。因此此次实验拟以自然衰老大鼠为研究对象，观察股骨近端、胫骨近端以及腰椎骨组织形态学和骨密度的变化以及血液骨形成及骨吸收标志物的变化。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1设计随机对照动物实验。
1.2时间与地点于2017年6月至2019年1月在福建省中医研究院及动物房完成。
1.3材料
1.3.1实验动物 80只SPF级SD大鼠，鼠龄6个月，雌雄各半，其中雌性大鼠体质量为（385±15）g，雄性大鼠体质量为（610±25）g，购自上海西普尔-必凯实验动物公司，许可证号：SCXK(沪)2008-0016，编号：2008001608615。大鼠于福建中医药大学中医药研究院动物房饲养，医学实验动物环境设施为SPF 级，许可证号：SYXK（闽）2014-0001。动物适应性喂养1个月。实验于2016年6月经厦门大学附属福州第二医院动物实验伦理委员会批准，批准号20160012。实验动物均在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2实验使用的主要试剂及仪器乙二胺四乙酸二钠、多聚甲醛购自上海源叶生物；骨碱性磷酸酶、1型胶原羧基末端肽ELISA试剂盒购自R&D公司；苏木精伊红染色试剂盒购自福建生工公司；Discovery Wi 双能X射线骨密度仪购自美国Hologic公司；Motic 6.0光镜图像分析系统购自厦门麦克奥迪公司；Leica DM4000B显微图像采集系统购自德国Leica公司；ELx800全自动酶标仪购自美国BIO-TEK公司。
1.4方法
1.4.1实验动物分组将大鼠分为雌性组与雄性组，各40只。其中雌性组随机分为雌性7，10，15，20月龄组，各10只；雄性组随机分为雄性7，10，15，20月龄组，各10只。雌性大鼠与雄性大鼠分开饲养，均给予普通饲料饲养、自由活动、自由饮水、通风、光照充足、温度在21℃，相对湿度为70%-80%，动物每3d称体质量1次。
1.4.2取材将大鼠分别于7，10，15，20个月龄麻醉处死，取主动脉血，离心，取血清，冷冻待检。分别取双侧股骨、胫骨及腰椎，剔椎除股骨、胫骨、腰椎肌肉软组织。将第一腰椎、右侧股骨头以及右侧胫骨置于-80℃冰箱保存；第二腰椎、左侧股骨头、左侧胫骨头，置于40g/L多聚甲醛溶液中，用EDTA配置脱钙液脱钙。
1.4.3骨组织形态学检测取第二腰椎、左侧股骨头以及左侧胫骨，行苏木精-伊红染色，并用Motic Med 6.0图像分析系统对骨组织形态学进行观察分析，计算骨骺线下方4mm范围内骨松质区域骨小梁面积百分比。骨小梁面积百分比=测量框内骨小梁面积/测量框总面积×100%。
1.4.4骨密度测量将大鼠第一腰椎、右侧股骨头和右侧胫骨近端骨组织按相同方向顺序放置在双能X射线4500W骨密度扫描仪探头下进行扫描，计算机自动得出骨密度。
1.4.5ELISA法根据试剂盒说明书检测血清骨碱性磷酸酶和血清1型胶原羧基末端肽，ELx800全自动酶标仪分析结果。
1.5主要观察指标①骨组织结构及骨组织形态学；②骨密度、血清骨碱性磷酸酶和血清1型胶原羧基末端肽水平。
1.6统计学方法运用SPSS21.0软件（美国IBM公司）处理分析实验数据。结果以x±s表示，所有数据行正态分布检验和方差齐性检验，组间数据比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有显著性意义。

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Changes in bone morphology, bone mineral density and bone metabolism in different parts of natural aging rats

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