白细胞介素23受体基因多态性与广西壮族人群骨关节结核的易感性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0840

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (28): 4434-4439.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0840

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白细胞介素23受体基因多态性与广西壮族人群骨关节结核的易感性

吴昭元1，谢克恭2，陆潞2，卢贤哲2，黄可2，廖林波1，唐毓金2

1右江民族医学院研究生学院，广西壮族自治区百色市 533000； 2右江民族医学院附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区百色市 533000

收稿日期:2018-01-18 出版日期:2018-10-08 发布日期:2018-10-08
通讯作者: 唐毓金，博士，教授，硕士生导师，右江民族医学院附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区百色市 533000
作者简介:吴昭元，男，1991年生，安徽省枞阳县人，汉族，右江民族医学院在读硕士，研究方向为脊柱与骨关节疾病。
基金资助:
国家自然科学基金应急管理项目(81541136)

Polymorphisms of interleukin-23 receptor gene and susceptibility of bone and joint tuberculosis in Guangxi Zhuang populations

Wu Zhao-yuan1, Xie Ke-gong2, Lu Lu2, Lu Xian-zhe2, Huang Ke2, Liao Lin-bo1, Tang Yu-jin2

1Graduate School of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2018-01-18 Online:2018-10-08 Published:2018-10-08
Contact: Tang Yu-jin, MD, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Wu Zhao-yuan, Master candidate, Graduate School of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Emergency Management Project of the National Natural Science Foundation of China, No. 81541136

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
基因多态性：多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在2种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。
易感性：是指人和动物对某种人畜共患病病原体感染受性的大小，是指由遗传基础所决定的个体患病的风险。也可以理解为在相同环境下，不同个体患病的风险。易感性完全由基因决定，在环境致病因子作用下的基因表达往往起着更重要的作用。因为即使基因型一致，基因表达还会受到甲基化、体细胞突变、X染色体的随机失活等影响。

摘要
背景：广西壮族自治区是结核病的高发地域，大量研究证实结核病存在易感基因。
目的：分析白细胞介素23受体基因多态性及其与广西壮族人群骨关节结核易感性之间的关系。
方法：选取2014年7月到2017年3月右江民族医学院附属医院住院的125例骨关节结核患者及150例健康体检者作为研究对象，利用PCR扩增技术和 DNA 测序方法分别对骨关节结核患者及健康体检者白细胞介素23受体rs10489628G/A、rs10489629T/C、rs10889675A/C、rs10889677C/T、rs7530511C/A位点进行多态性检测，比较2组基因型以及等位基因的频率分布差异，探讨各基因型与骨关节结核易感性的关系。
结果与结论：白细胞介素23受体基因rs10489629 T/C位点骨关节结核组C等位基因频率29.2%，高于对照组(21.3%)；rs10889675 C/A位点骨关节结核组A等位基因频率26.0%，高于对照组(18.0%)，骨关节结核组CA频率37.6%高于对照组(25.3%)；差异均有显著性意义(P < 0.05)。骨关节结核组单倍型GTCAC频率69.6%低于对照组(77.3%)、ACACC频率26.0%高于对照组(17.7%)。提示白细胞介素23受体 rs10489629T/C、rs10889675C/A位点多态性可能与广西壮族人群骨关节结核易感性有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4522-6260(吴昭元)

关键词: 白细胞介素23, 基因多态性, 广西壮族自治区, 壮族, 骨关节结核, 易感性, 单核苷酸多态性, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: The incidence of tuberculosis is high in populations from Guangxi Zhuang Autonomous Region. Tuberculosis has been shown to have susceptibility gene.
OBJECTIVE: To analyze the relationship between interleukin-23 receptor (IL-23R) gene polymorphism and susceptibility to bone and joint tuberculosis in Guangxi Zhuang populations.
METHODS: Totally 125 patients with bone and joint tuberculosis admitted in the Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities and 150 healthy subjects were selected. The gene polymorphism of IL-23R (rs10489628G/A, rs10489629T/C, rs10889675A/C, rs10889677C/T, rs7530511C/A) was analyzed by PCR amplification technique and DNA sequencing method. The genotypes and frequency distribution of alleles were compared between the tuberculosis and control groups. The relationship between IL-23R gene polymorphism and the susceptibility to bone and joint tuberculersis was discussed.
RESULTS AND CONCLUSION: The frequency of C allele of IL-23R rs10489629 T/C in the tuberculosis group was 29.2%, which was significantly higher than that in the control group (21.3%) (P < 0.05). The frequency of A allele of IL-23R rs10889675 C/A in the tuberculosis group was 26.0%, which was significantly higher than that in the control group (18.0%). The frequency of CA genotype of IL-23R rs10889675 C/A in the tuberculosis group was 37.6%, which was significantly higher than that in the control group (25.3%) (P < 0.05). The frequency of GTCAC haplotype in the bone and joint tuberculosis group was 69.6% which was lower than that in the control group (77.3%). The frequency of ACACC haplotype in the bone and joint tuberculosis group was 26.0% which was higher than that in control group (17.7%). In summary, the gene polymorphism of IL-23R rs10489629T/C and rs10889675C/A may be related to the susceptibility of bone and joint tuberculosis in Guangxi Zhuang populations.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Interleukin-23, Genetic Predisposition to Disease, Tuberculosis, Osteoarticular, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

吴昭元，谢克恭，陆潞，卢贤哲，黄可，廖林波，唐毓金. 白细胞介素23受体基因多态性与广西壮族人群骨关节结核的易感性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(28): 4434-4439.

Wu Zhao-yuan1, Xie Ke-gong2, Lu Lu2, Lu Xian-zhe2, Huang Ke2, Liao Lin-bo1, Tang Yu-jin2 . Polymorphisms of interleukin-23 receptor gene and susceptibility of bone and joint tuberculosis in Guangxi Zhuang populations[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(28): 4434-4439.

图/表（结果） 1

2.1 受试者数量分析病例组和对照组所有参与者均进入结果分析。2组研究对象性别、年龄差异均无显著性意义(P > 0.05；表2)。

2.2 白细胞介素23受体基因各位点的检测结果 ABI3730XL测序仪的SNP结果显示，rs10489628位点的基因型有3种，分别是GG、GA、AA；rs10489629位点的基因型有3种，分别是TT、TC、CC；rs10889675位点的基因型有3种，分别是AA、AC、CC；rs10889677位点的基因型有3种，分别是CC、CT、TT；rs7530511位点的基因型有3种，分别是CC、CA、AA。

2.3 Hardy-Weinberg遗传平衡检测经χ²检验，2组研究对象在该群体均存在Hardy-Weinberg平衡(P > 0.05)。

2.4 白细胞介素23受体基因单核苷酸多态性与骨关节结核易感性的关系如表3所示，骨与关节结核组白细胞介素23受体基因 rs10489629 T/C位点TT、TC、CC基因型频率分别为51.2%，39.2%，9.6%，对照组TT、TC、CC基因型频率分别为62.7%，32.0%，5.3%，两组基因型分布差异无显著性意义(P > 0.05)。骨与关节结核组白细胞介素23受体基因 rs10489629 T/C位点T、C等位基因频率分别为70.8%、29.2%，对照组T、C等位基因频率分别为78.6%、21.3%，两组等位基因频率分布差异有显著性意义(P < 0.05)，即骨与关节结核组C等位基因频率显著高于对照组，提示C等位基因(OR=0.657 5，95%CI：0.446-0.969 3)是骨与关节结核病发病易感因素，推测该位点多态性与广西壮族人群骨关节结核的易感性显著相关。骨与关节结核组白细胞介素23受体基因rs10889675 C/A位点CC、CA、AA基因型频率分别为55.2%，37.6%，7.2%，对照组CC、CA、AA基因型频率分别为69.3%，25.3%，5.3%，两组基因型分布差异有显著性意义(P < 0.05)，其中CA基因型是骨与关节结核的易感因素，该位点多态性与广西壮族人群骨与关节结核的易感性显著相关。骨关节结核组C、A等位基因频率分别为74.0%、26.0%，对照组C、A等位基因频率分别为82%、18%。骨与关节结核组A等位基因频率显著高于对照组，提示A等位基因(OR=0.624 8，95%CI：0.415 4- 0.939 7)是骨与关节结核病发病易感因素，推测该位点多态性与广西壮族人群骨与关节结核的易感性显著相关。两组余下白细胞介素23受体基因rs10489628 G/A、rs10889677A/C、rs7530511C/T位点基因型及等位基因频率分布差异无显著性意义(P > 0.05)，推测该位点多态性与广西壮族人群骨关节结核的易感性无显著相关。

2.5 白细胞介素23受体基因单倍型分析及与骨关节结核易感性的关系应用Haploview 4.2软件对骨关节结核组

和健康对照rs10489628G/A，rs10489629T/C，rs10889675A/C，rs10889677C/T，rs7530511C/A 5个位点进行连锁不平衡构建及单倍型分析，这5个位点不存在连锁不平衡关系，进一步进行单倍型分析。结果如表4所示，3种单倍型，分别为ACCCC、GTCAC和ACACC，其中GTCAC和ACACC在骨关节结核组和健康对照组中的分布频率差异有显著性意义(P < 0.05)，提示ACACC (OR=0.610 7，95%CI：0.405 4-0.920 0)单倍型可能增加骨关节结核的发病风险；GTCAC(OR=1.490 2，95%CI：1.017 4-2.182 8)单倍型可能是骨关节结核保护因素之一。

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引言

骨关节结核是由结核分支杆菌侵入骨或关节而引起的慢性肉芽肿病，是最常见的肺外结核，其原发病灶多存在于肺部，好发于负重大、活动多、易于损伤的部位，如治疗不及时后期容易出现畸形、关节功能丧失，严重的可引起脊髓压迫、截瘫，甚至影响患者性命^[1]。世界卫生组织2015年全球结核病控制报告中显示中国新发肺结核人数93万位居全球第3位，仅次于印度(220万)和印度尼西亚(100万)^[2]。而中国的结核疫情形势分析发现广西壮族自治区又是发病率和发病数均属前十的省份之一^[3]。虽然随着有效抗结核药物的发明和使用使得结核病的死亡率有所下降，但近年来，由于艾滋病的流行及耐药结核菌株的增多使得结核病治疗难度加大^[4-5]，结核病仍是亟需解决的公共卫生安全问题之一。骨关节结核起病缓慢而且症状隐匿，早期关节功能不受影响可无典型的临床症状，这给诊断增加了难度。目前，关于骨关节结核的具体发病机制仍不明确，以往的研究表明骨关节结核的典型病变为结核结节形成伴有不同程度的干酪样坏死，而结核病的发展和结局取决于机体的抵抗力和结核杆菌致病力之间的矛盾关系，而结核分枝菌的多种抗原成分，可引起单核巨噬细胞系统分泌大量细胞因子使得破骨细胞功能增强、数量增多，不断的造成骨破坏从而影响健康骨形态的维持^[6]，而有关这些因子的研究对进一步了解骨关节结核的发生发展起着重要作用。

白细胞介素是一类能调节细胞间相互作用的细胞因子，在免疫应答过程中起着重要作用。白细胞介素23是Oppmann等^[7]在2000年发现的一种异源二聚体细胞因子，与白细胞介素12有着相似的结构，由p19亚基和p40亚基构成。白细胞介素23主要由树突细胞、吞噬细胞等抗原提呈细胞产生，广泛参与体内免疫过程，对多种免疫细胞的分化发育、增殖及炎症反应的调节起重要作用^[8]。

有研究表明来源于M1型巨噬细胞的白细胞介素23可以刺激T细胞产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，募集分化单核细胞至促炎症细胞表型，在分枝杆菌的T细胞依赖性免疫的阶段起作用^[9]。另外有研究证实辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)和白细胞介素17参与结核病的发病机制，白细胞介素23可促进Th17细胞分化表达白细胞介素22、白细胞介素17F、白细胞介素21、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和潜在的肿瘤坏死因子α和白细胞介素6参与机体的结核免疫反应^[10]。白细胞介素23受体和白细胞介素12受体β1共同组成白细胞介素23的受体复合物，近年来研究发现白细胞介素23受体基因存在多态性，而这些多态性可能影响基因的转录和表达，并且与炎症性肠病、类风湿性关节炎、肿瘤等疾病的易感性有关^[11-18]。作者拟通过检测广西壮族自治区中壮族人群白细胞介素23受体的5个位点(rs10489628，rs10489629，rs10889675，rs10889677和rs7530511)单核苷酸多态性并探讨它们与骨关节结核易感性之间的关系，为更进一步深入了解骨关节结核的发病机制提供基础。

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材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

1.1 设计病例-对照研究。

1.2 时间及地点试验于2014年7月至2017年3月在右江民族医学院附属医院完成。

1.3 对象选取2014年7月至2017年3月期间来右江民族医学院附属医院就诊的骨关节结核患者(病例组)以及同期随机选取在右江民族医学院附属医院体检的广西壮族人群(对照组)作为研究对象。

病例组纳入标准：①患者临床症状：起病隐匿可无明显午后低热、乏力、盗汗全身症状，典型病例可有消瘦、食欲差、贫血症状，关节病变多单发，后期可出现寒性脓肿、局部畸形、功能障碍；②X射线特征表现为区域性骨质疏松和骨质破坏病灶，CT可见病灶位置及寒性脓肿存在；③术后病理结果为典型结核性肉芽肿：结核性肉芽肿中心部为干酪样坏死，坏死灶周围可见大量上皮样细胞和郎罕斯多核巨细胞，外层淋巴细胞浸润，周边有纤维母细胞和胶原纤维分布；④民族为壮族；⑤籍贯为壮族自治区。排除标准：患有肿瘤、自身免疫性疾病、遗传病史等患者。

对照组纳入标准：①民族为壮族；②籍贯为壮族自治区。排除标准：有基础疾病或患有结核病、肿瘤、自身免疫疾病及遗传病患者。

最终获得病例组125例和对照组150例。试验获得右江民族医学院附属医院伦理委员会批准，所有受试对象均知情同意。

1.4 方法

1.4.1 标本采集分别抽取受试对象肘正中静脉血2 mL于枸橼酸钠抗凝管，然后置于-80 ℃冰箱保存备用DNA提取。

1.4.2 引物设计与合成根据NCBI上查找的白细胞介素23受体易感基因，选择包含白细胞介素23受体 rs10489628、rs10489629、rs10889675、rs10889677、rs7530511位点的序列(表1)，输入引物运用在线Primer 3软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计，具体合成委托上海天昊生物科技有限公司完成。

1.4.3 白细胞介素23受体基因各位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)检测取1 μL DNA样本以1%琼脂糖电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5- 10 mg/L。PCR反应体系(20 μL)：1×GC-I buffer，3.0 mmol/L Mg²⁺，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaq polymerase， 1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物。反应条件：95 ℃× 2 min；94 ℃×20 s，65 ℃×40 s，72 ℃×1.5 min，共11个循环；94 ℃×20 s，59 ℃×30 s，72 ℃×1.5 min，共24个循环；72 ℃×2 min，4 ℃保存。PCR产物纯化：在10 μL PCR产物中加入5 U虾碱酶和2 U外切酶I，37 ℃温浴1 h，然后75 ℃灭活15 min。SNaPshot多重单碱基延伸反应及测序：延伸反应体系(10 μL)：5 μL SNaPshot Multiplex Kit，2 μL纯化后多重PCR产物，1 μL延伸引物混合物和2 μL超纯水。反应条件：96 ℃×1 min；96 ℃×10 s，55 ℃×5 s，60 ℃×30 s，共28个循环；4 ℃保存。延伸产物纯化：在10 μL延伸产物中加入1 U SAP酶，37 ℃温浴1 h，然后75 ℃灭活15 min。取0.5 μL纯化后的延伸产物，与0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di 混匀，95 ℃变性5 min，测序仪检测，GeneMapper 4.1(美国Applied Biosystems公司)分析。

1.5 主要观察指标 ①白细胞介素23受体基因rs10489628、rs10489629、rs10889675、rs10889677、rs7530511位点多态性；②白细胞介素23受体基因rs10489628、rs10489629、rs10889675、rs10889677、rs7530511位点多态性与广西壮族人群骨关节结核易感性之间的关系；③白细胞介素23受体基因rs10489628、rs10489629、rs10889675、rs10889677、rs7530511位点单倍型分析及与广西壮族人群骨关节结核易感性的关系。

1.6 统计学分析使用软件SPSS 19.0(IBM公司)对所得的数据进行处理，采用χ²检验确认病例组及对照组各位点的基因型和等位基因频率是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡以及两组基因型及等位基因频率之间的比较；通过分析软件Haploview 4.2完成单倍型分析；P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

随着分子遗传学、基因组学的发展，对疾病的认识不断加深，宿主易感基因在结核病发生、发展中的作用成为近年来研究的重点。目前研究较多的结核的易感基因有自然抗性相关巨噬细胞蛋白1、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-DRB1和HLA-DQB1基因、维生素D受体基因、甘露糖结合凝聚素基因、白细胞介素1受体基因等^[19]。此前，课题组成员乔宁宁等^[20]对红细胞补体受体1基因多态性与广西壮族人群骨关节结核易感性进行研究，结果发现在红细胞CR1基因rs4844600G/A位点中，G等位基因(P < 0.05，OR：1.565，95%CI：1.058-2.314)、GG基因型(P<0.05，OR：2.262，95%CI：1.275-4.013)以及在rs9429945C/T位点C等位基因(P < 0.05，OR：1.550，95%CI：1.022-2.352)、CC基因型(P < 0.05，OR：2.067，95%CI：1.197-3.568)可能是广西壮族人群罹患骨关节结核的危险因素；另外携带CGGGC单倍型的人群患骨关节结核的风险更高，而CGGAT单倍型患骨关节结核风险较低。陆潞等^[21]对白细胞介素12A rs568408和白细胞介素12B rs3212227多态性骨关节结核易感性研究虽然没有发现易感基因，但也不能否认其在骨关节结核免疫反应中的作用。

大量研究都已表明白细胞介素23参与结核的免疫反应，而作者前期的研究也发现，在广西壮族人群骨结核患者血清中白细胞介素23表达水平较正常人群中高，提示可能在骨关节结核的发病中起着重要作用^[22]。细胞因子发挥生物学性能需要与它表面特异性受体结合，因此白细胞介素23受体基因多态性可能会影响白细胞介素23的表达及转录，进一步影响机体患病的易感性。白细胞介素23受体基因位于人类1号染色体1p31区域，开放读码框由12个外显子组成，在人基因组DNA上的跨度为92 kb，其基因编码产物是一种由629个氨基酸组成的跨膜蛋白，是促红细胞生成素受体超家族中的一员^[23-28]。白细胞介素23受体基因多态性与多种疾病有关，而目前关于白细胞介素23受体基因多态性与结核易感性相关研究主要是在肺结核上。国外学者Ben-Selma等^[29]于2012年在对突尼斯人群进行的白细胞介素23受体基因多态性研究中发现，白细胞介素23受体基因rs11209026位点基因多态性与突尼斯人群活动性肺结核的严重程度具有相关性。另外国内学者阿不都吉力力•居来提^[30]对新疆维吾尔族人群白细胞介素23受体基因多态性研究，结果发现在rs7518660位点中，AA(P < 0.000 1，OR：6.25，95%CI：3.85-10)可能是新疆维吾尔族人群肺结核患病的危险因素，GG 基因型(P < 0.000 1，OR：0.21，95%CI：0.13-0.32)可能是新疆维吾尔族人群肺结核患病的保护性因素；在rs10889677位点中C 等位基因并且CC基因型(P=0.044 6，OR：1.53，95%CI：1.01-2.31)可能是肺结核患病的危险因素，AA基因型(P=0.044 6，OR：0.66，95%CI：0.44-0.99)可能是新疆地区维吾尔族人群肺结核患病的保护性因素。然而白细胞介素23受体基因多态性与骨关节结核的易感性相关研究却未见报道。文章中对广西壮族人群中骨关节结核组与健康对照组白细胞介素23受体rs10489628G/A，rs10489629T/C，rs10889675A/C，rs10889677C/T，rs7530511C/A位点基因多态性进行研究，结果发现rs10489629 T/C、rs10889675 C/A位点多态性与广西壮族人群骨关节结核易感性有关，在rs10489629 T/C位点中C等位基因(OR=0.657 5，95%CI：0.446-0.969 3 )可能是骨关节结核病发病易感因素；在rs10889675 C/A位点中，A等位基因(OR=0.624 8，95%CI：0.4154-0.939 7)可能是骨关节结核病发病易感因素，CA基因型可能是骨关节结核的易感基因型。另外，试验中rs10889677A/C位点未发现与骨关节结核易感性有关，这与阿不都吉力力•居来提的研究是不符的，可能的因素有：①结核易感性与多种基因有关，是多种基因共同作用的结果，种族在遗传中也占有重要因素；②肺结核与骨关节结核有着不同的发病机制。单倍型研究结果提示ACACC(OR=0.610 7，95%CI：0.405 4-0.920 0)单倍型可能增加骨关节结核的发病风险；GTCAC(OR=1.490 2，95%CI：1.017 4-2.182 8)单倍型可能是骨关节发病的保护因素之一。

综上所述，白细胞介素23受体(rs10489629 T/C、rs10889675 C/A位点)多态性与广西壮族人群骨关节结核易感性有关，对早期发现易感人群以及探究结核发病机制有重要意义。但研究也存在一定不足，例如收集的骨关节结核病例的样本量及测试的位点有限；忽略了环境因素在遗传中的作用；研究对象脊柱结核和关节结核未分开进一步分析。关于白细胞介素23受体基因多态性如何影响骨关节结核发病的机制仍不明确，仍是今后需要研究的方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

白细胞介素23受体基因多态性与广西壮族人群骨关节结核的易感性

Polymorphisms of interleukin-23 receptor gene and susceptibility of bone and joint tuberculosis in Guangxi Zhuang populations

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