银杏达莫注射液联合骨髓间充质干细胞移植改善脑梗死后的神经功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：通过细胞移植重建损伤脑组织成为治疗脑梗死的新途径，骨髓间充质干细胞成为近年来细胞移植治疗领域的研究热点。
目的：探讨银杏达莫注射液联合骨髓间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能的改善作用及相关机制。
方法：利用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型，建模成功后60只SD大鼠随机分为对照组、细胞移植组及联合组。对照组尾静脉注射PBS、细胞移植组尾静脉注射2.5×109 L-1的骨髓间充质干细胞悬液、联合组尾静脉注射2.5×109 L-1的骨髓间充质干细胞悬液和银杏达莫2 mL/kg，1次/d，连续注射5 d。于移植后的1，3 d及1，2 周进行mNSS行为学评分，以观察大鼠神经功能缺损状况。移植后2周RT-PCR检测脑组织中脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43基因表达变化，TUNEL法检测细胞凋亡情况，免疫组化法检测BrdU阳性细胞数。
结果与结论：移植后的1，3 d各组大鼠神经功能缺损评分差异无显著性意义(P > 0.05)，在移植后1，2周，联合组神经功能缺损评分低于细胞移植组及对照组(P < 0.05)；移植后2周，联合组脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43 mRNA表达明显高于细胞移植组及对照组(P < 0.05)，联合组凋亡细胞数目明显少于细胞移植组及对照组(P < 0.05)，联合组BrdU阳性细胞数量明显多于细胞移植组及对照组(P < 0.05)。结果表明骨髓间充质干细胞联合银杏达莫干预能促进脑梗死组织脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43 mRNA的表达，抑制细胞凋亡，改善大鼠神经功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 银杏达莫注射液, 骨髓间充质干细胞, 干细胞移植, 脑源性神经生长因子, GAP-43, 脑梗死

Abstract:

BACKGROUND: Reconstruction of damaged brain tissue through cell transplantation has become a new way to treat cerebral infarction. In recent years, bone marrow mesenchymal stem cells have become the new darling in cell transplantation therapy.
OBJECTIVE: To investigate the effect of ginkgo-damole injection combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation to improve the neurological function of acute cerebral infarction rats and its mechanism.
METHODS: Animal models of middle cerebral artery occlusion were made in rats using suture method, and then 60 rat models were randomly divided into control group, cell transplantation group and combination group. The control group was given intravenous injection of PBS via the tail vein; the cell transplantation group was given intravenous injection of bone marrow mesenchymal stem cell suspension (2.5×109/L) via the tail vein; the combination group was given intravenous injection of bone marrow mesenchymal stem cell suspension (2.5×109/L) and ginkgo-damole injection (2 mL/kg, once a day, totally 5 days) via the tail vein. Modified
neurological severity scores were recorded at 1, 3 days and 1, 2 weeks after transplantation. At 2 weeks after transplantation, expressions of brain-derived neurotrophic factor and growth associated protein 43 in the brain were detected using RT-PCR; cell apoptosis detected using MTT assay; BrdU positive cells counted using immunohistochemistry method.
RESULTS AND CONCLUSION: There were no differences in the modified neurologic severity scores among the three groups at 1, 3 days after transplantation (P > 0.05), but the modified neurological severity scores in the combination group were lower than those in the cell transplantation group and control group at 1, 2 weeks after transplantation (P < 0.05). The expressions of brain-derived neurotrophic factor and growth associated protein 43 in the brain were significantly higher in the combination group than the other two groups at 2 weeks after transplantation (P < 0.05); compared with the other two groups, the number of apoptotic cells was less but the number of BrdU positive cells was higher in the combination group (P < 0.05). These findings indicate that the combination of ginkgo-damole injection and bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can increase the expressions of brain-derived neurotrophic factor and growth associated protein 43 in the brain, inhibit cell apoptosis and improve neurological function in rats with cerebral infarction.

中图分类号:

R394.2

杨朝阳. 银杏达莫注射液联合骨髓间充质干细胞移植改善脑梗死后的神经功能[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8108-8113.

Yang Chao-yang. Ginkgo-damole injection combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation improves neurologic recovery from cerebral infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8108-8113.

图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞形态显微镜下可见，培养四五天后细胞呈亮点状贴壁生长，培养5-8 d时可观察到细胞以梭形为主，有的呈多角形、纤维状，胞体饱满，可见明显集落产生，形态渐趋于一致，细胞铺满培养瓶底面，贴壁细胞分布较均匀。培养到第14，15天时细胞集落逐渐与邻近集落融合成片，见图1。经多次传代后的骨髓间充质干细胞呈漩涡状分布，均一性较好，形态基本一致，纯度达97%以上。

2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD105等表达阳性，CD34、CD80、CD86表达阴性，骨髓间充质干细胞均一性好，纯度达97%以上。
2.3 实验动物数量分析参加实验大鼠60只，均进入结果分析数量，中途无脱落，无死亡。实验流程见图2。

2.4 大鼠神经功能评分细胞移植后的第1，3天，细胞移植组、对照组和联合组之间神经功能行为学评分比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；移植后第7，14天，细胞移植组、对照组和联合组之间神经功能行为学评分比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，表现为mNSS评分下降，神经运动功能明显恢复，见表1。

2.5 RT-PCR检测脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43 mRNA表达细胞移植后2周，联合组的脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43 mRNA表达高于细胞移植组和对照组 (P < 0.05)，差异有显著性意义，见表2，图3。

2.6 TUNEL检测细胞凋亡情况光镜下可观察到细胞散布于整个缺血区内，在梗死灶边缘能观察到阳性细胞，对照组凋亡细胞数较多，细胞移植组呈棕黄色颗粒的凋亡细胞数目显著减少；与细胞移植组比较，联合组中凋亡细胞数目更少，见图4。

2.7 BrdU免疫组化检测脑梗死组织中的BrdU阳性细胞数骨髓间充质干细胞植入后2周，梗死组织中可见BrdU阳性细胞数：联合组为(42.32±7.46)个/高倍视野，细胞移植组为(23.24±4.24)个/高倍视野，对照组为0个/高倍视野，各组间差异有显著性意义(P < 0.01)，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2013年2月至2015年3月在河南医科大学实验动物中心完成。
1.3 材料清洁级SD大鼠62只，雌雄各半，1月龄，体质量210-270 g, 购自中国医学科学院动物实验室，动物质量合格证号：SCXK(豫)20060008。按照SPF级标准饲养：保持在20-22 ℃室温，明暗光照12 h/12 h，给予自由进食、饮水。实验中对动物的处置方法符合动物伦理学相关要求。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离和培养取2只1月龄SD大鼠处死，雌雄不限，经体积分数为75%乙醇消毒后，麻醉状态下取大鼠双侧股骨和胫骨，剪除骨端，采用D-Hank’s液自一端冲洗骨髓腔，制成单细胞悬液，结合贴壁法以3×107 L-1细胞浓度接种于100 mL培养瓶中，放置于37 ℃，体积分数为5% CO2饱和湿度的孵育箱中，次日换液，去除未贴壁细胞，以后每3 d换液1次，按1∶2比例进行扩增传代。经过多次传代扩增培养后，骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化。选取生长良好的1，2，3代骨髓间充质干细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，用无血清DMEM/F12培养基洗涤细胞1次，经锥虫蓝1∶10稀释后进行细胞计数，调整细胞终浓度为2.5×109 L-1备用。

1.4.2 大脑中动脉阻塞模型的建立采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型。术前禁饮食4 h，按无菌原则操作，在大鼠腹腔以2.5%氯胺酮20 mg/kg进行注射麻醉，约10 min后将其固定；俯卧位下取颈正中切口，充分游离右侧颈总、颈内和颈外动脉，仔细分离伴行的迷走神经以及迷走神经节，结扎颈总动脉、颈外动脉后，在颈总动脉分叉约5 mm处做一切口，采用明胶处理过的1.8号鱼线经切口插入右颈内动脉，进线深度为17.0-18.0 mm，栓线头端到达大脑前动脉和大脑中动脉分叉处结扎颈内动脉，以完全阻断血供。阻断2 h后将栓线轻轻拔出约1 cm，形成血流再灌注，建模成功的标志是大鼠即刻出现右侧Horner征。
1.4.3 实验分组建模成功后，将60只SD大鼠随机分为对照组、骨髓间充质干细胞移植组和骨髓间充质干细胞移植+银杏达莫注射液组(联合组)，每组20只。于造模成功24 h后，对照组大鼠给予尾静脉注射1.0 mL无菌PBS，连续注射5 d，1次/d；骨髓间充质干细胞移植组大鼠尾静脉注射1.0 mL骨髓间充质干细胞悬液(2.5×109 L-1)；联合组大鼠尾静脉注射 1.0 mL骨髓间充质干细胞悬液(2.5×109 L-1)+2 mL/kg银杏达莫注射液(连续注射5 d，1次/d)。
1.4.4 大鼠神经功能评分于移植后的1，3 d以及1，2周，采取改良神经功能评分法(modified neurological severity scores，mNSS)进行神经功能缺损评分。mNSS功能测试量表内容包括运动实验、感觉实验、横杆平衡试验及反射实验4个部分，该量表总分为18分，正常大鼠为0分，评分结果越低，表明神经运动功能恢复越好，反之评分越高，表明症状越重。每次实验测试3次，间隔10 min以上，取3次结果的平均值。
1.4.5 RT-PCR检测细胞移植后2周，每组取5只大鼠的脑梗死区组织(100 mg/只)制备匀浆，参考文献[16]采用Trizol法提取总RNA，RT-PCR反应按Promega公司反应试剂盒说明书进行。内参照ß-actin上游引物为5’-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3’，下游引物为5’-CTC AGC CTT GAC TGT GCC-3’，扩增片段长度为151 bp；脑源性神经生长因子的上游引物为5’-CAC TCT GAC CCT GCC CGC CGA G，下游引物为5’-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AG-3’，扩增片段长度为 430 bp；生长相关蛋白43的上游引物为5’-GCA GGA CGA GGG TAA AGA -3’，下游引物为5’-CAC GCA CCA GAT CAA ATA A-3’，扩增片段长度为374 bp；反应条件为：94 ℃行预变性1 min，94 ℃变性50 s、60 ℃退火60 s、72 ℃延伸1 min进行反应，经30个循环后，再以72 ℃延伸6 min。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶自动成像及分析系统，观察mRNA条带表达的吸光度值。
1.4.6 TUNEL法染色细胞移植2周，各组随机取5只大鼠脑梗死区组织，切片经石蜡包埋、脱蜡水化后，PBS漂洗 5 min×3，用37 ℃的蛋白酶K处理切片。将0.3% Triton PBS配制的含体积分数为3%羊血清的通透液滴加到载玻片上脑片区域，将整个脑片覆盖住，4 ℃下孵育20 min。将TUNEL Ⅰ和Ⅱ液按1︰9混合滴于铺片上，37 ℃恒温箱内孵育2 h。利用荧光抗体37 ℃孵育1 h，PBS漂洗5 min×3，然后滴入固红呈色液，避光反应约58 min后停止。PBS充分洗涤5 min后，终止反应，实验重复3次，甘油封固剂对盖玻片封固，光镜下观察照相。
1.4.7 BrdU免疫组化染色细胞移植后2周，各组随机取5只大鼠脑梗死区组织，用免疫组化法进行BrdU染色，DAB显色，于光学显微镜下观察，细胞胞核呈棕黄色即可判定为阳性细胞。在镜下每个盖玻片上随机取5个视野，进行细胞计数，并拍照记录，计算出阳性细胞数的平均值。
1.5 主要观察指标 ①大鼠神经功能评分。②脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43 mRNA表达。③凋亡细胞数目。④BrdU阳性细胞数。
1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以x(_)±s表示。多组间比较采用单因素方差分析法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着骨髓间充质干细胞研究的迅速发展，关于骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的研究也获得了众多成果^[17-18]。许多研究均表明，骨髓间充质干细胞具有取材方便、可自体移植、免疫原性低、不受伦理限制、能转染和表达外源性基因、长期存活于宿主细胞、可向多种细胞分化、能通过血脑屏障等多种优点，其可发挥促进脑梗死后神经功能恢复的作用，被认为是治疗脑梗死的理想载体细胞^[19-20]。有研究表明，骨髓间充质干细胞在脑梗死发生后能被动员到外周循环血，随之迁移到脑梗死区域，参与梗死灶的神经功能缺损修复^[21]。研究报道，动员骨髓间充质干细胞的因素除了有生长因子、趋化因子、黏附分子等重要成分，还包括组织损伤、外因干预等多种因素^[22-23]。“干细胞循环”理论与中医理论中的“活血化瘀”法与有相通之处，银杏达莫注射液是从中药银杏叶中提取的复方制剂，能清除自由基、改善血液循环^[24-26]。因此，本研究联合银杏达莫注射液与骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑梗死。
研究发现，银杏达莫可清除自由基、降低细胞间黏附分子1的黏附性，进而提高骨髓间充质干细胞的数量，促进骨髓间充质干细胞更多的向梗死区域迁移^[27-28]。王雪松等^[29]研究发现，银杏达莫能够明显减轻脑缺血后的炎性损害，为骨髓间充质干细胞向梗死区域迁移营造良好的微环境。另有研究表明多种活血化瘀药可通过多靶点协同干细胞动员骨髓间充质干细胞，并促进干细胞迁移到受损组织中，提高蛋白的表达、减少梗死面积^[30]。银杏达莫发挥活血化瘀机制可能与其提高相关蛋白的表达水平相关。研究发现脑源性神经生长因子在脑神经的恢复中发挥关键作用，生长相关蛋白43是构建中枢神经系统可塑性的基本物质，亦是研究神经生长及损伤修复的首选分子标记物^[31]。
本研究通过RT-PCR检测梗死组织脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43 mRNA的表达，结果显示，在联合治疗组中的脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43 mRNA的表达明显高于细胞移植组及对照组，可能与银杏达莫发挥作用有关。将骨髓间充质干细胞与银杏达莫有效结合，通过TUNEL法检测发现，联合组中的凋亡细胞数目明显少于细胞移植组及对照组，免疫组化法观察到联合组的BrdU阳性细胞数量明显高于细胞移植组及对照组，且在移植后的7，14 d大鼠神经功能缺损评分联合组低于细胞移植组及对照组，表明二者的联合应用可以对脑梗死大鼠神经功能恢复发挥作用。