N-己烷壳聚糖的制备、细胞毒性与凝血性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0775

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (22): 3520-3526.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0775

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N-己烷壳聚糖的制备、细胞毒性与凝血性能

刘梦媛¹，荆妙蕾¹，关静²，黄姝杰²，杨健²，李志宏²

¹天津工业大学纺织学院，天津市 300387；²军事医学科学院卫生装备研究所，天津市 300161

收稿日期:2018-01-20 出版日期:2018-08-08 发布日期:2018-08-08
通讯作者: 荆妙蕾，硕士，副教授，天津工业大学纺织学院，天津市 300387
作者简介:刘梦媛，女，1994年生，安徽省铜陵市人，汉族，2018年天津工业大学毕业，工程硕士，主要从事生物材料的止血性能研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31570956)

Preparation of N-hexane chitosan and its cytotoxicity and coagulation property

Liu Meng-yuan¹, Jing Miao-lei¹, Guan Jing², Huang Shu-jie², Yang Jian², Li Zhi-hong²

¹Department of Textile, Tianjin University of Technology, Tianjin 300387, China; ²Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300161, China

Received:2018-01-20 Online:2018-08-08 Published:2018-08-08
Contact: Jing Miao-lei, Master, Associate professor, Department of Textile, Tianjin University of Technology, Tianjin 300387, China
About author:Liu Meng-yuan, Master, Department of Textile, Tianjin University of Technology, Tianjin 300387, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31570956

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

细胞毒性：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长状况的方法。采用MTT比色法测试与材料作用后的L929细胞的增殖率，根据GB/T16886.5-2003确定材料的毒性等级。同时用荧光染色法对材料作用后的细胞进行染色，以期更加直观地反映材料的毒性作用。

凝血性能：通过全血凝固时间和流变测试来评价材料的凝血性能。通过观察全血凝固时间的长短，可以直观地评价材料的凝血性能。全血凝固时间越短，说明凝血效果越好。流变分为动态流变和静态流变。动态流变中弹性模量与黏性模量的比值越大，材料凝血效果越好。静态流变中，屈服应力越大，形成的凝胶强度越大。

背景：尽管壳聚糖是一种天然止血材料，但其对严重大出血创面的止血效果尚不明显，需要进一步的改性研究。且在壳聚糖中引入较短碳链的烷基(己烷)对凝血效果的影响也不明确。

目的：合成 N-己烷壳聚糖，研究其细胞毒性与凝血效果。

方法：还原氨化法制备N-己烷壳聚糖，傅氏转换红外线光谱分析仪、元素分析法完成结构表征；MTT比色法和荧光标记法测试其细胞毒性；全血凝固时间、流变性能和血浆凝固实验评价其凝血性能。

结果与结论：①傅氏转换红外线光谱分析仪、元素分析法均证实合成的产物是N-烷基化壳聚糖，取代度分别为8.67%，18.06%，32.88%；②MTT结果显示N-己烷壳聚糖的毒性分级是0级和1级。荧光染色表明与各组材料作用后，L929细胞生长旺盛，几乎无死细胞，提示明材料毒性作用小；③与壳聚糖相比，N-己烷壳聚糖具有明显促凝作用，且取代度越大其促凝作用越强。血浆凝固时间结果发现各组间活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间相比均无显著性差异(P > 0.05)，提示N-己烷壳聚糖不能促进凝血因子活化，其促凝机制有待于深入研究；④结果表明，通过还原胺化法合成了毒性较低、取代度介于8.67%-32.88%的N-己烷壳聚糖。与纯壳聚糖相比，N-己烷壳聚糖具有明显的促凝作用，且取代度越大，其促凝效果越好。

ORCID: 0000-0002-1625-5214(刘梦媛)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 壳聚糖, 烷基化, FTIR 测试, MTT, 荧光染色, 全血凝固, 静态流变, 动态流变, 生物材料, 血浆凝固, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Chitosan is a natural hemostatic material, but its hemostatic effect is limited and needs to be improved. Introducing alkyl groups into chitosan can modify its coagulation property. However, the coagulation mechanism of short alkyl groups that are grafted on chitosan powder is unclear until now.

OBJECTIVE: To study the cytotoxicity and coagulation property of the prepared N-hexane chitosan.

METHODS: N-hexane chitosan was prepared by reductive reaction and characterized by Fourier transform infrared spectroscopy and elemental analysis. Cytotoxicity of N-hexane chitosan was tested by MTT and fluorescence microscopy. Whole blood coagulation time, rheological properties and blood plasma coagulation time were evaluated for its coagulation effects.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) A series of N-hexane chitosans with substitution degree of 8.67%, 18.06%, and 32.88% were synthesized successfully. (2) MTT results showed that the toxicity of N-hexane chitosan was graded 0 and 1. Fluorescence staining results showed that L929 cells grew well on the materials and dead cells were scarcely visible, indicating the low toxicity of the materials. (3) N-hexane chitosan could promote blood clotting, and its blood coagulation efficiency was increased with its substitution degree. No significant difference was found in activated partial thromboplastin time, prothrombin time and thrombin time of N-hexane chitosans with different substitution degrees. N-hexane chitosan could not promote activation of clotting factors. Its mechanism for accelerating coagulation needs in-depth investigations. N-hexane chitosan, compared with pure chitosan, shows better clotting effect, and this effect is enhanced with the increasing of the substitution degree.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Cytotoxicity Tests, Immunologic, Hemorheology, Hemostasis

中图分类号:

R318

刘梦媛，荆妙蕾，关静，黄姝杰，杨健，李志宏. N-己烷壳聚糖的制备、细胞毒性与凝血性能[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(22): 3520-3526.

Liu Meng-yuan, Jing Miao-lei, Guan Jing, Huang Shu-jie, Yang Jian, Li Zhi-hong. Preparation of N-hexane chitosan and its cytotoxicity and coagulation property[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(22): 3520-3526.

图/表（结果） 8

2.1 FTIR测试不同取代度的N-己烷壳聚糖与壳聚糖原样的红外光谱如图3所示。与壳聚糖相比，烷基化改性后出现了新的烷基弯曲振动峰(约1 466 cm^-1)，同时烷基伸缩峰(2 800-2 900 cm^-1和2 900-3 000 cm^-1)的强度随着醛用量的增大而增强，表明烷基取代了壳聚糖氨基上的氢，且取代度随醛用量的增加而增大。同时壳聚糖氨基的氮氢键吸收峰增强，氨基的1 594 cm^-1吸收峰消失，证明反应发生在壳聚糖的氨基上，合成的产物是N-烷基化壳聚糖。

2.2 ¹H NMR测试图4是壳聚糖与N-己烷壳聚糖的 ¹H NMR图。壳聚糖的峰值分别为1.9(CH₃、CH3-CO-)、4.4(H1)、3.0(H2)、3.3-3.9(H3、H4、H5、H6)。C6的峰值分别为2.9-3.2(NH-CH₂-(CH₂)₄-CH₃)、1-2.0(NH-CH₂- (CH₂)₄-CH₃)和0.7(NH-CH₂-(CH₂)₄-CH₃)。说明己烷已成功接枝到壳聚糖的氨基上^[28]。说明实验采用的接枝方法可以成功制备出N-烷基化壳聚糖。

2.3 元素分析表2列出了N-己烷壳聚糖的投料比与取代度数值。由公式1可以测得壳聚糖的脱乙酰度约为69%。当投料比为32∶1时，N-己烷壳聚糖的取代度为9.67%；

当投料比为4∶1时，取代度为18.06%；当投料比为2∶1 时，取代度为32.88%。可看出N-己烷壳聚糖取代度与投料比密切相关，壳聚糖氨基与己醛比值越小，即己醛的用量越大，N-己烷壳聚糖取代度越大。

2.4 细胞毒性

2.4.1 细胞增殖率对照组细胞增殖率为100%，壳聚糖原样细胞增殖率为102.30%，N-己烷壳聚糖(C6a，C6b，C6c)的细胞增殖率分别为99.31%、96.45%、98.18%，说明细胞生长状态良好。研究结果表明，实验中N-己烷壳聚糖的合成方法不会造成有害有毒物质的残留。根据国标细胞毒性分级标准(GB/T 16886.5-2003)，细胞增殖率大于100%以及在80%-99%之间的材料，其毒性分级分别为0级和1级，因此可知N-己烷壳聚糖的毒性分级是0级和1级，证实合成的N-己烷壳聚糖是一种安全的生物材料^[29]。

2.4.2 荧光染色观察在荧光显微镜下显绿色的是活细胞染料SYTO-9；显红色的是死细胞染料碘化丙啶。各材料浸提液与细胞共同培养72 h后的荧光照片显示各组绿色荧光丰富，表明细胞生长良好；各组基本没有红色荧光，表明死细胞数量极少。MTT和荧光染色结果均表明各材料几乎无毒性作用，未引起大量活细胞死亡(图5)。

2.5 体外全血凝固时间纯壳聚糖、C6a、C6b、C6c分别和全血混合后测得的全血凝固时间如图6所示。由图可知，纯血、壳聚糖、C6a，C6b，C6c的凝固时间分别约为200，172，105，70，55 s。经Origin计算，壳聚糖与纯血相比没有显著性差异(P > 0.05)，C6a、C6b、C6c与纯血相比差异有显著性意义(P < 0.05)。C6a与壳聚糖相比没有显著性差异(P > 0.05)，C6b、C6c与壳聚糖相比差异具有显著性意义(P < 0.05)。结果表明N-己烷壳聚糖比纯壳聚糖促凝效果好，同时取代度越大，促凝效果越好。

2.6 流变学测试如图7所示，在动态流变实验中，模量是频率的函数。未加样品的全血显示出一种黏稠状态，在整个检测区域内，它的黏性模量G”均大于弹性模量G’，说明全血未形成凝胶。但相反地，样品与全血混合后呈现一个基本的物理凝胶弹性响应的典型特征：即在整个检测区域内，它的弹性模量G’均大于黏性模量G”，且两者都弱依赖于频率。壳聚糖原样与C6a、C6b、C6c的G’/G”分别为3.07、4.10、4.96、7.34，可知所有N-己烷壳聚糖的G’和G’/G”比值均大于壳聚糖原样，且随着取代度的增大而增大。说明N-己烷壳聚糖止血效果比壳聚糖原样好，且取代度越大，促凝作用越好。

如图8所示，在静态流变实验中，黏度是剪切应力的函数。可以看出全血的黏度恒定，大约是0.001 Pa.s。在低剪切力作用下，壳聚糖/全血的黏度大约为1 Pa.s，N-己烷壳聚糖/全血的黏度在60-100 Pa.s之间，而在剪切力增大到一个数值时黏度急速下降，表明这个应力是凝胶的屈服应力，这代表凝胶很难在低于这个值的压力下流动。壳聚糖原样与C6a、C6b、C6c的屈服应力分别约为0.6 Pa、 1.21 Pa、2.58 Pa、4.83 Pa，说明N-己烷壳聚糖使血液形成的凝胶更为牢固，且取代度越大，屈服应力越大，形成的血栓凝胶越牢固。

2.7 血浆凝固时间体外凝血指标分为活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间。图9是壳聚糖原料与N-己烷壳聚糖的活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间的测试结果。对照组是纯血浆所测得的结果。可知，纯血浆和分别与壳聚糖、N-己烷壳聚糖混合的血浆，其活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间测试结果两两相比均无显著性差异(P > 0.05)。结果表明壳聚糖与N-己烷壳聚糖对体外凝血指标没有影响，提示壳聚糖与N-己烷壳聚糖并不是通过传统的内、外源性凝血途径来促进血液凝结。

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引言

手术治疗、战场受伤和日常生活中遇到突发性事故导致创伤出血不可避免，过度失血会致死。止血日益成为医学界的研究热点。目前，常见的止血材料有沸石、纤维蛋白胶、氧化纤维素等，这些材料虽然止血效果较好，但又存在各自的缺陷。如沸石在吸收血液中的水分后会放出大量的热；纤维蛋白胶会引发病毒感染；氧化纤维素的生物降解性欠佳等^[1-4]。因此，开发出一种具有良好生物相容性、止血效果快的生物医用新材料非常重要。

壳聚糖是脱乙酰化后的甲壳素，又称甲壳胺，是一种高含量、低成本的多糖，在生物界中广泛存在于虾、蟹等动物的壳中，具有良好的生物相容性和生物降解性，无毒无味，物理和化学性质相对稳定^[5-7]。由于壳聚糖具有良好的生物黏附性和抗菌止血能力，常常用做止血剂使用^[8-10]。然而由于纯壳聚糖止血效果不是很明显，TraumaStat等止血剂只能用于小面积创面止血，对一些严重的大出血创面，其止血效果仅与普通脱脂纱布相当^[11-13]。故需对壳聚糖材料进行改性，以提高其凝血性能。壳聚糖的结构中有大量可修饰的羟基和氨基，为壳聚糖的改性设计奠定了基础^[14-16]。其中，壳聚糖的氨基和高级脂肪醛的反应活性大，反应速率快，是一种常用的改性方法。

目前关于烷基化壳聚糖对凝血性能的影响的研究主要集中在N-十二烷基和N-十八烷基壳聚糖。黄玉芬等^[17]在壳聚糖中引入十二烷基，发现16%N-十二烷基壳聚糖体外止血效果最好，40%烷基化壳聚糖体内止血效果最佳。Dowling等^[18]制备了取代度为2.5%的N-十八烷基苯壳聚糖粉末，研究表明该烷基化改性壳聚糖的凝血性能得到显著提高。Dowling等^[19]制备了十八烷基止血泡沫，严重肝损伤出血创面模型显示，该泡沫可快速止血，减少失血，并增加生存率。以上研究均表明只有长链烷基的壳聚糖可以提高凝血性能。但高分子量的醛多为固体，不易与壳聚糖发生反应，并且反应后不易除去多余的醛，影响材料的安全性。而目前对于在氨基上引入较短碳链如己烷以及不同取代度对烷基化壳聚糖凝血性能的影响，研究非常少^[20]。

当前研究综合以上文献的制备和测试方法，成功通过还原胺化法制备出一系列具有不同取代度的N-己烷壳聚糖，通过傅氏转换红外线光谱分析仪(Fourier Transform infrared spectroscopy，FTIR)验证了其主要官能团，通过材料浸提液与L929细胞共培养，检测了N-己烷壳聚糖的细胞毒性。最后采用全血、血浆凝固实验和流变实验来研究N-己烷壳聚糖的凝血效果以及作为生物止血材料的可能性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点于2016年9月至2017年6月在军事医学科学院卫生装备研究所有机合成实验室完成。

1.3 材料壳聚糖(M_r 98 000，山东奥康)；己醛、L929细胞购自天津瑞博星生物科技有限公司。

血液来源：由军事医学科学院动物中心(许可证号：SCXK(军)2012-0004)提供的5只成年雄性新西兰大白兔，体质量为2.3-2.5 kg。首先对兔子进行麻醉，对其进行心脏取血，之后以9∶1的比例加入抗凝剂柠檬酸钠，混匀，得到抗凝全血。

实验用主要试剂和仪器：FTIR测试仪(德国Bruker公司)；元素分析仪(PerkinElmer股份有限公司)；MTT试剂盒(美国Sigma公司)；DMEM培养基(Gibco，美国)；荧光显微镜(FM，日本)；活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间试剂盒(上海太阳生物技术有限公司)；半自动凝血仪(SYSMEXCORPRSTION，日本)。

1.4 方法

1.4.1 N-己烷壳聚糖的制备壳聚糖上的氨基化学性质较活泼，在酸性条件下可与醛基发生还原胺反应，生成Schiff碱。但Schiff碱在酸性环境中不稳定，需经过氰基硼氢化钠还原生成稳定的N-烷基化壳聚糖粉末^[21]。反应过程如图1所示，制备过程如图2所示。将2 g壳聚糖溶于200 mL体积分数1%醋酸溶液中，根据己醛与壳聚糖氨基的不同比例加入适量己醛，搅拌12 h，加入10%氢氧化钠溶液调节反应液pH至5，缓慢加入氰基硼氰化钠(氰基硼氰化钠与醛的比例为1∶1)，搅拌2 h。为加快反应速度，以上实验均在60 ℃水浴锅中进行。再用10%氢氧化钠溶液调节反应液pH至9左右，使其沉淀，用酒精将沉淀物反复洗涤，以除去多余的无机物和醛，同时用蒸馏水反复洗涤至中性，再经冻干即可得到最终产物，样品C6a，C6b，C6c^[22-23]。己醛与壳聚糖的投料比如表1所示。由于己醛是与壳聚糖上的氨基发生反应，因此投料比是指脱乙酰后的壳聚糖中的氨基量与醛基量的比值。

1.4.2 FTIR测试采用KBr压片法，将待测样品与溴化钾粉末混合，研成细碎粉末，制成半透明的自支撑薄片，将其放入仪器中测试光谱范围在400-4 000 cm^-1内的波长，通过origin软件作图，比较不同样品的图谱。

1.4.3 ¹H NMR测试利用核磁共振仪记录下原子在共振下的有关信号绘制的图谱，推测原子在碳骨架上的位置。取10 mg样品放在试管中，分别取0.9 mL氘代重水和 0.1 mL氘代盐酸加入试管中，使样品充分溶解。要求溶液澄清、透明，无其他杂物。最后将溶液放入仪器中进行测试，得到样品的¹H NMR谱图。

1.4.4 元素分析首先通过元素分析仪测定不同材料在同一环境下C、N元素的含量，再按照公式1、公式2分别计算壳聚糖的脱乙酰度和N-己烷壳聚糖的取代度^[24]。

式中x为壳聚糖脱乙酰度；DS为烷基取代度；C、N分别为测得的C、N元素百分含量；n为烷基醛中C原子的个数，这里n=6。

1.4.5 细胞毒性测试

细胞增殖率测试：将待测样品浸没在DMEM培养液 (4 g/L)中，于孵箱(体积分数5%CO₂，37 ℃)中孵育24 h后，移除材料，得到待测样品浸提液。于孵箱中放置24 h的纯DMEM作为对照组。将L929细胞接种在96孔板中，加入含青霉素、链霉素和体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，于培养箱(体积分数5%CO₂，37 ℃)中孵育24 h后，实验组用浸提液替换培养液，其他组用相应液体替换，继续培养72 h。然后加入MTT溶液(5 g/L)，4 h后，弃去孔内液体，在每孔中各加入150 μL 二甲亚砜溶液来溶解甲瓒的晶体。比较570 nm和655 nm处待测试样的吸光度值，并计算其差值^[25-26]。可通过以下公式计算细胞相对增殖率：

式中RGR为相对增殖率；A为实验组吸光度差值的均值；A₀为对照组吸光度差值的均值。

细胞毒性的荧光染色观察：参照细胞增殖率测试，将L929细胞在各组浸提液中培养，72 h后，加入10 μL碘化丙啶和SYTO9进行细胞染色，之后继续在室温下培养 20 min，通过荧光显微镜观察细胞的染色情况。

1.4.6 全血凝固时间检测取5 mg样品放入试管中， 37 ℃下放置3 min，于试管中加入1 mL抗凝血(取新鲜血液，以9∶1的比例加入抗凝剂柠檬酸钠)，继续在37 ℃下孵育3 min，后加入775 μL CaCl₂溶液(25 mmol/L)，同时开始计时，随后每隔10 s将试管倾斜90°，观察凝血情况，在血液完全凝固时停止计时，所经过的时间即为全血凝固时间。每个样品重复3次。

1.4.7 流变学研究采用锥板式流变仪(d=20 mm，α=4°)，在37 ℃下进行动态和静态流变实验。动态流变是指在一定温度下，固定剪切速率，改变频率，以获得弹性模量(G’)和黏性模量(G”)。根据动态应变扫描确定了样品的线性粘弹性状态下的动态频率谱。静态流变是在一定温度下固定频率，改变剪切速率，研究样品的流变性能随剪切速率的变化规律。取5 mg样品与1 mL健康抗凝全血快速混合均匀，取260 μL混合液置于流变仪两板之间，在 1-1 000 r/min和0-20 Pa范围内进行模量和黏度测试。

1.4.8 血浆凝固时间测定采用半自动化凝血分析仪进行测试。取抗凝血以1 500 r/min离心15 min，上清即为贫血小板血浆。称取2 mg样品与100 μL 贫血小板血浆均匀混合，在37 ℃下孵育15 min，然后分别添加活化部分凝血活酶时间(1 mL)、2 mL凝血酶原时间(2 mL)、凝血酶时间(2 mL)试剂盒在凝血仪中进行测试，每个样品重复3次^[27]。

1.5 主要观察指标 ①N-己烷壳聚糖对细胞增殖率的影响；②N-己烷壳聚糖对细胞生长情况的影响；③N-己烷壳聚糖材料的全血凝固时间；④N-己烷壳聚糖的模量和黏度；⑤N-己烷壳聚糖的血浆凝固时间。

1.6 统计学分析采用Origin 8软件对实验结果进行F 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

材料能否进行临床应用，生物安全性对其有很大的影响。细胞增殖率是检测材料生物安全性的有效方法。材料细胞增殖率测试结果和国标细胞毒性分级标准表明，N-己烷壳聚糖的毒性分级是0级和1级，毒性极小，是一种安全的生物材料。另外细胞荧光染色能够更加直观地反映了材料的细胞毒性状况。细胞荧光照片显示细胞生长旺盛，几乎没有死细胞，与细胞增殖实验结果一致，进一步说明N-己烷壳聚糖是一种无毒的生物材料。

在全血凝固实验中，通过观察血液的凝固时间长短，可以直观地评价材料的凝血性能。凝血时间越短，表示材料的促凝效果越好。N-己烷壳聚糖与全血和壳聚糖相比，明显缩短了凝血时间，并且取代度越大，凝血时间越短。说明N-己烷壳聚糖具有促进凝血的能力，并且凝血效果比纯壳聚糖好，同时取代度越大，凝血效果越好。

N-烷基化壳聚糖止血作用的假设机制包括使疏水烷基链插到血细胞膜上，因此血细胞将会被生物聚合物链连接成一个凝胶网络，这可能会引起凝血^[30]。实验通过流变学来验证这一假说。流变分为动态流变和静态流变。动态流变中弹性模量G’(黏性模量G”)指材料在发生形变时，由于弹性(黏性)形变而储存(损耗)的能量大小，反映材料弹性(黏性)的大小。当G’远大于G”时，材料主要发生弹性形变，材料呈固态。G”远大于G’时，材料主要发生黏性形变，材料呈液态；G’与G”相当时，材料为半固态^[31]。在动态流变实验中，纯血G”大于G’，血液呈流动状态。材料-血液混合物的G’均大于G”，表明血液凝固形成了凝胶。不同取代度的N-己烷壳聚糖的G’和G’/ G”比值均大于纯壳聚糖，且G’和G’/G”比值随着取代度增大而增大。表明与纯壳聚糖相比，N-己烷壳聚糖具有更好的凝血能力，且取代度越大，越易形成凝胶网络，凝血效果越好。静态流变实验不仅可以表征材料黏度随剪切速率的变化规律(剪切变稀，剪切增稠)，而且可以确定样品的屈服应力。实验结果表明N-己烷壳聚糖的屈服应力均大于纯壳聚糖，且取代度越大，屈服应力越大。说明N-己烷壳聚糖使血液形成的凝胶更为牢固，且取代度越大，凝胶强度越高。

根据凝血瀑布机制，凝血过程一般分为内源性凝血途径、外源性凝血途径和共同凝血途径。为证明N-己烷壳聚糖的凝血途径，对其进行血浆凝固时间测试。活化部分凝血活酶时间一般被认为是评价内源性凝血系统的有效方法。凝血酶原时间主要反映外源性凝血性能。凝血酶时间是测定共同凝血途径中纤维蛋白原转换为纤维蛋白的过筛实验^[32]。实验中各样品所测得的活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间与对照组相比，无显著性差异。说明壳聚糖与N-己烷壳聚糖并不是通过传统的内、外源性凝血途径来促进血液凝结。

但实验存在一些不足：尚未探索出得到更大取代度的条件，未制备出更高取代度的N-己烷壳聚糖；对N-己烷壳聚糖仅仅进行了细胞毒性，还应该完成皮肤刺激和致敏实验，以全面评价其生物安全性。

综上，通过还原胺化法合成了毒性较低、取代度介于8.67%-32.88%的N-己烷壳聚糖。与纯壳聚糖相比，N-己烷壳聚糖具有明显的促凝作用，且取代度越大，其促凝效果越好。其促凝作用并不是通过传统的内、外源性凝血途径达到的。可能是由于材料对血细胞的聚集、活化作用引起的。N-己烷壳聚糖的促凝机制还有待于进一步研究。实验研究了取代度对N-己烷壳聚糖凝血效果的影响，并探究了其细胞毒性及其作用机理，丰富了N-己烷壳聚糖的理论研究。研究成果对于开发性能更加优异的新型止血材料具有较大应用价值，在生物止血材料的研究方面具有重大意义。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

N-己烷壳聚糖的制备、细胞毒性与凝血性能

Preparation of N-hexane chitosan and its cytotoxicity and coagulation property

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