改良富血小板血浆复合纳米材料修复颌骨贯穿性缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0918

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

富血小板血浆：是全血经过浓集、分离而得到的提取物，主要含大量的纤维蛋白原、高浓度的血小板及其脱颗粒后产生的高浓度的各类生长因子，天然比例的高浓度生长因子通过网络化的调节发挥协同作用，提供一个利于软组织和骨组织修复的微环境。

纳米羟基磷灰石胶原/骨形态发生蛋白复合材料：是清华大学材料系崔福斋教授课题组发明的羟基磷灰石/胶原仿生骨材料的更新产品，具有骨诱导能力且自身可控降解的、复合骨形态发生蛋白的胶原基生物活性骨组织工程支架材料，在复合支架材料逐渐被吸收的同时并可在局部逐渐释放骨形态发生蛋白，诱导骨膜成骨，诱导骨形成。

背景：借助骨组织工程学的研究思路，把骨膜组织中骨原细胞等作为“种子细胞”，附加上纳米支架材料及生长因子，修复骨缺损。

目的：通过检测血小板含量证实二次离心法改良制备富血小板血浆的可行性，比较不同材料在不同时期的成骨效果，探索以自体骨膜、自体活性因子附加材料修复骨缺损的新途径。

方法：18只新西兰大白兔随机分为空白组、单纯材料组、活性材料组，每组6只。活性材料组兔子造模前1 d取血，制备富血小板血浆，复合nHAC/BMPs活性材料。制备新西兰大白兔右侧下颌骨体部贯穿性矩形骨缺损模型，空白组不植入材料，材料组缺损区添加单纯材料，活性材料组缺损内植入nHAC/BMPs/富血小板血浆，造模后4，8，12周分别处死实验动物，取下颌骨标本行大体观察、影像学检查、扫描电镜、组织学观察，计算缺损区新骨面积，比较各组骨缺损的修复情况。

结果与结论：①成功构建贯穿性骨缺损动物模型并有效提取富血小板血浆；②大体和影像学观察：单纯材料和活性材料组缺损区影像学观察在各个时间段均优于空白组；③电镜观察：空白组边界区主要由纤维组织包绕，单纯材料组边界区存在少量新生骨，散在分布，活性材料组连接的纤维组织更致密，新骨呈片状分布；④组织学观察可见各材料组不同时间点骨缺损区新骨形成均优于对照组，活性材料组新生骨及新生血管的量较多。随时间延长，材料降解同时被活跃生长的骨组织包围并替代；⑤4周时各组新生骨面积排列为空白组 < 单纯材料组 < 活性材料组，差异有显著性意义；8，12周时空白组新骨面积显著少于其他2组(P < 0.05)，单纯材料与活性材料组之间无明显差异(P > 0.05)；⑥结果提示，nHAC/BMPs在体内实验过程中有良好的生物相容性和骨诱导活性，可作为支架材料引导再生骨向缺损内生长，富血小板血浆有助于诱导并促进活性材料成骨，促进骨缺损修复。

ORCID: 0000-0002-2009-4142(谢利娜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨膜, 纳米材料, 富血小板血浆, 骨缺损, 成骨, 骨修复, 活性材料, 生物相容性, 新生骨面积, 骨诱导

Abstract:

BACKGROUND: With the help of bone tissue engineering, osteogenitor cells from the periosteum taken as “seed cells” are combined with nano-scaffold materials and growth factors to repair bone defects.

OBJECTIVE: To explore the feasibility of reproducing platelet-rich plasma (PRP) using secondary centrifugation method through detecting platelet content, and to compare the osteogenic effects of different materials in different periods in order to explore new ways to repair bone defects with autologous periosteum and autologous active factors.

METHODS: Eighteen New Zealand white rabbits were randomly divided into blank group, pure material group and active material group (n=6 per group). The PRP was prepared 1 day before operation, and the active materials were prepared with nano-hydroxyapatite/collagen/bone morphogenetic proteins (nHAC/BMPs). A rectangular penetrating bone defect animal model was made in the right mandibular body of each New Zealand white rabbit followed by implantation of pure materials, nHAC/BMPs/PRP and nothing in the pure material group, active material group and blank group, respectively. Experimental animals were executed at 4, 8 and 12 weeks after surgery. The mandible specimens were taken and compared among groups through radiography, scanning electron microscopy, and histological observations as well as new bone area calculation in the defect area.

RESULTS AND CONCLUSION: The animal model of penetrating bone defect was successfully constructed and PRP was extracted effectively. The profile and imaging observations of the defect area showed better results in the pure material and active material groups than the blank group at each time. Under the scanning electron microscope, the boundary area of the blank group was mainly surrounded by fibrous tissues; there was a small amount of new bone in the boundary area of the material group; and the fibrous tissue of the active material group was dense and the flaky distribution of new bone was observed. The histological observation showed that the new bone formation in the bone defect area was superior in the material groups than that in the blank group, and there were more new bone and blood vessels in the active material group. Over time, the degraded material was surrounded and replaced by an active bone tissue. The area of new bone at 4 weeks after implantation was ranked as follows: blank group < pure material group < active material group, and there were significant differences between groups. The area of new bone in the blank group was significantly lower than that in the material groups at 8 and 12 weeks after implantation (P < 0.05), while there was no difference between two material groups (P > 0.05). To conclude, the nHAC/BMPs has good biocompatibility and osteoinduction activity in vivo, and it can be used as a scaffold material to guide the growth of regenerated bone tissue to the defect. PRP helps to induce and promote the osteogenesis of active materials and promote bone defect repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Platelet-Rich Plasma, Biocompatible Materials, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

谢利娜，赵波，陈苑，景向东. 改良富血小板血浆复合纳米材料修复颌骨贯穿性缺损[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(22): 3513-3519.

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图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验动物均健康存活直至处死，18只新西兰大白兔均进入结果分析。

2.2 富血小板血浆制备结果改良二次离心法制备富血小板血浆，血小板计数表明血小板浓度为全血4.86倍。采用双抗体夹心法测定PDGF-AB的质量浓度，二次离心法组中的PDGF-AB的质量浓度为(536.24±89.37) ng/L，全血浆组中PDGF-AB的质量浓度(69.158±9.836) ng/L，富血小板血浆中的PDGF-AB的质量浓度是全血浆组的7.75倍，其差异有显著性意义(P < 0.01)，为有效富血小板血浆。

2.3 动物健康状况造模后第1，2天所有兔精神、饮食稍差，活动较之前少，无畏寒发热征象，术区无异常分泌物，全身未见皮疹，3 d后各项活动基本正常。

2.4 标本剖面大体及影像学观察以4周为例，空白组中央有缺损空洞，单纯材料组缺损区主要为纤维组织，活性

材料组颊、舌侧表面可见部分骨皮质形成，周围纤维组织增生，少量新骨延伸至缺损中央；影像学检查显示空白组缺损区中央低密度影，单纯材料组和活性材料组可见材料轮廓，材料与宿主骨边界线较空白组模糊，活性材料组密度较高(图3)。

2.5 扫描电镜观察造模后4周，空白组边界区由纤维结缔组织构成，存在空隙，单纯材料组和活性材料组缺损边界由材料和纤维充填，材料表面可见基质样物质形成，散在少量新骨形成。12周时空白组边界区纤维组织更致密，周围空隙更小，单纯材料组边界较活性材料组明显，可见新骨由缺损边缘沿材料间隙成条索状，活性材料组延伸至缺损中央及材料内，并逐渐成片状分布，新骨面积逐渐增多，材料内部亦可见片状新骨(图4)。

2.6 组织学观察造模后4周缺损区成骨情况：空白组缺损区由大量纤维组织、成纤维细胞构成，中央未见成骨；单纯材料组缺损区内由材料、纤维组织及新生骨组织构成，材料之间可见条索状新骨形成；活性材料组缺损区内由材料、纤维组织及新生骨组织完全充填，材料之间有网格状新生骨形成，骨量明显增多。造模后8周空白组缺损边缘可见新骨向中间延伸，单纯材料组缺损区内由材料、纤维组织及新生骨组织填充，材料之间为条索状的新生骨组织，活性材料组缺损区由材料、新生骨和纤维组织填充，材料之间可见片状的新骨形成，分布较广，骨量明显增多；造模后12周空白组缺损中央可见条索状、水滴状的新骨形成，大量纤维组织由脂肪组织替代，单纯材料组缺损区由材料、新生骨组织、纤维组织及少量脂肪组织充填，材料之间为新生骨组织延伸成长条形，骨成熟度增高，活性材料组缺损区由材料、新生骨、纤维及少量脂肪组织填充，大面积片状的新生骨组织，骨组织逐渐成熟，材料进一步降解，残留的材料被活跃生长的骨组织包围并替代，新生骨量增多(见图5)。

造模后4周材料内部成骨情况：空白组由大量纤维组织、成纤维细胞构成；单纯材料组材料之间成骨样反应，材料边缘可见新生骨或类骨质包绕材料颗粒，不连续；活性材料组材料颗粒有新生骨形成，骨量明显增多，材料边缘新生骨组织伴新生血管条索状连续生长。造模后8周材料内部成骨情况：空白组缺损中央可见少量散在梭形新骨和新生血管形成；单纯材料组材料之间为片状的新生骨，缺损周边的骨组织伸入材料内与材料内的骨组织连接，材料颗粒少量由骨组织替代；活性材料组材料之间可见片状的新骨形成，分布较广，材料边缘可见连续性新骨形成并伸入到材料内，材料颗粒部分由骨组织完全替代，骨量增多。造模后12周材料内部成骨情况：空白组缺损中央可见条索状新骨伴新生血管形成；单纯材料组材料之间为长条形骨组织，材料颗粒近1/5完全被骨组织替代并连接成片，骨成熟度增高；活性材料组可见大面积片状的新生骨组织，材料降解被活跃生长的骨组织包围并替代，新生骨量明显增多，材料颗粒近1/3被骨组织替代并连接成片，新骨轮廓与原来材料一致(见图6)。

2.7 新骨面积统计新骨面积统计结果，4周时3组间有显著性差异，8和12周时空白组新骨面积显著少于其他2组 (P < 0.05)，单纯材料与活性材料组之间无明显差异(P > 0.05) (图7)。

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引言

临床中各种原因导致的骨缺损形态往往不规则，骨移植材料已成为仅次于输血的需求量最大的移植物，同时，骨移植存在需要增加术区、增加手术创伤、塑形困难、移植骨段不能满足种植的三维需要及供区术后并发症等诸多缺点^[1-2]。骨的一个重要的生理特性是新骨为不断重塑的过程，因此，植入生物活性材料的降解速度与新生骨组织的形成应保持动态平衡，骨缺损的修复依赖于骨组织的再生而不是人工骨材料的替代^[3]。随着骨组织工程学的不断进步和材料的更新，采用“复合”手段制备骨支架材料是一种有效的方法^[4]。借助骨组织工程学的思路，在保留骨膜(种子细胞)的前提下，引入自体富血小板血浆，在缺损空间内加入改良纳米羟基磷灰石胶原/骨形态发生蛋白(nano- hydroxyapatite/collagen/bone morphogenetic proteins，nHAC/BMPs)活性复合材料，修复骨缺损既符合经典的组织工程方法修复骨缺损模式，又可灵活应用自体骨膜和自体生长因子，减小创伤也避免免疫排斥等可能。

富血小板血浆是通过离心全血后得到的血小板浓缩物，天然比例的高浓度生长因子分别或相互协同通过网络化的调节发挥作用，促进成骨细胞、间充质细胞的增殖，增加胞外基质合成，提供一个利于成骨的微环境，从而达到骨再生和重建^[5-6]。因此，富血小板血浆在骨缺损修复中的应用获得了实验和临床病例的支持，现在已成功将结合自体骨、骨修复材料及其他生物工程材料形成复合材料对骨缺损进行修复，促进骨形成短期与长期均取得满意的效果^[7-9]。富血小板血浆在口腔临床的应用包括：颌骨缺损、牙周、种植体周围骨量不足、上颌窦提升等^[10-13]。现在普遍认为只要能达到全血血小板浓度的3.8倍以上或更高，就可发挥相应的生物学效应^[14]。

前期大量研究已证实骨膜、纳米羟基磷灰石胶原/聚乳酸在骨修复过程中的作用^[15]。清华大学崔福斋教授课题组成功研制出一种新型的纳米级羟基磷灰石胶原和聚L-乳酸构成的新型骨组织工程材料，其构成和分级的微观结构都类似天然骨组织，显示其广阔的临床应用价值^[16-18]。当前课题根据功能仿生的思路，制备具有骨诱导能力且自身可控降解的、复合骨形态发生蛋白的胶原基生物活性骨组织工程支架材料——nHAC/BMPs复合支架材料。该材料是清华大学材料系崔福斋教授课题组发明的羟基磷灰石/胶原仿生骨材料的更新产品，符合Hench教授在《Science》上所展望的，具有生物活性且自身降解的第3代生物材料的发展方向^[19]。良好的支架材料可以通过材料降解吸收为骨形态发生蛋白2等活性因子提供缓释作用，在复合支架材料逐渐被吸收的同时并可在局部逐渐释放骨形态发生蛋白，保证骨形态发生蛋白2在体内特定部位的有效浓度，而且还可为成骨细胞提高黏附，良好的孔隙率和三维结构也为新骨长入提供成骨空间，可望加速骨膜成骨的速度及增加成骨量。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2016年9月至2017年8月在广州中医药大学动物实验中心及重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验用主要仪器和试剂 nHAC/BMPs由清华大学材料系崔福斋教授课题组提供，电子天平，AnKe离心机(拓赫机电科技(上海)有限公司)，离心管，移液管，计数板，显微镜，口腔用数码X射线片机，切片机，染色工具、JSM-6460LV电镜(日本，JEOL公司)、显微镜、DIA-2000病理图像分析系统(武汉大学)，盐酸氯胺酮注射液(2 mL/支，0.1 g，江苏恒瑞医药股份有限公司，批准号：H35020148)，常规苏木精-伊红染液，三色法染液(Sigma)。

1.3.2 实验动物选用健康新西兰大白兔18只，购自中国农业科学院实验动物研究所，批号：2016-0158，雌性，6月龄，体质量2.5-3.0 kg。18只新西兰大白兔按照随机数字表法分为空白组、单纯材料组、活性材料组，每组6只。经饲养1周观察健康状况良好，实验期间选用标准混合饲料喂养，编号分笼饲养。

1.4 方法

1.4.1 制备富血小板血浆及nHAC/BMPs/富血小板血浆活性材料术前1 d活性材料组动物由心脏取血，枸橼酸钠抗凝，按二次离心法制备兔富血小板血浆(图1)，具体步骤为：第1次离心半径13.5 cm，3 650 r/min，6 min；吸取包括全部上清液及交界面下3 mm以上内容物，移至离心管，平衡后再次离心，离心半径13.5 cm，3 000 r/min，6 min吸取约3/4上清液弃掉，剩余约0.8 mL摇匀，即为富血小板血浆。血小板计数并与全血比较，采用ELISA双抗体夹心法检测其中血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)的质量浓度。所有操作步骤以试剂盒的说明为准(兔血小板衍生生长因子ELISA试剂盒购自上海乔羽生物公司)，用封板膜封板后置37 ℃温育30 min，将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后配液备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干，每孔加入酶标试剂50 μL)，所有标准品、样品做双份检测，酶联免疫检测仪上震动孔板30 s，在 450 nm处读取吸光度值，画出标准曲线，根据样品吸光度值查出相应PDGF的质量浓度，再乘上稀释倍数即可，验证富血小板血浆有效浓度。富血小板血浆移至含有凝血酶及10%CaCl₂的促凝管中，22 ℃恒温保存，第2天附加nHAC/BMPs，抽真空，制备nHAC/BMPs/富血小板血浆活性材料。

1.4.2 建立颌骨贯穿性缺损动物模型新西兰大白兔氯胺酮0.2 mL/kg耳后肌肉注射方法全麻成功后，右侧颌下区脱毛备皮，左侧卧位，常规消毒，铺巾，沿下颌骨下缘走行做长约2.0 cm切口，依次切开皮肤、皮下组织、肌层直达骨膜，将骨膜从下颌骨下缘处切开，小心剥离下颌角区附着肌肉，游离颊舌侧骨膜，分别向两侧锐性剥离骨膜瓣直达牙槽嵴顶，在此将骨膜完整与下颌骨剥离，剥离时小心谨慎，避免穿破骨膜造成骨膜的连续性缺失，充分暴露下颌骨体部中段，用电机磨出10 mm×8 mm贯穿性全层矩形骨缺损(图2)，单纯材料组植入nHAC/BMPs，活性材料组植入nHAC/BMPs/富血小板血浆，空白对照组不植入材料，造模后4，8，12周分别处死各组2只动物进行后续实验。

1.4.3 检测指标取下颌骨标本，行大体观察、影像学检查、扫描电镜、组织学观察，比较各组骨缺损的修复情况。

大体剖面和影像观察：切取下颌骨标本缺损区骨块，去除软组织，大体观察骨缺损区表面变化；缺损区组织块行颊舌向正位X射线片(投照距离20 cm，投照条件(70 kV，60 mA，曝光时间0.112 s)，观察成骨情况。

扫描电镜观察：将缺损区舌侧组织块行梯度乙醇脱水、干燥、喷金处理，JSM-6460LV电镜观察缺损边界区成骨情况。

组织学观察：缺损区颊侧组织块固定、脱水，氯仿透明、树脂浸透、切片，行苏木精-伊红染色，在显微镜下观察。新骨面积计量具体步骤如下：采用DIA-2000病理图像分析系统，选择缺损区4个角和中央固定5个视野进行图像采集计量总和，每个标本平均为3张切片，累计后每组取平均值。

1.5 主要观察指标 ①标本剖面大体及影像学观察；②缺损边界区的扫描电镜观察；③缺损区及材料内成骨情况；④各组新骨面积的比较。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，所有资料均以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析方法。P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

随着纳米技术的发展，纳米载体的控释系统相对于传统材料显示出更为明显的优势，研究的方向是将不同的材料复合取得合适的降解速度，增强成骨能力^[20]。近年来国内外关于富血小板血浆、纳米羟基磷灰石材料及骨形态发生蛋白诱导/引导成骨的报道不少。骨形态发生蛋白被公认为骨生长信号，在诸多因子中唯一能够单独诱导骨组织异位成骨^[21]。有学者通过兔体内植入实验进行验证，骨缺损处植入含有短肽P-17-BMP-2的nHAC/PLLA材料后有大量骨细胞和骨连接形成，说明负载新型短肽的骨修复材料具有良好的骨诱导性和骨传导性。研究证实富血小板血浆能促进颌骨囊肿、牙槽嵴裂骨缺损修复，促进拔牙术后牙槽窝愈合，促进下颌骨的形成速度与成熟度。同时，富血小板血浆具有良好的成骨效果，起到了良好的“撑起”软组织的效果，进而实现了种植美学区域良好的美学效果。富血小板血浆联合人工合成羟基磷灰石较单独人工合成羟基磷灰石应用在即刻种植体周围骨组织及牙周骨组织修复中具有很好的效果^[22-25]。

当前实验由骨膜+nHAC/BMPs+富血小板血浆构建组织工程骨，修复骨缺损既符合经典的组织工程方法修复骨缺损模式，又可灵活应用自体骨膜和自体生长因子，其基本出发点是以“诱导成骨”的方式而不是单纯以“爬行替代”的方式实现骨再生。该组织工程骨保留自体骨膜，提取自体富血小板血浆，尽可能减少外源性植入物可能存在的毒性及免疫排斥；采用的nHAC/BMPs复合支架材料是羟基磷灰石/胶原仿生骨材料的更新产品，具有生物活性且自身降解的第3代生物材料的发展方向，目前关于该材料应用于动物实验及临床鲜有报道，联合应用富血小板血浆等的报道国内外均未见。

当前实验血小板计数表明血小板浓度提高4.86倍，激活后富血小板血浆中的PDGF-AB的浓度是全血浆组的7.75倍，均在有效范围。实验第4周时3组间新骨量具有显著性差异，而8周后单纯材料和活性材料组新增骨量不明显，分析原因可能是：国外研究认为富血小板血浆中生长因子直接发挥其生物学效应的时间为5 d之后，富血小板血浆激活后产生的PDGF等因子释放后协同作用，促进血管生成，血管化非常有利于新骨的形成，这也就提示富血小板血浆具有更好的骨诱导作用，4周时血管化明显进一步促进了成骨^[26-27]。与此同时，制备贯穿性骨缺损过程中截断了牙根，断根的位置不一致也可以解释同组间不同个体的成骨效果存在差异，成骨效果好的个体可能断根断端提供的血运丰富，进一步激活富血小板血浆产生各类生长因子^[28]。因此，推测在后期的骨修复过程中，生长因子仍然存在，只是来源和浓度变了，富血小板血浆对骨再生与骨修复有时间依赖性。在材料制备方面，课题组通过体外负压吸附的方法使富血小板血浆进入到nHAC/BMPs材料的孔隙中，负压抽吸至材料内无气泡逸出，该方法存在很大局限性，不能保证材料内吸附的富血小板血浆量一致，因此，复合材料的制备方法还需要进一步探究^[29]。

综上，当前实验构建骨膜/nHAC/BMPs/富血小板血浆组织工程骨，探索出一种以自体生长因子和自体细胞附加活性材料修复骨缺损的新途径，旨在满足临床的需求并提高患者的生存质量。生物机体是个复杂的环境，富血小板血浆生物功能的发挥受多种因素的控制，富血小板血浆含有的生长因子的确切成分、浓度、相互间的作用机制等方面研究仍不透彻^[30-31]。当前实验中与nHAC/BMPs复合物降解过程中所释放BMPs的相互作用制仍不明确，因此，富血小板血浆促进骨修复的临床效果仍需要更深入的研究及大量的证据来证明。此外，复合材料的体外释药行为研究不多，nHAC/BMPs在材料降解同时的释放模式及时效性需要更多实验来支持。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程