海藻酸钠/层状双氢氧化物-五氟尿嘧啶载药体系的制备、释放及抗肿瘤特性分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0943

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (26): 4168-4173.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0943

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海藻酸钠/层状双氢氧化物-五氟尿嘧啶载药体系的制备、释放及抗肿瘤特性分析

韩晓静¹，杨红¹，孙笑宇¹，王辉²，王庆峰³

¹山西药科职业学院制药工程系，山西省太原市 030031；²辽宁石油化工大学化学化工与环境学部，辽宁省抚顺市 113001；³沈阳师范大学粮食学院，辽宁省沈阳市 110032

收稿日期:2018-07-11 出版日期:2018-09-18 发布日期:2018-09-18
通讯作者: 王庆峰，讲师，沈阳师范大学粮食学院，辽宁省沈阳市 110032
作者简介:韩晓静，女，1976年生，山西省平遥县人，汉族，2013年山西大学毕业，硕士，主要从事中药中活性成分研究及新剂型的研发。
基金资助:
沈阳市科技计划项目(18-013-0-44)

Preparation, release and antitumor properties of sodium alginate/layered double hydroxides-5- fluorouracil delivery system

Han Xiao-jing¹, Yang Hong¹, Sun Xiao-yu¹, Wang Hui², Wang Qing-feng³

¹Department of Pharmaceutical Engineering, Shanxi Pharmaceutical Vocational College, Taiyuan 030031, Shanxi Province, China; ²Department of Chemical Industry and Environment, Liaoning Shihua University, Fushun 113001, Liaoning Province, China; ³College of Food Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110032, Liaoning Province, China

Received:2018-07-11 Online:2018-09-18 Published:2018-09-18
Contact: Wang Qing-feng, Lecturer, College of Food Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110032, Liaoning Province, China
About author:Han Xiao-jing, Master, Department of Pharmaceutical Engineering, Shanxi Pharmaceutical Vocational College, Taiyuan 030031, Shanxi Province, China
Supported by:
the Science and Technology Research Project of Shenyang, No. 18-013-0-44

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

层状双氢氧化物的缓释特性：层状双氢氧化物独特的生物可降解性和利于细胞内化及药物释放的性质，使其在医药控释领域的应用成为研究热点，其可有效包埋各种药物，获得缓释特性。

海藻酸钠凝胶珠的特性：在完成药物芯材的制备之后，为了进一步满足其在肠内释放的需求，以海藻酸钠对所制备的芯材进行了包埋，使其稳定性更好。经过实验验证该凝胶pH敏感，并对肝癌SMMC-7721细胞株的抑制效果较好。

背景：5-氟尿嘧啶类药物存在毒性大、体内代谢时间短等临床问题。

目的：制备海藻酸钠/层状双氢氧化物-5-氟尿嘧啶凝胶珠载药体系，考察其载药量、微观形貌、体外释放及对肝癌细胞的抑制效果。

方法：设置层状双氢氧化物-5-氟尿嘧啶溶胶液与海藻酸钠溶液的体积比分别为3∶5，4∶5，5∶5，采用离子凝胶法制备海藻酸钠/层状双氢氧化物-5-氟尿嘧啶凝胶珠，检测其载药量。将海藻酸钠/层状双氢氧化物-5-氟尿嘧啶凝胶珠分别放置于pH=2.1，4.6，7.4的PBS中，定时检测5-氟尿嘧啶释放率。将肝癌SMMC-7 721细胞株分组培养，分别加入不同质量浓度(5，10，20，40 mg/L)的海藻酸钠、层状双氢氧/5-氟尿嘧啶凝胶珠、海藻酸钠/层状双氢氧化物-5-氟尿嘧啶凝胶珠混悬液，培养24 h后，检测细胞抑制率。

结果与结论：①体积比3∶5，4∶5，5∶5载药体系的载药量分别为(3.09±0.08)%，(4.55±0.10)%，(5.47± 0.14)%；②与pH=7.4条件比较，海藻酸钠/层状双氢氧化物-5-氟尿嘧啶凝胶珠在pH=2.1，4.6条件下释放5-氟尿嘧啶速度较快，并且随着5-氟尿嘧啶负载量的增加，5-氟尿嘧啶的释放速度逐渐增加；③不同质量浓度海藻酸钠对肝癌SMMC-7 721细胞株的抑制作用较小；随着质量浓度的增加，层状双氢氧/5-氟尿嘧啶凝胶珠、海藻酸钠/层状双氢氧化物-5-氟尿嘧啶凝胶珠对肝癌SMMC-7721细胞株的抑制作用逐渐增强，且海藻酸钠/层状双氢氧化物-5-氟尿嘧啶凝胶珠的抑制作用更强；④结果表明，海藻酸钠/层状双氢氧化物-5-氟尿嘧啶凝胶珠具备pH选择性缓释作用及较强的肿瘤抑制效果。

ORCID: 0000-0001-7635-1470(韩晓静)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 海藻酸钠, 层状双氢氧化物, 5-氟尿嘧啶, pH敏感性, SMMC-7721, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: In clinical practice, 5-fluorouracil (5-Fu) has disadvantages such as high toxicity and short metabolism time.

OBJECTIVE: To prepare the sodium alginate (SA)/layered double hydroxides (LDH)-5-Fu delivery system and to explore its drug loading, micromorphology, in vitro release and inhibitory effect on hepatoma cells.

METHODS: LDH-5-Fu solution and SA solution were mixed at a ratio of 3:5, 4:5 and 5:5 to prepare SA/LDH-5-Fu beads using ionic gel method, respectively. The drug loading capacity of these beads was then tested. SA/LDH-5-Fu beads were placed in PBS of pH=2.1, 4.6, and 7.4, and the release rate of 5-Fu was measured periodically. SMMC-7 721 hepatoma cells were cultured with the SA at different concentrations (5, 10, 20, 40 mg/L), LDH-5-Fu beads, and SA/LDH-5-Fu bead suspension for 24 hours, and then the cell inhibitory rate was detected.

RESULTS AND CONCLUSION: The drug loading rate of SA/LDH-5-Fu at 3:5, 4:5, and 5:5 was (3.09±0.08)%, (4.55±0.10)%, and (5.47±0.14)%, respectively. The release of 5-Fu from the SA/LDH-5-Fu beads at pH=2.1 and 4.6 was faster than that at pH=7.4. Moreover, the release of 5-Fu was gradually fastened with the increasing input amount of 5-Fu. SA showed little inhibition effect on SMMC-7721 cells, while the inhibitory rate of LDH-5-Fu or SA/LDH-5-Fu to SMMC-7721 in vitro was gradually increased, and the inhibitory rate of SA/LDH-5-Fu was significantly higher than that of LDH-5-Fu. These findings reveal that SA/LDH-5-Fu is a potential pH sensitive anti-tumor drug release system.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Fluorouracil, Liver Neoplasms, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

韩晓静，杨红，孙笑宇，王辉，王庆峰. 海藻酸钠/层状双氢氧化物-五氟尿嘧啶载药体系的制备、释放及抗肿瘤特性分析[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(26): 4168-4173.

Han Xiao-jing, Yang Hong, Sun Xiao-yu, Wang Hui, Wang Qing-feng. Preparation, release and antitumor properties of sodium alginate/layered double hydroxides-5- fluorouracil delivery system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(26): 4168-4173.

图/表（结果） 5

2.1 海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的载药量海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的载药量如图3所示，随着5-氟尿嘧啶投入比的增加，海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的载药量也逐渐增加，且体积比3∶5，4∶5，5∶5海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶的载药量依次为(3.09±0.08)%，(4.55±0.10)%，(5.47±0.14)%。因为载药体系采用先合成LDH-5-氟尿嘧啶，再凝胶法制备海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶，因此最终所得5-氟尿嘧啶的载药量相对较低。可以看出，随着5-氟尿嘧啶质量浓度的上升，其载药量也随之上升，且组间对比差异显著(P < 0.01)。

2.2 海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的分子结构与微观结构在海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶的红外光谱图中，既可看出海藻酸钠的红外光谱特征，也可看出LDH-5-氟尿嘧啶的红外光谱特征^[33^，^37]。分析海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶的红外光谱图(图4)可得：在1 484，1 356 cm^-1处的特征峰是嘧啶环结构的特征峰，1 547，1 164 cm^-1的峰是C-N和C=N的振动引起，这几个特征峰体现了5-氟尿嘧啶的分子结构特征^[38]；1 684，1 630，1 336 cm^-1处的特征峰是由5-氟尿嘧啶和海藻酸钠分子结构中的C=C、C=O、-C-O振动引起；1 660，1 427 cm^-1处的特征峰是海藻酸钠分子结构中-COOH基团的振动引起^[39]。另外，681 cm⁻¹和 453 cm⁻¹的特征峰是LDH结构中的Mg-O-Mg特征峰^[40]。综上，LDH-5-氟尿嘧啶被包裹在海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠中。

海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的形貌特征如图5所示，干燥后的海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠是球形的，大小约为500 μm，表面呈现的褶皱是由带负电的海藻酸钠分子与溶液中带正电的Mg²⁺和Al³⁺通过静电作用形成“蛋盒”结构，以及LDH载体与海藻酸钠分子间相互作用形成。

2.3 海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠在不同pH值条件下的体外释放性能如图6所示，在pH=2.1和pH=4.6条件下，海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠释放5-氟尿嘧啶的速度明显快于在pH=7.4条件下的释药速度，原因可能是由于LDH在酸性条件下容易降解，导致海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠内部结构发生溶胀。但由于海藻酸钠在酸性条件下能与Mg²⁺和Al³⁺形成“蛋盒”结构，延缓5-氟尿嘧啶的释放，所以在酸性条件下海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠体系释放5-氟尿嘧啶的速度慢于LDH/5-氟尿嘧啶的释放速度；但在碱性条件下，海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠体系的释放速度快于LDH/5-氟尿嘧啶。并且从3张图中看出，随着5-氟尿嘧啶负载量的增加，5-氟尿嘧啶的释放速度也有所增加，这可能是由于随着LDH-5-氟尿嘧啶加入量的增多，引起凝胶珠部分溶胀加快，同时也相对降低了海藻酸钠的浓度。在pH=7.4的条件下，海藻酸钠/ LDH-5-氟尿嘧啶释放5-氟尿嘧啶的速度缓慢，这主要是由于在pH=7.4的条件下，LDH/5-氟尿嘧啶的释放不是通过LDH的降解，而是溶液中-PO₄³⁺与5-氟尿嘧啶之间的F^-离子交换引起的，所以释放速度较缓慢。综上，海藻酸钠能够提高LDH-5-氟尿嘧啶载药体系在酸性条件下的缓释行为，且海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠是一种具有pH敏感性的缓释体系。

2.4 海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠对SMMC-7721的体外抑制作用图7为海藻酸钠材料、LDH-5-氟尿嘧啶和海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠对SMMC-7721细胞作用24 h的抑制率结果。5-40 mg/L海藻酸钠对SMMC-7721的抑制率为2.03%-8.76%，对SMMC-7721细胞的抑制作用较小；LDH-5-氟尿嘧啶和海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶对肝癌细胞的抑制作用都随质量浓度的增加而增强。与LDH-5-氟尿嘧啶相比，海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶对SMMC-7721的抑制作用有了显著提高(P < 0.05)，40 mg/L海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶对SMMC-7721的抑制率为68.25%，明显高于相应质量浓度LDH-5-氟尿嘧啶的抑制效果(24.05%)，这表明海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶具备良好的缓释性能，并且由于海藻酸钠包裹无机复合药物的结构，使其对SMMC-7721细胞有较强的亲和力，显著提高了对肿瘤细胞的抑制率与5-氟尿嘧啶药物的利用率。

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引言

5-氟尿嘧啶为尿嘧啶类抗代谢药物，它在体内转化为相应的氟尿嘧啶核苷和氟尿嘧啶脱氧核苷，后者抑制胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶，阻断氟尿嘧啶脱氧核苷酸转变成胸腺嘧啶核苷酸，影响DNA合成，有抗癌作用；它能以伪代谢物身分掺入RNA来抑制肿瘤细胞的增殖，被广泛用于治疗癌症^[1]。但其对肿瘤细胞的选择性差^[2]，且对正常细胞的毒副作用明显。

近年来，以高分子聚合物作为载药基质包埋制备的药物新剂型取得了令人瞩目的进步^[3-5]，可在提高药物利用度^[6]、降低生物毒性的同时^[7]，有效实现药物的可控释放^[8]。载药高分子以纳米粒子^[9-10]、胶束^[11-12]、微球^[13-14]、水凝胶4类形式存在^[15-16]，其中纳米粒子尺寸在1-100 nm，因具有纳米尺寸效应和极大的比表面积，可增溶(利用高分子聚合物两端一头亲水一头亲油的特性，形成水包油或者油包水的微囊，增加药物包埋率)药物，增加药物稳定性和活性，增强药物的吸收和靶向积累，提高药物包封率和延长释药时间^[17-19]。海藻酸钠源于海藻类植物胞壁中的多糖，被广泛应用于药物运输体系，剂型包括片剂、微球或凝胶珠体、纳米粒等^[20]。海藻酸钠作为药物运输系统具有包封率高、稳定性强、体内特异性分布、无毒、pH敏感等特性^[21]。Xing等^[9]用壳聚糖、海藻酸钠和普朗尼克聚醚制备了包裹5-氟尿嘧啶的纳米颗粒，粒径为200 nm左右，体外药物可缓释12 h以上。戚旻熠^[22]采用自由基聚合的方法，以N-异丙基丙烯酰胺和海藻酸钠合成了海藻酸钠-g-N-异丙基丙烯酰胺接枝聚合物，利用接枝聚合物在水溶液中电离出的正、负电荷之间静电力，通过自组装得到了聚电解质纳米粒子，并研究了其对水溶性抗癌药物5-氟尿嘧啶的负载和释放性能。

近年来，层状双氢氧化物(layered double hydroxides，LDH)独特的生物可降解性和利于细胞内化及药物释放的性质，使其在医药控释领域的应用成为研究热点^[23-26]。LDH是水滑石类无机物，层间有可交换的阴离子，粒径在12- 80 nm。化学组成可由[M²⁺1-xM³⁺x(OH)₂](A^n-)x/n表示，其中：0.2≤x≤0.33，M²⁺为2价金属阳离子；M³⁺为3价金属阳离子，这两种阳离子位于主体层板上的八面体空隙。An-是层间可交换的阴离子^[27]。药物可插入层间得到药物纳米杂化物(图1)，药物与层板间存在的静电作用、氢键作用及空间位阻效应可实现药物控释^[28-29]。层间阴离子可交换，PO₄^3-、HPO₄^2-、H₂PO^4-、CO₃^2-等无机阴离子与插层药物的LDH离子交换，可缓慢进入LDH层间，代替原来的药物阴离子，达到药物缓/控释效果^[30]。药物插层LDH缓/控释剂型相对传统药物剂型，减少了药物用量，提高了药物生物利用度，降低了毒副作用^[31]。但是，LDH在酸性环境下易发生层状结构崩裂，引起药物突释^[32]。

海藻酸钠/LDH可通过静电和氢键等作用实现药物控释。海藻酸钠良好的生物相容性和载药性能及LDH的离子可交换性，使得海藻酸钠/LDH作为5-氟尿嘧啶载体可提高药物的溶解度、生物利用度和稳定性；同时降低药物的胃肠毒副作用，起到缓释及pH敏感的功能^[33]。药物分子通过负电荷与带正电的海藻酸钠/LDH键合形成稳定的中性化合物，减小生物分子与带负电荷细胞膜之间的静电排斥作用，加快生物分子向细胞内的传递过程。刘若林等^[34]研究证明，改性海藻酸钠和LDH复合可形成稳定的水包油O/W乳液体系，对氯氟氰菊酯有稳定和缓释效果。

实验采用共沉淀法先合成LDH-5-氟尿嘧啶，再用凝胶法制备海藻酸钠/LDH-5-Fu凝胶珠，构建一种具有pH敏感性的海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶载药体系，以提高药物的生物利用度，降低毒性作用和不良反应；实验摸索了海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的制备方法，测试评价了海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的载药量、形态、粒径、体外缓释和抗肿瘤等性能，以期为LDH类无机纳米材料负载抗肿瘤类药物的新剂型研究提供技术支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计药物材料制备实验。

1.2 时间及地点实验于2016年5至12月在沈阳师范大学粮食学院创新中心及山西药科职业学院完成。

1.3 材料

实验用主要仪器：DDHZ-300台式恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂)；88-1型恒温磁力搅拌器(上海志威电器)；AL-204型电子天平；紫外-可见光谱Varian Cary 50；红外光谱仪(Nicolet Magna-IR 550Ⅱ )；场发射扫描电镜(日立S-4 800)；DZF-6 050型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；离心机(Hettich Universal 32)；MWCO14000透析袋(上海绿鸟生物科技)；超速冷冻离心机(Backman)；ELX800UV型酶标仪(BioTek)；TDL型CO₂培养箱(Thermo)；ELX800UV型酶标仪(BioTek)；SN-CT-1FD超净台(苏州净化)；Forma-86C超低温冰箱(Motic)；XW-80A涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)；TE2000-U显微镜(日本尼康)。

实验用主要试剂及细胞株：无水乙醇、无水氯化钙、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸(国药试剂集团，AR)；5-氟尿嘧啶(安耐吉化学，CP)；海藻酸钠(上海蓝季，脱乙酰度≥85%)；硝酸镁、硝酸铝、氢氧化钠(上海化学试剂公司 AR)；高纯氮(上海比欧西气体工业有限公司)；1640培养液(浙江吉诺)；小牛血清(浙江吉诺)；Trypsin-EDTA(浙江吉诺)；DMSO(上海国药，AR)；CCK-8(sigma)；SMMC-7721细胞株(实验室冻存)。

1.4 实验方法

1.4.1 LDH/5-氟尿嘧啶和海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的制备 LDH/5-氟尿嘧啶的制备按刘春霞等^[23]的方法。将一定量的5-氟尿嘧啶溶于30 mL去二氧化碳的蒸馏水中，使5-氟尿嘧啶终浓度为0.1 mol/L，再用1 mol/L的NaOH调溶液pH值为12.0。配制Mg(NO₃)₂•6 H₂O(0.512 8 g，0.002 mol)和Al(NO₃)₃•9 H₂O(0.375 g，0.001 mol) 的混合盐溶液，其中金属阳离子Mg/Al比例为2∶1。再将混合盐溶液在N₂下逐滴加入剧烈搅拌的5-氟尿嘧啶溶液中，保持温度40 ℃，不断加入NaOH溶液维持pH 值不变，继续搅拌3 h。沉淀过滤洗涤，于60 ℃恒温胶溶16 h，沉淀物用去二氧化碳离子水洗涤3次，备用。

海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的合成按Zhang 等^[33]的方法。将LDH/5-氟尿嘧啶用去二氧化碳的蒸馏水稀释到40 mL，漩涡振荡器混匀。取一定体积的LDH/5-氟尿嘧啶溶胶液，加入到20 g/L海藻酸钠溶液中，漩涡震荡 5 min，使得LDH/5-氟尿嘧啶溶胶液与海藻酸钠溶液的体积比分别为3∶5，4∶5，5∶5。将海藻酸钠和LDH/5-氟尿嘧啶混合液用4#针头逐滴加到20 mL 20 g/L CaCl₂溶液中，固化30 min，400目标准筛过筛，蒸馏水洗涤，室温干燥2 d，40 ℃真空干燥箱中过夜。

1.4.2 海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的分子结构与微观结构表征取干燥的海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠、LDH/5-氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶和海藻酸钠，分别在研钵中按样品量与溴化钾1∶100加入溴化钾粉末，均匀磨细，油压机80 Pa维持3 min。所得压片于波长范围为4 000- 500 cm^-1的Nicolet傅里叶变换红外光谱仪下进行分析。

取一定量的海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠，用导电胶粘到支持物上，然后喷金后用场发射扫描电镜，10 kV，放大倍数1 500下观察海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的形貌特征。

1.4.3 5-氟尿嘧啶标准曲线绘制配制2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 mg/L的5-氟尿嘧啶的PBS溶液(pH=7.4)。分别取3 mL溶液用紫外-可见光谱在265 nm处扫全谱，以265 nm处的吸收值为纵坐标，5-氟尿嘧啶质量浓度为横坐标，绘制5-氟尿嘧啶的标准工作曲线(图2)。得5-氟尿嘧啶得其回归方程：Y=0.059 7c-0.008 4(c为5-氟尿嘧啶的质量浓度，R²=0.999 8，n=11)。

1.4.4 海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠载药量测定取一定量干燥的海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠，放入 15 mL离心管中，加10 mL PBS(pH=7.4)，于37 ℃恒温摇床中100 r/min水平震荡24 h。5 000 r/min离心5 min后，检测上清液中5-氟尿嘧啶水平，按下述公式计算载药量^[35]：LC(%)=m₁/m₂×100%，其中LC为载药量；m₁为上清液中5-氟尿嘧啶质量(μg)；m₂为海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠的质量(μg)。

1.4.5 海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠在不同pH介质中的体外释放实验取一定量的海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠，放入生理溶液浸泡过的透析袋中，透析袋两端夹紧；精密量取PBS 50 mL(pH=7.4)，放入100 mL烧杯中；将装药透析袋移入装有溶出介质的烧杯中，保持漏槽状态，密封；将烧杯置于恒温震荡器内，(37±1) ℃下50 r/min水平震荡。定时取3 mL溶出介质，同时加入3 mL释放介质，紫外光谱分析介质中5-氟尿嘧啶水平，计算得出5-氟尿嘧啶浓度和药物释放率，以累积释放率和时间关系做体外释药曲线。再分别用pH=2.1的PBS和pH=4.6的10%磷酸盐-柠檬酸乙醇溶液测定5-氟尿嘧啶的释药率。

1.4.6 海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠对肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用考察海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠对肝癌SMMC-7721细胞的抑制效果^[36]。将SMMC-7721细胞用含体积分数10%小牛血清的1640培养液培养，以1.0×10⁴/孔的密度接种于96孔板中，每孔 100 μL。预培养24 h待细胞贴壁后，分别加入不同质量浓度的海藻酸钠、LDH-5-氟尿嘧啶和海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶悬混液(质量浓度分别为5，10，20，40 mg/L)作为实验组，每组3孔，以空白培养基为对照组，培养24 h后，每孔加入CCK-8(5 g/L)溶液20 μL，孵育4 h后弃上清，培养板水平振荡30 min，用酶标仪在520 nm测吸光度，按下式计算细胞抑制率：细胞抑制率(%)=[1-(样品A₄₉₀/对照A₄₉₀]×100%，其中样品A₅₂₀为加入样品后的细胞吸光度，对照A₅₂₀为空白水溶液对照的细胞吸光度。

1.5 主要观察指标海藻酸钠/LDH-5-氟尿嘧啶凝胶珠载药体系，考察其载药量、微观形貌、体外释放及对肝癌细胞的抑制效果。

1.6 统计学分析全部实验数据以SPSS 18.0进行分析。

计量资料以x(_)±s表示，进行独立样本t 检验；计数资料以卡方检验进行，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

海藻酸钠/层状双氢氧化物-五氟尿嘧啶载药体系的制备、释放及抗肿瘤特性分析

Preparation, release and antitumor properties of sodium alginate/layered double hydroxides-5- fluorouracil delivery system

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