内源性增加单个核细胞自体移植提升血管闭塞性脉管炎调节性T细胞比例

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.012

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (50): 8102-8107.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.012

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

内源性增加单个核细胞自体移植提升血管闭塞性脉管炎调节性T细胞比例

赵峰¹，邓默²

河北大学附属医院，¹介入科，²麻醉科，河北省保定市 071000

收稿日期:2015-10-21 出版日期:2015-12-03 发布日期:2015-12-03
通讯作者: 邓默，硕士，主治医师，河北大学附属医院麻醉科，河北省保定市 071000
作者简介:赵峰，男，1979年生，河北省保定市人，汉族，硕士，主治医师，研究方向为外周血管介入治疗。
基金资助:
河北省医学科学研究重点课题(20110515)

Autologous peripheral blood mononuclear cell transplantation following cell mobilization increases CD4+CD25+ regulatory T cells in rats with thromboangiitis obliterans

Zhao Feng¹, Deng Mo²

¹Department of Interventional Radiology, ²Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China

Received:2015-10-21 Online:2015-12-03 Published:2015-12-03
Contact: Deng Mo, Master, Attending physician, Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China
About author:Zhao Feng, Master, Attending physician, Department of Interventional Radiology, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China
Supported by:
the Medical Science Project of Hebei Province, No. 20110515

摘要/Abstract

摘要：

背景：自体外周造血干细胞具有多向分化潜能的特点，可促进缺血肢体新生血管形成，改善和恢复患肢的血液供应。
目的：观察自体外周血单个核细胞自体移植对血管闭塞性脉管炎大鼠的治疗作用。
方法：将24只大鼠随机分为对照组、模型组和粒细胞集落刺激因子组。在模型组和粒细胞集落刺激因子组大鼠中股动脉注射月桂酸钠建立血管闭塞性脉管炎大鼠模型。粒细胞集落刺激因子组大鼠连续5 d以重组人粒细胞集落刺激因子动员外周血单个核细胞，第7天接受外周血单个核细胞移植，对照组和模型组大鼠仅给予生理盐水。
结果与结论：与造模前相比，模型组和粒细胞集落刺激因子组大鼠造模后足背部体温及CD4+CD25+调节性T细胞比例显著降低，下肢溃疡面积明显增加；粒细胞集落刺激因子组大鼠动员后第6天白细胞数量及CD34+细胞占单个核细胞的百分比增加，外周血单个核细胞移植之后1个月时足背部体温与建模前接近，CD4+CD25+调节性T细胞比例显著上升。提示外周血单个核细胞内源性增加后进行自体移植，可提升血管闭塞性脉管炎大鼠调节性T细胞比例，有助于迅速缓解症状、促进溃疡愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 血管闭塞性脉管炎, 外周血单个核细胞, 干细胞移植, CD4+CD25+调节性T细胞

Abstract:

BACKGROUND: Autologous peripheral blood stem cells have pluripotent characteristics, promote ischemic limb angiogenesis, improve and restore the blood supply to the affected limb.
OBJECTIVE: To observe the therapeutic effect of autologous peripheral blood mononuclear cell transplantation in rats with thromboangiitis obliterans.
METHODS: Twenty-four rats were randomized into control, model and granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) groups. In the latter two groups, animal models of thromboangiitis obliterans were established by femoral arterial injection of sodium laurate. In the G-CSF group, rats were injected with recombinant human G-CSF for 5 successive days for peripheral blood mononuclear cell mobilization, and then underwent peripheral blood mononuclear cell transplantation at day 7. In the control and model groups, rats were given normal saline injection.
RESULTS AND CONCLUSION: After modeling, foot dorsum temperature and the percentage of CD4+CD25+ regulatory T cells decreased significantly in the model and G-CSF groups, and the area of leg ulcers was enlarged notably in these two groups. In the G-CSF group, the number of white cells and percentage of CD34+ cells to mononuclear cells were increased at 6 days after mobilization; the foot dorsum temperature and the percentage of CD4+CD25+ regulatory T cells increased significantly at 1 month after peripheral blood mononuclear cell transplantation, which were close to the normal values. These findings indicate that autologous
peripheral blood mononuclear cell transplantation following cell mobilization increases the percentage of CD4+CD25+ regulatory T cells in rats with thromboangiitis obliterans, thus promoting relief of symptoms and ulcer healing.

中图分类号:

R394.2

赵峰，邓默. 内源性增加单个核细胞自体移植提升血管闭塞性脉管炎调节性T细胞比例[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8102-8107.

Zhao Feng1, Deng Mo2. Autologous peripheral blood mononuclear cell transplantation following cell mobilization increases CD4+CD25+ regulatory T cells in rats with thromboangiitis obliterans[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8102-8107.

图/表（结果） 3

2.1 造模成功动物数量及过程所有大鼠均进入结果分析，无脱失。实验流程见图1。

2.2 模型方法的改进实验以医用封闭胶封闭穿刺点，可减少造模动物的出血及死亡现象，为实验造模方法的改进之处。

2.3 模型更接近临床实践实验模拟临床影响因素，外界环境因素少，其发病机制和病理变化较接近临床血管闭塞性脉管炎的发病过程。

2.4 主要观察结果和次要观察结果

2.4.1 足背部体温和下肢溃疡变化各组大鼠下肢溃疡的表现见图2。2组大鼠基础足背部体温接近(P > 0.05)。与造模前相比，模型组和粒细胞集落刺激因子组大鼠造模后足背部体温显著降低(P < 0.05)，且粒细胞集落刺激因子组大鼠接受外周血单个核细胞移植之后1个月时足背部体温与建模前接近(P > 0.05；表1)。

模型组和粒细胞集落刺激因子组造模后大鼠下肢溃疡面积接近(P > 0.05)，粒细胞集落刺激因子组大鼠接受治疗1个月之后下肢溃疡完全愈合，模型组大鼠仍存在溃疡(表1)。

2.4.2 重组人粒细胞集落刺激因子外周血单个核细胞动员结果对照组、模型组和粒细胞集落刺激因子组大鼠动员前白细胞数量及CD34⁺占单个核细胞的百分比接近(P > 0.05)，粒细胞集落刺激因子组大鼠动员后第6天白细胞数量及CD34⁺占单个核细胞的百分比较治疗前显著增加(P < 0.05；表2)。

2.4.3 外周血CD4⁺CD25⁺调节性T细胞比例变化 3组大鼠造模后外周血CD4⁺CD25⁺调节性T细胞比例接近(P > 0.05)。模型组大鼠造模后CD4⁺CD25⁺调节性T细胞比例显著低于对照组(P < 0.05)，而粒细胞集落刺激因子组大鼠的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞比例显著高于对照组和模型组 (P < 0.05；表3)。

参考文献

[1] 王会梅,高荣芳,吕金波.中西医结合治疗下肢动脉硬化性闭塞症65例[J].中国中西医结合外科杂志,2007,13(4):398.

[2] Latza U, Stang A, Bergmann M, et al. The problem of response in epidemiological studies in Germany (part I). Gesundheitswesen. 2004;66(5):326-336.

[3] Ruiz-Salmeron R, de la Cuesta-Diaz A, Constantino-Bermejo M, et al. Angiographic demonstration of neoangiogenesis after intra-arterial infusion of autologous bone marrow mononuclear cells in diabetic patients with critical limb ischemia. Cell Transplant. 2011;20(10):1629-1639.

[4] Lasala GP, Minguell JJ. Vascular disease and stem cell therapies. Br Med Bull. 2011;98:187-197.

[5] Idei N, Soga J, Hata T, et al. Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation reduces long-term major amputation risk in patients with critical limb ischemia: a comparison of atherosclerotic peripheral arterial disease and Buerger disease. Circ Cardiovasc Interv. 2011;4(1):15-25.

[6] Matsumura G, Miyagawa-Tomita S, Shin'oka T, et al. First evidence that bone marrow cells contribute to the construction of tissue-engineered vascular autografts in vivo. Circulation. 2003;108(14):1729-1734.

[7] Simper D, Stalboerger PG, Panetta CJ, et al. Smooth muscle progenitor cells in human blood. Circulation. 2002;106(10): 1199-1204.

[8] Lin Y, Weisdorf DJ, Solovey A, et al. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 2000;105(1):71-77.

[9] Yoon YS, Wecker A, Heyd L, et al. Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction. J Clin Invest. 2005; 115(2):326-338.

[10] Yamashita J, Itoh H, Hirashima M, et al. Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors. Nature. 2000;408(6808):92-96.

[11] Miranville A, Heeschen C, Sengenès C, et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 2004;110(3):349-355.

[12] 宫立众,夏顺中.外周血干细胞移植研究进展[J].重庆医学,2002, 31(5):430-432.

[13] 李施施,刘忠,严庆丰.外周血细胞重编程为诱导性多潜能干细胞的研究进展[J].中国细胞生物学学报,2011,(8):930-935.

[14] 吴德沛,唐晓文,夏学鸣.自体外周血干细胞移植并发Ⅳ度移植物抗宿主病一例[J].中华血液学杂志,2000,21(8):423-424.

[15] Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 1995;155(3):1151-1164.

[16] Shevach EM. Certified professionals: CD4(+)CD25(+) suppressor T cells. J Exp Med. 2001;193(11):F41-46.

[17] Annacker O, Pimenta-Araujo R, Burlen-Defranoux O, et al. CD25+CD4+ T cells regulate the expansion of peripheral CD4 T cells through the production of IL-10. J Immunol. 2001; 166(5):3008-3018.

[18] Field EH, Matesic D, Rigby S, et al. CD4+CD25+ regulatory cells in acquired MHC tolerance. Immunol Rev. 2001;182: 99-112.

[19] Cohen JL, Trenado A, Vasey D, et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T Cells: new therapeutics for graft-versus-host disease. J Exp Med. 2002;196(3):401-406.

[20] Hoffmann P, Ermann J, Edinger M, et al. Donor-type CD4(+)CD25(+) regulatory T cells suppress lethal acute graft-versus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation. J Exp Med. 2002;196(3):389-399.

[21] Edinger M, Hoffmann P, Ermann J, et al. CD4+CD25+ regulatory T cells preserve graft-versus-tumor activity while inhibiting graft-versus-host disease after bone marrow transplantation. Nat Med. 2003;9(9):1144-1150.

[22] 中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物的指导性意见. 2006-09-30.

[23] 孙晓春,蔡花,吴乐乐,等.G-CSF动员大鼠外周血间质干细胞的初步实验研究[J].中国细胞生物学学报,2010,(5):762-765.

[24] 杨镛,杨国凯,何晓明,等.经皮透光负压旋切术治疗下肢静脉性皮肤溃疡的疗效与评价[J].中国普外基础与临床杂志,2009, 16(12): 996-999.

[25] 李学锋,沈振亚,谷涌泉,等.自体骨髓干细胞移植治疗血栓闭塞性脉管炎[J].中国普外基础与临床杂志,2010,17(7):656-659.

[26] 李国剑,杨镛,杨国凯,等.自体外周血干细胞移植治疗血栓闭塞性脉管炎的临床应用[J].中国普外基础与临床杂志,2012,19(11): 1187-1190.

[27] 虞希祥,朱国庆,郝伟远.自体骨髓干细胞移植治疗下肢严重缺血的临床研究[J].医学影像学杂志,2010,20(8):1165-1167.

[28] 孙文,郁涂巍,梁健.自体骨髓干细胞移植治疗下肢动脉硬化闭塞症11例报告[J].中国医师进修杂志,2006,29(32):62,68.

[29] Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T, et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 2002;360(9331):427-435.

[30] 杨镛,陆平,何晓明,等.人自体干细胞移植在重症肢体缺血血流重建中的疗效与评价[J].中国普外基础与临床杂志,2009,16(2): 115-118.

[31] 缪健航,师天雄,胡锡祥,等.自体外周血干细胞移植治疗下肢动脉缺血性疾病的临床应用[J].中国普外基础与临床杂志,2008, 15(2):106-108.

[32] Matoba S, Tatsumi T, Murohara T, et al. Long-term clinical outcome after intramuscular implantation of bone marrow mononuclear cells (Therapeutic Angiogenesis by Cell Transplantation [TACT] trial) in patients with chronic limb ischemia. Am Heart J. 2008;156(5):1010-1018.

[33] 杨继武,周业庭,刘伟平,等.重组人肝细胞生长因子联合粒细胞集落刺激因子对血管新生的影响[J].中华实验外科杂志,2010, 27(6): 842.

[34] Yamamoto K, Kondo T, Suzuki S, et al. Molecular evaluation of endothelial progenitor cells in patients with ischemic limbs: therapeutic effect by stem cell transplantation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24(12):e192-196.

[35] Lee HC, An SG, Lee HW, et al. Safety and effect of adipose tissue-derived stem cell implantation in patients with critical limb ischemia: a pilot study. Circ J. 2012;76(7):1750-1760.

[36] Bura A, Planat-Benard V, Bourin P, et al. Phase I trial: the use of autologous cultured adipose-derived stroma/stem cells to treat patients with non-revascularizable critical limb ischemia. Cytotherapy. 2014;16(2):245-257.

[37] Zhi K, Gao Z, Bai J, et al. Application of adipose-derived stem cells in critical limb ischemia. Front Biosci (Landmark Ed). 2014;19:768-776.

[38] Cai A, Qiu R, Li L, et al. Atorvastatin treatment of rats with ischemia-reperfusion injury improves adipose-derived mesenchymal stem cell migration and survival via the SDF-1α/CXCR-4 axis. PLoS One. 2013;8(12):e79100.

[39] Acosta L, Hmadcha A, Escacena N, et al. Adipose mesenchymal stromal cells isolated from type 2 diabetic patients display reduced fibrinolytic activity. Diabetes. 2013; 62(12):4266-4269.

[40] Moazzami K, Majdzadeh R, Nedjat S. Local intramuscular transplantation of autologous mononuclear cells for critical lower limb ischaemia. Cochrane Database Syst Rev. 2011; (12):CD008347.

[41] Benoit E, O'Donnell TF, Patel AN. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: a systematic review. Cell Transplant. 2013;22(3):545-562.

[42] Teraa M, Sprengers RW, van der Graaf Y, et al. Autologous bone marrow-derived cell therapy in patients with critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized controlled clinical trials. Ann Surg. 2013;258(6):922-929.

[43] von Boehmer H. Mechanisms of suppression by suppressor T cells. Nat Immunol. 2005;6(4):338-344.

[44] Taylor PA, Lees CJ, Blazar BR. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 2002; 99(10):3493-3499.

[45] Xia G, Kovochich M, Truitt RL, et al. Tracking ex vivo-expanded CD4+CD25+ and CD8+CD25+ regulatory T cells after infusion to prevent donor lymphocyte infusion-induced lethal acute graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant. 2004;10(11):748-760.

[46] Joffre O, Gorsse N, Romagnoli P, et al. Induction of antigen-specific tolerance to bone marrow allografts with CD4+CD25+ T lymphocytes. Blood. 2004;103(11):4216-4221.

[47] Hanash AM, Levy RB. Donor CD4+CD25+ T cells promote engraftment and tolerance following MHC-mismatched hematopoietic cell transplantation. Blood. 2005;105(4): 1828-1836.

[48] Edinger M, Hoffmann P, Ermann J, et al. CD4+CD25+ regulatory T cells preserve graft-versus-tumor activity while inhibiting graft-versus-host disease after bone marrow transplantation. Nat Med. 2003;9(9):1144-1150.

[49] Trenado A, Charlotte F, Fisson S, et al. Recipient-type specific CD4+CD25+ regulatory T cells favor immune reconstitution and control graft-versus-host disease while maintaining graft-versus-leukemia. J Clin Invest. 2003;112(11):1688-1696.

[50] Zorn E, Kim HT, Lee SJ, et al. Reduced frequency of FOXP3+ CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with chronic graft-versus-host disease. Blood. 2005;106(8):2903-2911.

[51] Gehrie EA, Booth GS. Stem cell collection considerations for AL amyloidosis. Conn Med. 2014;78(10):587-590.

[52] Flommersfeld S, Sohlbach K, Jaques G, et al. Collection of peripheral blood progenitor cells on Day 4 is feasible and effective while reducing granulocyte-colony-stimulating factor exposure to healthy donors. Transfusion. 2015;55(6): 1269-1274.

[53] Zhang WX, Zhao QY, Huang HQ. Febrile neutropenic infection occurred in cancer patients undergoing autologous peripheral blood stem cell transplantation. Transplant Proc. 2015;47(2):523-527.

[54] Pulsipher MA, Chitphakdithai P, Logan BR, et al. Lower risk for serious adverse events and no increased risk for cancer after PBSC vs BM donation. Blood. 2014;123(23):3655-3663.

[55] Eapen M, Logan BR, Horowitz MM, et al. Bone marrow or peripheral blood for reduced-intensity conditioning unrelated donor transplantation. J Clin Oncol. 2015;33(4):364-369.

[56] Hatsuse M, Fuchida S, Okano A, et al. Secondary MGUS following by adenovirus-induced hemorrhagic cystitis after autologous peripheral blood stem cell transplantation in a patient with multiple myeloma. Rinsho Ketsueki. 2014;55(11): 2277-2282.

引言

血管闭塞性脉管炎常导致缺血性下肢血管病^[1]，严重影响患者生活质量。近年来，血管闭塞性脉管炎的发病率明显升高^[2]。目前，对于下肢动脉闭塞且无侧支循环形成患者，主要以介入或血管搭桥方法治疗。干细胞移植血管新生技术为血管闭塞性疾病提供了新的治疗思路^[3-5]。目前认为，在骨髓、外周血、脐带血和胚胎中均存在内皮祖细胞^[6-11]，均可作治疗用干细胞的来源。
由于外周血干细胞的采集较骨髓采集更便利，移植后感染和出血等并发症的风险较低^[12]，因此外周血作为干细胞的来源，越来越受到关注。外周血干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，虽然其细胞数量仅为骨髓中干细胞数的1/10至1/100，但使用细胞动员剂可以迅速增加外周血干细胞数量^[13]，此外，外周血可以一次性更大量地采血，因此，外周血所获得的干细胞足以用于治疗目的。然而外周血干细胞移植较骨髓干细胞起步晚，目前临床治疗的疗效和安全性尚未获得一致的结论。
有研究发现，自体外周血干细胞移植后患者发生Ⅳ度急性移植物抗宿主病^[14]。移植物抗宿主病是造血干细胞移植治疗的严重并发症，是由于供者的效应性T细胞对宿主组织进行攻击所引起。CD4+CD25+调节性T细胞属于抑制性T细胞亚群，能够诱导宿主产生移植免疫耐受，从而预防移植物抗宿主病发生^[15-21]。目前有关外周血干细胞移植对宿主CD4+CD25+调节性T细胞影响的研究较少。实验拟对血栓闭塞性脉管炎大鼠模型进行外周血单个核细胞自体移植，观察移植的效果及对调节性T细胞的影响。

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2012年2月至2013年12月在河北大学附属医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级SD雄性大鼠24只，鼠龄6-8周，体质量(198±24) g，由河北大学附属医院实验动物中心提供，医学实验动物合格证编号为2011A041。实验前大鼠分笼饲养，自由引水饮食，室温控制在23-27 ℃，饲养2周之后用于实验。实验中的操作符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》中的规定^[22]。24只大鼠随机分为对照组、模型组和粒细胞集落刺激因子组，各8只。

1.4.1 造模方法模型组和粒细胞集落刺激因子组建立血管闭塞性脉管炎大鼠模型。腹腔注射2%戊巴比妥钠 (50 mg/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定，右下肢行2.0 cm纵行切口，游离股动脉并在股动脉中段使用动脉夹阻断动脉血流。于动脉夹远心端注入0.4 mL月桂酸钠(Sigma公司)，医用胶封闭针孔。1 min后打开动脉夹，检查无活动性出血且无股动脉无血流通过之后逐层缝合皮肤及皮下组织。造模后常规饲养1个月。

1.4.2 自体外周血干细胞动员于造模后第1天开始予以粒细胞集落刺激因子组大鼠于每天10：00皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(日本麒麟株式会社)50 μg/kg，连续给药5 d^[23]，对照组和模型组大鼠以相同的方式注射等量的生理盐水。第6天使用血细胞分离机(Baxter公司)单独采集和分离外周血干细胞。外周血干细胞的采集终体积约为 90 mL，计算白细胞总数并使用流式细胞仪(美国BD公司)检测CD34⁺细胞占单个核细胞的百分比。

1.4.3 外周血单个核细胞移植造模后第7天重组人粒细胞集落刺激因子组大鼠接受外周血单个核细胞移植。将采集的单个核细胞配成细胞浓度为1.0×10¹¹ L^-¹的细胞混悬液，左下肢沿血管走向选取个5点间距约1 cm的位置，肌肉注射细胞悬液，每个点注射约0.1 mL。

1.4.4 下肢动脉造影模型组和粒细胞集落刺激因子组大鼠于禁食1 d，禁水8 h。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠 50 mg/kg麻醉，仰卧位固定，于患侧腹股沟股动脉搏动最明显处纵向切口约3 cm，使用蚊式钳钝性分离腹股沟皮肤深浅筋膜。充分暴露股动脉。使用带外鞘的穿刺针(日本Terumo公司)以30°-40°角度由近心端向远心端沿血管走行在股动脉前壁，穿刺时针尖斜面朝上。针芯尾端出现血液提示穿刺成功，固定针芯并将外鞘朝远心端方向沿血管送入约1 cm。数字减影血管造影机(美国GE公司)进行血管造影明确股动脉阻塞。

1.4.5 足背部体温和下肢溃疡情况观察使用红外线表面人体温度仪(瑞士PICCOLO公司)测量造模前、造模后及外周血单个核细胞移植后1个月时大鼠足背部体温，并观察患肢皮肤溃疡情况。皮肤溃疡面积通过溃疡最长和最短直径的乘积进行计算^[24-26]。

1.4.6 重组人粒细胞集落刺激因子外周血单个核细胞动员效果各组大鼠分别在重组人粒细胞集落刺激因子外周血干细胞动员前及动员后第6天抽取尾静脉血0.2 mL检测白细胞总数，流式细胞仪检测CD34⁺细胞数量，计算CD34⁺细胞占单个核细胞的百分比。

1.4.7 外周血CD4⁺CD25⁺调节性T细胞比例分析分别在造模后及外周血干细胞移植后1个月时采集各组大鼠的外周血，加入FITC-抗大鼠CD4和PE-抗大鼠CD25抗体，充分混匀之后避光孵育20 min，之后加入红细胞裂解液，充分混匀之后再避光孵育10 min，以1 000 r/min的转速离心 5 min，弃上清，再用PBS混匀沉淀并洗涤2次，弃上清并加入PBS，使用流式细胞仪检测样本中的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的比例。

1.5 主要观察指标大鼠足背部体温，溃疡面积，白细胞数量、CD34⁺细胞占单个核细胞的百分比及与移植物抗宿主反应相关的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞表达变化。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。数据以x(_)±s表示。组内比较使用配对t 检验，组间比较采用方差分析或独立样本t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着高血脂、糖尿病、高血压等诱发因素的增加，血管闭塞性脉管炎成为近年来越来越多发生的疾病。肢体远端长期缺氧和缺血是导致组织变性和坏死的主要原因^[27-28]。目前临床上对于血管闭塞性脉管炎的治疗主要以介入或血管搭桥为主，然而疗效往往并不令人满意，此外，对于血管远端严重闭塞以及大段血管闭塞的患者，这些治疗常常无效。通过干细胞移植实现血管新生是近年来针对下肢严重缺血性疾病的新疗法^[29-42]。
移植物抗宿主病是造血干细胞移植治疗的严重并发症，是由于供者的效应性T细胞对宿主组织进行攻击所引起。已有的研究发现，如果在移植前清除供血中的效应性T细胞，虽然能够明显抑制移植物抗宿主病的发生，但同时也会影响了造血干细胞的植入，失去移植物抗肿瘤效应。近年来，CD4+CD25+调节性T细胞成为移植后免疫抑制领域的研究热点并为该难题的解决提供了新的思路。
CD4+CD25+调节性T细胞属于抑制性T细胞亚群，能够诱导宿主产生移植免疫耐受，从而预防移植物抗宿主病发生。CD4+CD25+调节性T细胞主要通过直接细胞接触、分泌抑制性细胞因子、间接抑制以及细胞溶解途径发挥免疫抑制作用^[43]。既往的动物研究显示，CD4+CD25+调节性T细胞在骨髓移植的动物宿主内能够明显抑制移植物抗宿主病的发生，并且体外活化扩增的供者CD4+CD25+调节性T细胞能在宿主体内持续存在^[44-45]。此外，在动物骨髓移植试验中已经证实了CD4+CD25+调节性T细胞促进供体造血干细胞植入以及在宿主体内长期存活并保留移植物抗肿瘤效应的功能^[46-49]。既往的临床研究也提示，CD4+CD25+调节性T细胞的表达与造血干细胞移植后移植物抗宿主病的发生存在显著的相关性^[50]，促进新生侧支血管形成。本实验中，血管闭塞性脉管炎大鼠经常规外周血单个核细胞动员能够获得足够的干细胞数。粒细胞集落刺激因子组大鼠经外周血单个核细胞移植治疗后CD4+CD25+调节性T细胞百分比显著高于未接受外周血单个核细胞移植治疗的模型组和对照组，并且下肢溃疡愈合较模型组显著，这提示外周血单个核细胞移植不仅能够迅速地促进侧支血管的新生和溃疡的愈合，而且能够有效地预防移植物抗宿主病，提高移植的成功率。
然而，外周血单个核细胞移植治疗也存在一定的风险，例如外周血单个核细胞动员过程中对心肺和血液系统功能的影响、移植过程中的感染风险、干细胞分化生长过程中的肿瘤风险以及更远期的移植物抗宿主反应等^[51-56]。在本实验中，各组中均未出现大鼠死亡，未观察到明显的心肺、血液系统并发症。有关外周血单个核细胞移植治疗的风险仍需开展进一步的动物和人体研究以证实。
综上所述，外周血单个核细胞自体移植能够有效促进血管闭塞性脉管炎病变部位新生血管形成，迅速缓解症状、促进溃疡愈合。在治疗过程中宿主CD4+CD25+调节性T细胞持续升高，从而有效预防移植物抗宿主病的，值得在人体中开展进一步的大规模临床试验。

内源性增加单个核细胞自体移植提升血管闭塞性脉管炎调节性T细胞比例

Autologous peripheral blood mononuclear cell transplantation following cell mobilization increases CD4+CD25+ regulatory T cells in rats with thromboangiitis obliterans

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.