氧化石墨烯负载多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.002

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
氧化石墨烯：为一种纳米材料，在生物医学领域有广泛应用，生物相容性比较好，吸附能力比较强，并且具有功能化和修饰作用，能够吸附和缓释药物。氧化石墨烯具有载药性能，主要用于负载抗癌药物，氧化石墨烯对药物的装载率比其他纳米材料高，是恶性肿瘤患者生物治疗和靶向治疗比较好的选择。
氧化石墨烯的安全性：体外关于氧化石墨烯对细胞的毒性作用的研究存在争议，一般认为氧化石墨烯对细菌具有毒性作用，在高浓度条件下能够引起细胞凋亡。关于氧化石墨烯的体内研究认为氧化石墨烯对细胞的毒性比较小，对器官脏器没有毒性作用。由于氧化石墨烯具有良好的生物相容性，良好的靶向作用和载药性能，在体内比较安全，因此是负载抗肿瘤药物的比较好的载体。

背景：研究发现氧化石墨烯对正常细胞的毒性比较低，但有关氧化石墨烯负载多柔比星抗肿瘤药物后对恶性肿瘤细胞是否有影响的研究不多。
目的：探讨氧化石墨烯负载多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用。
方法：取对数生长期人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226，分4组培养，其中3组分别加入氧化石墨烯负载多柔比星、多柔比星、氧化石墨烯，对照组不干预。培养24 h，CCK-8方法检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。
结果与结论：①对照组细胞质透亮清晰，多数为饱满形态；氧化石墨烯组细胞质较透亮，少数细胞出现皱缩；多柔比星组细胞形态不均一，细胞出现皱缩，有凋亡小体出现；氧化石墨烯负载多柔比星组细胞体积明显缩小，皱缩较明显，出现凋亡小体；②氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组、氧化石墨烯组细胞存活率均低于对照组(P < 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组细胞存活率明显低于氧化石墨烯组(P < 0.05)；③氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组细胞凋亡率高于氧化石墨烯组、对照组(P < 0.05)；④4组间细胞周期比较差异无显著性意义；⑤结果表明，氧化石墨烯负载多柔比星具有较强的毒性作用，可诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡。

ORCID: 0000-0003-3976-6575(邢丽娜)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 纳米材料, 氧化石墨烯, 多柔比星, 多发性骨髓瘤, 细胞, 凋亡, 细胞毒性

Abstract:

BACKGROUND: Cytotoxicity of graphene oxide to normal cells is relatively low, but whether graphene oxide loaded with doxorubicin has some effects on malignant cells is rarely reported.
OBJECTIVE: To explore the cytotoxicity of graphene oxide loaded with doxorubicin on multiple myeloma cells.
METHODS: Multiple myeloma cell line RPMI8226 in logarithmic phase was selected, cultured and divided into four groups, including graphene oxide loaded with doxorubicin, doxorubicin and graphene oxide groups as well as control group with no intervention. After 24 hours of culture, the cell activity was detected by cell counting kit-8 method, and the cell cycle and apoptosis were detected using flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Plump-shaped cells with translucent and clear cytoplasm were found in the control group; cells with relatively translucent cytoplasm, and even a few shrunken cells appeared in the graphene oxide group; cellular morphology was in a heterogeneity, apoptotic bodies appeared in the doxorubicin group; the cells was significantly reduced in size, presenting more obvious shrinkage and apoptotic bodies in the group of graphene oxide loaded with doxorubicin. The cell survival rate in the graphene oxide loaded with doxorubicin, doxorubicin and graphene oxide groups was significantly lower than that in the control group (P < 0.05), and this indicator was significantly lower in the group of graphene oxide loaded with doxorubicin than the graphene oxide group (P < 0.05). The apoptotic rate in the group of graphene oxide loaded with doxorubicin and doxorubicin group was significantly higher than those in the graphene oxide and control groups (P < 0.05), respectively. Additionally, there were no significant differences in the cell cycle among groups. These results show that graphene oxide loaded with doxorubicin has a stronger cytotoxicity, and can induce apoptosis in human multiple myeloma cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Doxorubicin, Multiple Myeloma, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

邢丽娜，张学军，王颖，牛志云，王福旭，温树鹏. 氧化石墨烯负载多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5636-5641.

Xing Li-na, Zhang Xue-jun, Wang Ying, Niu Zhi-yun, Wang Fu-xu, Wen Shu-peng.

Graphene oxide loaded with doxorubicin: a killer for multiple myeloma cells

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(38): 5636-5641.

图/表（结果） 2

2.1 不同材料对多发性骨髓瘤细胞形态的影响对照组细胞质透亮清晰，多数为饱满形态；氧化石墨烯组细胞质较透亮，少数细胞出现皱缩；多柔比星组细胞形态不均一，细胞出现皱缩，并有凋亡小体出现；氧化石墨烯负载多柔比星组细胞体积明显缩小，皱缩较明显，出现凋亡小体，见图1。

2.2 不同对多发性骨髓瘤细胞活性的影响氧化石墨烯负载多柔比星组、氧化石墨烯组、多柔比星组、对照组的细胞存活率分别为(64.3±6.5)%、(85.3±0.9)%、(74.5±1.3)%、100%。

4组细胞存活率比较差异有显著性意义(F=11.583，P < 0.05)，两两之间比较发现：氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组、氧化石墨烯组的细胞存活率均低于对照组(P < 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组细胞存活率明显低于氧化石墨烯组(P < 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组的细胞存活率虽低于多肉比星组，但差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明，氧化石墨烯对多发性骨髓瘤细胞具有毒性作用，但细胞存活率在80%以上，其毒性作用较低；多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的毒性作用较大，氧化石墨烯对多柔比星的毒性作用没有太大影响。

2.3 不同材料对多发性骨髓瘤细胞周期的影响氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组和氧化石墨烯组细胞周期G₀/G₁、S和G₂/M之间比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。两两之间比较：石墨烯负载多柔比星组细胞周期G₀/G₁、S和G₂/M与多柔比星组、氧化石墨烯组、对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，氧化石墨烯组细胞周期G₀/G₁、S和G₂/M和对照组、多柔比星组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。表明氧化石墨烯负载多柔比星、多柔比星和氧化石墨烯均不影响多发性骨髓瘤细胞的细胞周期。

2.4 不同材料对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响氧化石墨烯负载多柔比星组、氧化石墨烯组、多柔比星组、对照组的细胞凋亡率分别为(15.4±0.8)%、(5.4±1.2)%、(14.5±2.1)%、(5.6±0.9)%。

4组细胞凋亡率比较差异有显著性意义(F=9.584， P < 0.05)。两两之间比较发现：氧化石墨烯组与对照组细胞凋亡率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组和多柔比星组细胞凋亡率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组细胞凋亡率高于氧化石墨烯组、对照组(P < 0.05)。表明氧化石墨烯不引起多发性骨髓瘤细胞的凋亡，多柔比星可诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡，氧化石墨烯不影响多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的凋亡作用。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学对照观察实验。

1.2 时间及地点实验于2013年7月至2014年9月在河北医科大学第二医院实验室完成。

1.3 材料 RPMI8226人多发性骨髓瘤细胞株，购自于协和医科大学细胞中心。

1.4 实验方法

制备氧化石墨烯：将5 g膨胀石墨、5 g硝酸钠、 30 g高锰酸钾与230 mL浓硫酸混合，然后置于273 K温度下，24 h后置入308 K温度下搅拌，去离子水稀释，温度升高值371 K时保持15 min，然后加入过氧化氢，离心，加入去离子水和HCl洗涤，便得到氧化石墨烯。

氧化石墨烯吸附多柔比星：将6 mg氧化石墨烯加入10 mL多柔比星稀释液中震荡得到。

RPMI8226人多发性骨髓瘤细胞株的培养和传代：将RPMI8226人多发性骨髓瘤细胞株接种于RPMI1640培养液中，置入二氧化碳培养箱中进行培养，每隔2 d进行1次换液，每隔4 d进行1次传代培养，取生长良好的对数期生长细胞进行实验。

RPMI8226人多发性骨髓瘤细胞株分组干预：将生长良好的对数生长期RPMI8226人多发性骨髓瘤细胞，置入离心管中离心，培养基重悬细胞，调节细胞浓度为5×10⁷ L^-1，在培养箱中培养2 h，接种到细胞培养板上，分4组培养：氧化石墨烯负载多柔比星组加入氧化石墨烯负载多柔比星(氧化石墨烯60 mg/L+多柔比星 2.5 mg/L)，多柔比星组加入多柔比星(2.5 mg/L)，氧化石墨烯组加入氧化石墨烯(60 mg/L)，对照组不予处理，继续培养24 h，观察细胞形态。

1.5 主要观察指标

不同材料对多发性骨髓瘤细胞的毒性：分组干预 24 h后，在每组中加入CCK-8继续培养2 h，通过用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其黄色光吸收值，可间接反映活细胞数量。测量每孔的吸光度值，每组取5孔，求平均值。细胞存活率=实验组A值/对照A值。

不同材料对多发性骨髓瘤细胞周期的影响：分组干预24 h后离心，弃去上清液，PBS重悬细胞，离心，弃去上清液，加入碘化丙啶染色，采用流式细胞仪进行检测。

不同材料对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响：分组干预24 h后离心，弃去上清液，PBS重悬细胞，加入Annexin V-FITC，加入工作也PI进行培养，采用流式细胞仪进行检测。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行分析，多组间均数比较采用LSD检验，两两均数比较采用t 检验，取P=0.05为显著标准。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

多发性骨髓瘤是浆细胞不断恶性增殖的一种血液系统恶性肿瘤，目前的治疗主要为分阶段治疗：①诱导治疗：对于符合移植条件的患者，在移植前先给予诱导治疗，诱导治疗药物主要有地塞米松、长春新碱、硼替佐米及多柔比星等^[11-14]。②移植治疗：对于经诱导治疗，病情稳定或缓解的患者，可给予移植治疗，包括自体造血干细胞移植和异基因造血干细胞移植^[15-17]。③巩固及维持治疗：干细胞移植后需给予巩固和维持治疗，缩小残留灶，提高缓解率，主要药物有硼替佐米、沙利度胺和地塞米松等^[18-22]。④复发后治疗：对于移植后复发的患者，考虑给予化疗治疗，常采用硼替佐米、沙利度胺和地塞米松联合方案进行化疗^[23-24]。虽然多发性骨髓瘤的治疗方法不断改进，但其治愈率仍较低，大多数会面临复发的风险。多柔比星是治疗多发性骨髓瘤的常用药物，能阻止DNA和RNA合成，对多发性骨髓瘤细胞具有杀伤作用^[25-26]，但多柔比星在杀伤恶性细胞的同时也杀伤正常细胞，有骨髓抑制、心脏毒性的不良反应^[27-31]。研究降低多柔比星毒性作用的药物具有重要意义。

氧化石墨烯为一种纳米材料，在生物医学领域有广泛应用^[32-33]，生物相容性比较好，吸附能力比较强，并且具有功能化和修饰作用，能够吸附和缓释药物。氧化石墨烯具有载药性能，主要用于负载抗癌药物，是恶性肿瘤患者生物治疗和靶向治疗比较好的选择。多柔比星在氧化石墨烯的载药率达400%左右^[34]，氧化石墨烯负载药物后具有靶向作用，可降低抗肿瘤药物对正常细胞的毒性作用^[35-36]。氧化石墨烯负载药物后对药物具有缓释作用^[37]，药物释放时间长。对于氧化石墨烯的安全性研究发现，体外关于氧化石墨烯对细胞的毒性作用的研究存在争议^[38-39]，一般认为氧化石墨烯对细菌具有毒性作用，在高浓度条件下能够引起细胞凋亡。关于氧化石墨烯的体内研究认为氧化石墨烯对细胞的毒性比较小，对器官脏器没有毒性作用。由于氧化石墨烯具有良好的生物相容性，良好的靶向作用和载药性能，在体内比较安全，因此是负载抗肿瘤药物的比较好的载体。

实验制备氧化石墨烯负载多柔比星，研究其对多发性骨髓瘤细胞的影响，结果发现：氧化石墨烯组细胞质比较透亮，少数细胞出现皱缩；多柔比星组细胞形态不均一，细胞出现皱缩，并有凋亡小体出现；氧化石墨烯负载多柔比星组细胞体积明显缩小，皱缩比较明显，出现凋亡小体。氧化石墨烯负载多柔比星组细胞存活率低于对照组(P < 0.05)，多柔比星组细胞存活率低于对照组(P < 0.05)，氧化石墨烯组细胞存活率低于对照组(P < 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组细胞存活率明显低于氧化石墨烯组(P < 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组细胞存活率低于多柔比星组，但差异无统计学意义。多发性骨髓瘤细胞在经过氧化石墨烯负载多柔比星、多柔比星和氧化石墨烯处理后的细胞周期之间比较无明显差异，石墨烯负载多柔比星组细胞周期和对照组细胞周期无差异，多柔比星组细胞周期和对照组细胞周期无差异，氧化石墨烯组细胞周期和对照组细胞周期无差异。氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组、氧化石墨烯组细胞凋亡率和对照组比较差异显著，氧化石墨烯细胞凋亡率和对照组比较无差异，氧化石墨烯负载多柔比星组细胞凋亡率和多柔比星组比较无差异，氧化石墨烯负载多柔比星组和多柔比星组的细胞凋亡率均高于氧化石墨烯组和对照组(P < 0.05)。表明氧化石墨烯对多发性骨髓瘤细胞具有毒性作用，但细胞存活率在80%以上，其毒性作用比较低，多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的毒性作用比较大，氧化石墨烯对多柔比星的毒性作用没有太大影响；氧化石墨烯负载多柔比星、多柔比星和氧化石墨烯均不影响多发性骨髓瘤细胞的细胞周期；氧化石墨烯不引起多发性骨髓瘤细胞的凋亡，多柔比星可诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡，氧化石墨烯不影响多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的凋亡作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程