脂多糖激活基质金属蛋白酶表达诱导MC3T3-E1细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.24.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：基质金属蛋白酶及其抑制剂是一种含Zn+的蛋白水解酶，参与了多种组织的细胞外基质降解与组织重塑过程。
目的：观察基质金属蛋白酶在脂多糖诱导的MC3T3-E1细胞增殖中的参与作用。
方法：MC3T3-E1细胞随机分为4组：对照组、脂多糖低剂量组(1 μmol/L)、脂多糖中剂量组(10 μmol/L)和脂多糖高剂量组(100 μmol/L)。分析各组细胞的细胞增殖率，并检测基质金属蛋白酶2，3，9及基质金属蛋白酶组织抑制因子1，2的表达。
结果与结论：脂多糖处理MC3T3细胞后细胞的增殖率明显增强，且具有时间依赖性和浓度依赖性，且处理后基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达均明显增强，差异有显著性意义。结果提示，基质金属蛋白酶表达的增强参与了脂多糖诱导的MC3T3-E1细胞增殖过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 骨细胞, 脂多糖, 基质金属蛋白酶, 抑制剂, 增殖, 成骨细胞

Abstract:

BACKGROUND: Matrix metalloproteinases and their inhibitors are proteolytic enzymes contaning Zn+, and involved in extracellular matrix degradation and tissue remodeling of a variety of tissues.
OBJECTIVE: To observe the effects of matrix metalloproteinases in the proliferation of MC3T3-E1 cells induced by lipopolysaccharide.
METHODS: MC3T3-E1 cell line was divided into four groups randomly: control group, low-dose lipopolysaccharide group (1 μmol/L), moderate-dose lipopolysaccharide group (10 μmol/L), and high-dose lipopolysaccharide group (100 μmol/L). The proliferation rate in each group was analyzed. Matrix metalloproteinase 2, 3, 9 and matrix metalloproteinase inhibitor 1 and 2 expressions were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The proliferation rate was increased greatly after medication of lipopolysaccharide in time-dependent and concentration-dependent manners. Moreover, the expressions of matrix metalloproteinases and their inhibitors were apparently enhanced, and showed significant differences. Results indicate that the enhanced expressions of matrix metalloproteinases participated in the proliferation of MC3T3-E1 cells induced by lipopolysaccharide.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Lipopolysaccharides, Matrix Metalloproteinases, Osteoblasts

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

骨重建是骨组织形态和密度随着生物力学环境的改变而发生改变的生理现象，骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨^[1-2]。在骨修复重建的过程中，最早分化形成的细胞是成纤维细胞，它沿着增殖的血管芽侵入机化的血肿内，所分泌的Ⅲ型胶原构成骨痂中的纤维成分^[3-4]。随后通过原始间充质细胞向软骨细胞分化和软骨细胞增殖，在骨折端紧密接触的部分，骨重建单位可直接跨越骨折线，无内、外骨痂形成。
基质金属蛋白酶及其抑制剂是一种含Zn+的蛋白水解酶，参与了多种组织的细胞外基质降解与组织重塑过程。目前已发现和纯化的基质金属蛋白酶至少有20种，已证实基质金属蛋白酶在机体很多组织的发育和修复、肿瘤发生发展、炎症反应等过程中发挥着重要的作用^[5-7]，其中多种基质金属蛋白酶的过度表达与骨疾病相关，如骨关节炎、类风湿性关节炎等，而且基质金属蛋白酶能够通过启动骨吸收、重塑细胞外胶原基质等方式在骨发育和骨重建中发挥着重要的作用^[8]。
已有大量实验证明基质金属蛋白酶13可以强有力的降解软骨基质的主要成分——Ⅱ型胶原，除此之外，基质金属蛋白酶13还可降解软骨基质中的蛋白多糖、Ⅳ型和Ⅸ型胶原蛋白、骨粘连蛋白及软骨基底膜聚糖，在骨关节炎的发生发展中起到重要作用，近几年许多关于基质金属蛋白酶13抑制剂的研究给骨关节炎的治疗带来了新希望^[9]。也有研究总结基质金属蛋白酶14在骨关节炎患者滑膜、滑液中的表达及意义，实验证明基质金属蛋白酶14在骨关节炎滑膜中呈高表达，在骨关节炎的发生及发展过程中可能起促进作用；在滑液中低表达，说明骨关节炎发生时基质金属蛋白酶14未大量释放至滑液，间接表明基质金属蛋白酶14的主要功能于滑膜细胞中表达并促进骨关节炎的发展^[10]。脂多糖是革兰阴性菌细胞壁的重要成分，并且多对宿主具有毒性，容易引起机体发热、微循环障碍、脂多糖休克及弥漫性血管内凝血等病理变化^[11-12]，但它也是生物活性中心，是一种免疫增强剂，常用于细胞的增殖与抑制。MC3T3-E1细胞系小鼠胚胎成骨细胞类，成纤维细胞样，有多个亚克隆，是体外研究成骨细胞分化的以及ECM信号通路作用的良好模型^[13-14]。实验旨在揭示基质金属蛋白酶在脂多糖诱导的MC3T3-E1细胞增殖中的参与作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计：分组对照细胞学实验。
时间及地点：实验于2012年6月到2013年12月在成都医学院第一附属医院完成。
材料：

脂多糖通过激活基质金属蛋白酶表达诱导MC3T3-E1细胞增殖实验所用试剂：
细胞、试剂与仪器	来源
MC3T3-E1细胞	成都医学院第一附属医院
青霉素、链霉素及MTT	Sigma Aldrich公司
基质金属蛋白酶抗体	美国Santa Cruz公司
二抗及显色试剂盒	武汉博士德公司
酶标仪	美国Biotek公司
荧光定量PCR	美国罗氏
电泳仪及转膜仪	美工BioRad公司

实验方法：
MTT试验检测细胞增殖率：将MC3T3-E1细胞接种至96孔细胞培养板中进行培养至融合状态。在各组细胞中加入不同浓度(低剂量1 μmol/L，中剂量10 μmol/L和高剂量100 μmol/L)的脂多糖后培养24，48及72 h，对照组细胞给予溶剂处理，弃去细胞培养液并加入20 μL MTT培养 240 min。然后在每个培养孔中加入二甲基亚砜150 μL充分振荡溶解，用酶标仪检测各个细胞培养空的吸光度，并计算细胞增殖的增殖率。增殖率=100%-(对照组吸光度-试验组吸光度)/对照组吸光度×100%。
荧光定量PCR检测基因表达：荧光定量PCR(qRT- PCR)的扩增体系为2×qPCR Mix 5 μL，上游和下游引物各10 pmol，模板cDNA 2 μL，dH2O 1 μL，共10 μL。反应条件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，共28个循环。熔解曲线鉴定各组细胞相关基因qRT-PCR产物，并用公式(ΔCt) 进行定量分析。ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct。
Western Blotting：各组MC3T3-E1细胞于冰水浴中进行充分匀浆，考马斯亮蓝法蛋白定量后以等量蛋白进行SDS-PAGE和半干法转膜。转至硝酸纤维素膜上后5%脱脂牛奶封闭1 h。然后与一抗室温条件下温孵过夜，PBS漂洗3次后与HRP标记二抗(1∶200)室温反应1 h，显色。用凝胶成像分析系统测定吸光度，以β-actin作为参照，进行蛋白表达的定量分析。
主要观察指标：①MTT法检测脂多糖对MC3T3-E1细胞增殖的促进作用。②PCR法检测基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶3/基质金属蛋白酶9基因表达。③免疫印迹法检测基质金属蛋白酶抑制剂蛋白表达。④2.4q-PCR分析药物干预前后TIMP1/2的表达。
统计学分析：数据统计采用SPSS 17.0统计软件完成，计量资料用单因素方差分析，用x±s表示，计数资料采用卡方检验。P < 0.05被认为组间差异有显著性意义。

讨论

骨重建是骨骼的密度、形状随时间的变化而变化的一种骨组织自身替代机制。骨重建一般包括骨组织形成与骨组织吸收两方面。在骨重建过程中，MC3T3-E1是发挥重要作用的一类细胞^[15]。本文在研究基质金属蛋白酶在脂多糖诱导的MC3T3-E1细胞增殖中的参与作用时发现，脂多糖处理MC3T3细胞后细胞的增殖率明显增强，且具有时间依赖性和浓度依赖性，处理后基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达均明显增强，具有显著的统计学差异性。因此，基质金属蛋白酶表达的增强参与了脂多糖诱导的MC3T3-E1细胞增殖过程。
现已证明有多种基质金属蛋白酶参与了骨基质的吸收过程，包括基质金属蛋白酶1，2，3，9，10，13以及MT1-MMP和MT2-MMP等[16]。王维山等[17]检测骨关节炎患者关节液中尿激酶型纤溶酶原激活物和基质金属蛋白酶3，9，13，14的含量，探讨其与骨关节炎关节功能、疼痛评分之间的相关性，spearman相关分析显示尿激酶型纤溶酶原激活物与基质金属蛋白酶3、uPA与基质金属蛋白酶13、基质金属蛋白酶3与基质金属蛋白酶13表达水平均呈正相关，尿激酶型纤溶酶原激活物、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶14表达水平无相关关系(P > 0.05)。uPA、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13均与关节功能评分呈现正相关关系(P < 0.01)，基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶14与关节功能评分之间无相关关系。
在诸多基质降解酶系中，尿激酶型纤溶酶原激活物、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13的表达与膝骨关节炎临床症状较为密切，尤其是基质金属蛋白酶13的作用更加显著。周磊等^[18]研究发现类风湿关节炎患者基质金属蛋白酶3的mRNA表达水平高于健康对照人群，活动期类风湿关节炎患者基质金属蛋白酶3的mRNA表达水平高于非活动期的患者。李立新等^[19]研究则认为类风湿关节炎患者血清类风湿因子、抗CCP抗体和基质金属蛋白酶3含量均明显高于健康志愿者，活动期类风湿关节炎的血清类风湿因子和基质金属蛋白酶3含量显著高于稳定期类风湿关节炎(P < 0.05)。随着类风湿关节炎患者骨关节损伤逐渐加重，血清C反应蛋白、抗CCP抗体与基质金属蛋白酶3的表达都逐渐增高，但仅基质金属蛋白酶3的增加有统计学意义(P < 0.05)，类风湿关节炎患者的血清基质金属蛋白酶3与C反应蛋白、类风湿因子有较强的正相关，并与关节损伤程度呈正相关。
贺占坤等[20]研究膝关节骨性关节炎患者关节液中基质金属蛋白酶2，3，9和基质金属蛋白酶组织抑制剂1四种蛋白水平，并探讨其与关节损伤程度及患者预后的关系。实验结果表明膝关节骨关节炎患者关节液中基质金属蛋白酶2，3，9和基质金属蛋白酶组织抑制剂1的含量均明显高于对照组(P < 0.01)。关节液中基质金属蛋白酶2，3，9和基质金属蛋白酶组织抑制剂1的含量与关节软骨损伤程度呈正相关，随着病情的好转，关节液中基质金属蛋白酶2，3，9和基质金属蛋白酶组织抑制剂1的含量也随之降低。结论检测关节液中基质金属蛋白酶2，3，9和基质金属蛋白酶组织抑制剂1水平对膝关节骨关节炎的早期诊断、病情程度判断、预后评价有一定的意义。
另外，在一些动物实验中，分析体外冲击对大鼠膝骨关节炎中基质金属蛋白酶表达影响的研究中证实，模型组大鼠中基质金属蛋白酶1/3/13的表达均明显高于对照组大鼠，且具有显著的统计学差异性，而体外冲击波组上述蛋白的表达异常得到显著的恢复，表明体外冲击波改善骨关节炎主要通过抑制关节软骨中基质金属蛋白酶的异常表达[21]。在研究骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶表达的影响中也发现，骨桥蛋白可以明显增强人膝关节炎软骨细胞中基质金属蛋白酶13的表达，且具有浓度依赖性和时间依赖性[22]。茹江英等[23]研究也证实，尿胰蛋白酶抑制剂可以明显抑制核因子KB受体活化因子配体诱导破骨细胞活法过程，且此过程是由降低基质金属蛋白酶的表达及活性实现的。在分析基质金属蛋白酶14在骨关节炎滑膜及滑液中的表达的研究中表明，基质金属蛋白酶14在骨关节炎滑膜中呈现高表达，在在骨滑液中呈现低表达，表明基质金属蛋白酶14可能在促进骨关节炎的发生中发挥重要作用^[24]。
脂多糖是革兰阴性菌细胞壁外膜中的重要组成成分，在革兰阴性细菌感染及疾病演化中有重要作用，被认为是造成全身性炎症综合征的主要原因，同时脂多糖又具有复杂的生物学活性，是一种免疫增强剂^[25]。研究表明，脂多糖与细胞膜上相应受体作用后，启动胞内信号传递链，引起核因子κB等活化，启动基因转录，表达和释放多种细胞因子，发挥其毒性作用。而微量的脂多糖能够活化单核巨噬细胞系统，促进细胞因子释放，促进补体的活化和抗体的产生，对特异性免疫反应具有调节作用[26]。蔡淑娜等[27]研究显示，脂多糖能够诱导MC3T3-E1中基质金属蛋白酶13高表达，促进核因子κB、C/EBPβ、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达和活化，抑制核因子κB表达；Bay11-7082干预及siRNA沉默肿瘤坏死因子α表达能有效抑制MC3T3-E1中肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶13的表达，而siRNA沉默C/EBPβ和白细胞介素6表达对MC3T3-E1中基质金属蛋白酶13的表达无明显影响，说明脂多糖通过核因子κB/肿瘤坏死因子α诱导基质金属蛋白酶13在成骨细胞MC3T3-E1中高表达。
本研究中也发现，脂多糖诱导的MC3T3-E1细胞增殖过程伴随着基质金属蛋白酶2，3，9的增强表达，提示基质金属蛋白酶的上调表达参与了脂多糖诱导的MC3T3-E1细胞增殖过程。基质金属蛋白酶抑制剂也参与了组织的多种生理过程。基质金属蛋白酶组织抑制因子是基质金属蛋白酶的特异性抑制剂，目前一件别处4种，包括基质金属蛋白酶组织抑制因子1，基质金属蛋白酶组织抑制因子2，基质金属蛋白酶组织抑制因子3，基质金属蛋白酶组织抑制因子4。基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制因子二者比例可作为反映疾病活动程度及预后的重要指标^[28-29]。已有的研究证实，基质金属蛋白酶组织抑制因子3蛋白在骨巨细胞瘤中呈现高表达，提示其可能与肿瘤的血管形成、细胞增殖有关^[30]。另外，在探讨维药买朱尼与骨关节炎大鼠关节软骨基质金属蛋白酶组织抑制因子1相关性研究中也发现，买朱尼可以通过上调基质金属蛋白酶抑制剂的表达发挥对软骨的保护作用^[31]。文章的研究结果也发现，脂多糖能明显上调MC3T3-E1细胞系中基质金属蛋白酶组织抑制因子1和基质金属蛋白酶组织抑制因子2蛋白的表达水平，表明基质金属蛋白酶抑制剂也参与了脂多糖诱导的细胞增殖过程。
因此，基质金属蛋白酶及其抑制剂表达的增强参与了脂多糖诱导的MC3T3-E1细胞增殖过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程