骨形态发生蛋白14成骨诱导脂肪间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石支架修复骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0665

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (33): 5309-5314.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0665

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骨形态发生蛋白14成骨诱导脂肪间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石支架修复骨缺损

丁涛¹，汤峰林¹，陆淼¹，顾三军²，王建兵²，刘浩²

¹无锡市人民医院骨科，江苏省无锡市 214000；²无锡市第九人民医院关节外科，江苏省无锡市 214000

修回日期:2018-07-22 出版日期:2018-11-28 发布日期:2018-11-28
通讯作者: 刘浩，硕士研究生，医师，无锡市第九人民医院关节外科，江苏省无锡市 214000
作者简介:丁涛，男，1978年生，江苏省无锡市人，汉族，2010年苏州大学毕业，博士，副主任医师，主要从事组织工程学、脊柱外科学的基础及临床研究。
基金资助:
南京医科大学科技发展基金重点项目(2016NJMUZD069)

Bone defect repair with bone morphogenetic protein 14 transfected adipose-derived stem cells seeded onto a silk fibroin/hydroxyapatite scaffold

Ding Tao¹, Tang Feng-lin¹, Lu Miao¹, Gu San-jun², Wang Jian-bing², Liu Hao²

¹Department of Orthopedics, Wuxi People’s Hospital, Wuxi 214000, Jiangsu Province, China; ²Department of Orthopedics, Wuxi 9^th People’s Hospital, Wuxi 214000, Jiangsu Province, China

Revised:2018-07-22 Online:2018-11-28 Published:2018-11-28
Contact: Liu Hao, Master candidate, Physician, Department of Orthopedics, Wuxi 9th People’s Hospital, Wuxi 214000, Jiangsu Province, China
About author:Ding Tao, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Wuxi People’s Hospital, Wuxi 214000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Scientific Development Foundation of Nanjing Medical University, No. 2016NJMUZD069

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨形态发生蛋白14成骨诱导的脂肪间充质干细胞：构建携带大鼠骨形态发生蛋白14基因的慢病毒过表达载体(LvBMP14)并完成慢病毒包装；将重组慢病毒转染大鼠脂肪间充质干细胞，其本质是向细胞导入特异性的基因，让细胞合成和分泌骨形态发生蛋白14蛋白，诱导其向成骨细胞持续分化。
丝素蛋白/羟基磷灰石支架：由丝素蛋白和羟基磷灰石2种材料复合而成的人工骨支架。组织工程学中，单一材料很难同时满足组织相容性好、孔隙率高、力学强度高、适合细胞黏附等要求，而丝素蛋白和羟基磷灰石二者具有较强的结合力，优势互补，满足组织工程支架材料的条件。

摘要
背景：临床上较大骨缺损往往难以自行修复，而通常采用的自体骨、异体骨移植也逐渐显现出其局限性。目前，组织工程技术的开展可以有望解决这一难题。利用转基因技术对干细胞进行成骨诱导，再将其种植在人工支架材料上体外构建组织工程化骨，为大面积骨缺损的修复带来新的希望。
目的：探讨丝素蛋白/羟基磷灰石支架材料与骨形态发生蛋白14转染脂肪间充质干细胞的生物相容性，并检验二者构建的组织工程化骨用于修复骨缺损的效果。
方法：胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞，第3代细胞使用携带骨形态发生蛋白14基因的重组慢病毒转染，利用荧光显微镜计算转染效率。制备丝素蛋白/羟基磷灰石支架，将转染成功后的脂肪间充质干细胞与丝素蛋白/羟基磷灰石支架材料体外复合，通过扫描电镜和MTT法评估材料对细胞的生物相容性。最后将上述组织工程化骨植入实验组大鼠尾椎缺损处，将空白转染的脂肪间充质干细胞复合支架植入对照组大鼠尾椎缺损处，通过摄片及micro CT检查来评估骨缺损的修复效果。
结果与结论：①骨形态发生蛋白14转染的脂肪间充质干细胞在丝素蛋白/羟基磷灰石支架材料上能够良好地黏附、增殖；②术后8周，实验组骨缺损处密度明显增高，可见大量骨痂形成，骨连续性恢复较好。对照组骨缺损处仍可见未完全吸收的支架材料影，周围无明显新生骨组织，未能将骨缺损处连接；③结果表明，丝素蛋白/羟基磷灰石支架材料对骨形态发生蛋白14转染的脂肪间充质干细胞具有良好的生物相容性，二者复合构建的组织工程化骨可促进骨缺损修复，效果良好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4601-8391(丁涛)

关键词: 骨缺损, 脂肪间充质干细胞, 骨形态发生蛋白14, 丝素蛋白, 羟基磷灰石, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: In clinic, large bone defects are often difficult to repair naturally. Traditional methods including autologous and allogeneic bone grafts gradually show their limitations. However, the development of tissue engineering technology is expected to solve this problem. Transgenic technology is used to induce osteogenic induction of stem cells, and then induced cells are seeded onto artificial scaffold materials to construct tissue-engineered bone in vitro, which brings new hope for the repair of large-area bone defects.
OBJECTIVE: To explore the biocompatibility of bone morphogenetic protein 14 (BMP14) transfected adipose-derived stem cells with silk fibroin (SF)/hydroxyapatite (HA) scaffolds and to evaluate the effect on repairing bone defects with this tissue-engineered bone.
METHODS: Rat adipose-derived stem cells were isolated and cultured in vitro using collagenase digestion method. The third passage cells were transfected by lentivirus with BMP14 gene. Transfection efficiency was counted under fluorescent microscope. Meanwhile, the SF/HA scaffolds was prepared. Transfected cells were then seeded onto the SF/HA scaffold to prepare tissue-engineered bone. Biocompatibility of the prepared tissue-engineered bone was tested by scanning electron microscope and MTT method. Afterwards, the prepared tissue-engineered bone was implanted into the defect of the rat caudal vertebra as experimental group, and empty transfected cells with SF/HA scaffolds acted as control group. Remediation effect on bone defects was evaluated by X-ray and micro-CT examination.
RESULTS AND CONCLUSION: BMP14 transfected adipose-derived stem cells adhered to the SF/HA scaffold and grew well. At 8 weeks after surgery, X-ray and micro-CT images showed that bone density of the intervertebral space obviously increased and a large number of calli developed in the experimental group, indicating a better recovery in bone continuity, while in the control group, the scaffold material incompletely absorbed was visible in the bone defect, and no obvious new bone tissues formed to fill in the defect. To conclude, these findings reveal that the SF/HA scaffold has good biocompatibility with BMP 14-transfected adipose-derived stem cells, and the composite artificial bone has good outcomes in the repair of bone defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Bone Morphogenetic Proteins, Silk, Hydroxyapatites, Bone Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

丁涛，汤峰林，陆淼，顾三军，王建兵，刘浩. 骨形态发生蛋白14成骨诱导脂肪间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石支架修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5309-5314.

Ding Tao, Tang Feng-lin, Lu Miao, Gu San-jun, Wang Jian-bing, Liu Hao. Bone defect repair with bone morphogenetic protein 14 transfected adipose-derived stem cells seeded onto a silk fibroin/hydroxyapatite scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5309-5314.

图/表（结果） 2

2.1 大鼠ADSCs的生长情况及鉴定结果 接种培养48 h后，细胞大部分已完全伸展，主要呈成纤维样、梭形或多角形，通常两端有较长的突起。培养9 d后，细胞汇合成单层，融合近90%。传代细胞呈克隆样生长，培养2 h即可贴壁，以类成纤维样细胞为主。随传代次数增多，逐渐以梭形细胞为主，见图1。流式细胞仪检测细胞表面抗原：CD44、CD90、CD105呈高表达，而CD34、CD68呈低表达。

2.2 转染效率及基因表达 转染后48 h，倒置相差显微镜观察细胞生长状态良好，形态未发生明显变化。荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光，根据EGFP表达率统计，转染效率为(73.1±3.1)%。RT-PCR检测结果显示，转染后的ADSCs在1 488 bp处明显有BMP14 mRNA特异性条带，而空白转染的ADSCs未检测到BMP14表达。

2.3 扫描电镜观察大鼠ADSCs在SF/HA支架上的生长、黏附情况 细胞接种到支架24 h后，可见细胞在材料上贴壁并完全铺展，细胞跨越材料的微孔进行生长，部分细胞附着在微孔内壁。细胞与支架复合72 h后，细胞数量逐渐增多，贴附于材料表面及孔内，细胞伸出的伪足紧紧贴附于材料表面，见图2。
2.4 MTT法检测大鼠ADSCs在SF/HA支架上的增殖情况 随着细胞、支架复合培养天数的增加，两组细胞的吸光度值均呈上升趋势，但两组吸光度值比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。该结果表明，BMP14诱导的ADSCs在SF/HA支架上生长增殖良好，支架材料对细胞具有良好的生物相容性。

2.5 放射学检查评估骨缺损的修复情况 术后第8周，实验组的骨缺损处密度明显增高，可见大量骨痂形成，骨连续性恢复较好。对照组骨缺损处仍可见未完全吸收的支架材料影，周围无明显新生骨组织，未能将骨缺损处连接，见图4。X射线评分结果显示：实验组X射线评分为9.89±0.53，对照组X射线评分为4.07±0.78。经过统计学分析，t=12.29，P < 0.05，两组X射线评分之间差异有显著性意义。

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引言

大段骨缺损的修复一直是困扰骨科临床医师的难题之一^[1]，自体骨移植作为最传统、最常用的修复骨缺损的方法，近年来也逐渐暴露出一些缺点：供区并发症、手术时间延长、出血量增多、塑形困难等^[2]。因此，临床上亟待研究出一种新的修复大段骨缺损的替代疗法。

随着组织工程学和基因治疗学的发展，人工制备的组织工程化骨为大段骨缺损的修复带来新的希望。综合工程学和生物学的技术方法，将种子细胞和支架材料有机结合，构建出的组织工程化骨具有良好的生物活性，种植在骨缺损区域，可与宿主骨快速结合，修复骨缺损^[3-5]。

组织工程化骨植入骨缺损后，如何保持持续的骨诱导能力，是修复大段骨缺损的关键。以往通过将干细胞与支架材料复合，制成的组织工程化骨仅仅具有骨传导能力，并不能满足修复大段骨缺损的需要^[6]。而通过转基因技术将编码诱导因子的基因导入种子细胞，再与生物支架复合，就能在骨缺损区域持续分泌诱导因子，诱导成骨^[7-9]。实验表明，骨形态发生蛋白14(bone morphogenetic protein，BMP14)能诱导多能间充质细胞^[10-11]、脂肪干细胞^[12-13]、骨髓基质细胞和骨膜细胞等多种细胞向成骨细胞分化^[14-19]，在肢体骨骼发育和关节形成中有着很重要的作用^[20]。丝素蛋白/羟基磷灰石(silk fibroin/hydroxyapatite，SF/HA)复合支架是将丝素蛋白和羟基磷灰石有机结合，取长补短，具有来源广泛、生物相容性好、细胞吸附性强、体内可降解、无毒性、力学强度高等特点，具备组织工程支架材料的基本条件^[21-22]。

实验采用Ⅰ型胶原酶消化法分离、培养大鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，并通过慢病毒载体将促成骨基因BMP14转染至大鼠ADSCs，转染成功后将ADSCs与SF/HA人工支架体外复合，检测二者的生物相容性；最后将构建的组织工程化骨植入大鼠尾椎缺损处，应用影像学手段检测其修复骨缺损的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 基因强化组织工程学，动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年12月在南京医科大学附属无锡人民医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验材料和试剂、仪器 SF/HA复合支架(实验室自制)；β-甘油磷酸钠(Invitrogen公司，美国)；慢病毒表达质粒(北京英茂盛业生物科技有限公司)；BMP14(A-10)单克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)。CO₂培养箱、低温高速离心机(Thermo公司，美国)；超净工作台(苏州净化设备工程公司)；倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)；扫描电镜(HITACHI公司，日本)；Micro CT(Scanco Medical公司，瑞士)；IVIS Lumina XRMS小动物活体光学及X射线成像系统(PerkinElmer公司，美国)。

1.3.2 实验动物 12只健康雄性SD大鼠，6-8周龄，体质量约250 g，由南京医科大学附属无锡人民医院中心实验室提供。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠ADSCs的分离、培养及BMP14基因转染 将SD大鼠拉颈处死后分离腹股沟脂肪组织，用PBS清洗3次，剪成1 mm³左右小块；转移至离心管中，加入Ⅰ型胶原酶溶液，密封离心管，放入37 ℃的恒温振荡箱中，振荡消化至绝大部分组织消化；依次加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM等体积中和、NH₄Cl裂解红细胞，离心弃上清；重悬细胞后按2×10⁵的密度接种于培养瓶内，置于培养箱培养；培养48 h后首次换液，去除未贴壁细胞，PBS冲洗3次，之后每两三天换液1次，5-7 d细胞生长融合至80%-90%时，进行传代培养；每日在倒置显微镜下观察细胞的生长情况。第3代细胞用于基因转染。

构建BMP14慢病毒过表达载体，完成病毒包装。将状态良好的第3代ADSCs铺于6孔板，37 ℃培养过夜。转染前，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积已稀释慢病毒液，轻轻8字混匀，37 ℃孵育培养4-6 h后更换新鲜培养液。荧光倒置显微镜观察荧光表达及细胞生长情况。RT-PCR检测BMP14 mRNA的表达水平。

1.4.2 SF/HA人工支架的制备 将蚕丝置于Na₂CO₃溶液中脱去丝胶，洗净后晾干，得到纯丝素纤维。丝素纤维用CaCl₂•CH₃CH₂OH•H₂O三元溶剂搅拌溶解，过滤后得到混合溶液，透析提纯后，得到纯丝素蛋白溶液。分析纯碳酸钙高温煅烧3 h制成氧化钙，氧化钙溶于去离子水中，搅拌形成不同浓度的氢氧化钙悬浮液。在三口瓶中加入1 L水，放入超声波振荡器，加热到60 ℃，先计量加入丝素蛋白溶液，再分次加入氢氧化钙悬浮液，然后按化学式比例滴加磷酸溶液，控制pH值为8.0-9.0，滴加完成后继续搅拌3 h，室温封口陈化48 h，用去离子水洗涤、抽滤3次。将制备的SF/HA复合微粒注入模具中，干燥成型，获得SF/HA人工支架。

1.4.3 SF/HA人工支架与BMP14转染的ADSCs的生物相容性 将50 μL转染后的ADSCs(细胞浓度5×10¹⁰ L^-1)利用微量移液器接种到SF/HA支架上，置入CO₂培养箱中培养4 h。相同条件下将转染后的ADSCs接种到盖玻片上培养作为对照组。每日在扫描电镜下观察细胞在支架上的生长情况及形态特点。细胞与材料联合培养后第1，4，8，12天行MTT检测，实验组及对照组各取4孔，选择570 nm波长，紫外分光光度计测定每孔的吸光度值，描绘曲线。

1.4.4 组织工程化骨修复大鼠尾椎骨缺损的效果 将复合大鼠ADSCs的SF/HA支架(即组织工程化骨)制备成适合植入大鼠尾椎间隙的形状，并在植入尾椎骨缺损前将支架材料用γ射线照射消毒。取健康雄性SD大鼠8只，随机分为实验组和对照组，每组4只。取出平髂后上棘连线处椎体(第1尾椎)，去除上下相邻椎间盘，放入内植物。实验组植入BMP14转染的ADSCs复合SF/HA支架，对照组植入空白转染ADSCs复合SF/HA支架。术后常规止痛、抗感染处理。于术后8周麻醉后在X射线、micro CT下行放射学检查。按照Lane-Sandhu X射线评分标准对修复骨缺损的效果进行量化^[23]。

1.5 主要观察指标 ①原代及传代ADSCs的形态；②BMP14转染效率；③转染后的ADSCs在支架上的生长情况；④复合支架植入术后8周骨缺损处新生骨的生成情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。数据以x(_)±s表示，采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近些年来，大段骨缺损的修复已经取得了长足的发展，但仍是临床上困扰骨科医师的难题之一。目前用于修复大段骨缺损的方法主要有自体骨移植^[24-26]、腓骨瓣移植^[27-29]、诱导膜技术^[30-32]、骨搬移技术等^[33-34]，但是以上技术均存在各自的局限性。自体松质骨来源有限，适用于小面积骨缺损的修复。腓骨瓣移植技术要求较高，面临供区和受区同时失败的风险，且容易造成骨不愈合或畸形愈合。诱导膜技术修复骨缺损需要做2次手术，且诱导膜的结构和功能、生长因子的含量及动态变化等尚不完全清楚。骨搬移技术治疗周期长，对患者的生活造成很大影响。组织工程学的飞速发展，为大段骨缺损的修复带来新的希望^[35]。

组织工程学的研究主要集中在种子细胞、生长因子、支架材料3个方面，其含义是将少量种子细胞在体外扩增、诱导后与支架材料结合，修复较大的组织或器官缺损^[36]。此次研究选用大鼠ADSCs作为种子细胞，因其具有多向分化潜能、取材容易等优势^[37-39]。为了使ADSCs在骨缺损区能够持续向成骨细胞分化，作者根据基因治疗的原理，通过构建基因整合型慢病毒表达载体，介导BMP14基因导入大鼠ADSCs，使之能够在体内持续稳定表达BMP14。作者之所以选择慢病毒表达载体，是因为其对间充质干细胞具有较高的转染效率，且慢病毒转染不会产生非特异性细胞反应^[40]。实验结果亦证实了这一点，在荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光表达，转染效率达到(73.1±3.1)%，且RT-PCR结果可见BMP14 mRNA特异性条带表达。

BMP14由Storm于1994年发现，它在肢体骨骼发育和关节形成中有着很重要的作用^[41-42]。BMP14基因突变的小鼠四肢出现畸形：长骨短缩，趾骨扁平且伴有多关节融合，这提示其在肢体骨骼发育中有极其重要的作用。既往实验已经证实BMP14能诱导多能间充质细胞、脂肪干细胞、骨髓基质细胞和骨膜细胞等多种细胞向成骨细胞分化。因此，选择BMP14作为生长因子来研究，以期为临床治疗骨缺损提供更多的选择。

实验成功制备了一种能够用于骨组织工程的可降解多孔型SF/HA复合支架，理论上它结合了2种材料的优点，具有组织相容性好、孔隙率高、力学强度高、适合细胞黏附等特点。以成骨诱导的ADSCs作为SF/HA相容性的检测细胞，二者在体外共培养，从细胞形态、生长增殖等方面证实，BMP14转染的ADSCs能在材料表面及孔隙内正常地增殖和分化，说明SF/HA作为人工骨材料具有良好的细胞相容性。

为检测组织工程化骨在体内的成骨效能，实验通过构建大鼠尾椎骨缺损模型，植入BMP14转染的ADSCs复合SF/HA支架，8周后通过影像学指标衡量骨愈合的水平。结果提示，BMP14转染的ADSCs复合SF/HA支架可以有效促进体内骨缺损的修复，术后X射线评分显著高于空白转染ADSCs复合SF/HA支架组。

BMP14转染的ADSCs复合SF/HA支架在动物实验取得了令人满意的初步效果，显示出巨大的应用前景，有望成为临床治疗大段骨缺损的新方法，为此还需继续努力。

骨形态发生蛋白14成骨诱导脂肪间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石支架修复骨缺损

Bone defect repair with bone morphogenetic protein 14 transfected adipose-derived stem cells seeded onto a silk fibroin/hydroxyapatite scaffold

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