缺氧诱导因子1a基因转染心脏干细胞修复坏死心肌：应用前景

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.024

摘要/Abstract

摘要：

背景：心脏干细胞移植到心肌梗死区，可以有效改善心室重塑，提高心脏功能，但移植细胞在梗死区的缺氧微环境中存活率较低。研究表明缺氧诱导因子1α可在缺氧条件下稳定表达，同时增加心肌细胞的活性及存活能力。
目的：分别从心脏干细胞的特点，缺氧诱导因子1α保护心脏的作用机制，载体的选择及移植途径等方面来具体阐述缺氧诱导因子1α基因转染心脏干细胞治疗心肌梗死的研究进展。
方法：应用计算机检索CNKI和PubMed数据库中2000年1月至2015年1月关于心脏干细胞和缺氧诱导因子1α的文章，在标题和摘要中以“心脏干细胞、缺氧诱导因子1α、移植途径”或“Cardiac stem cells, Hypoxia Inducible Factor 1(HIF-1a), gene delivery”为检索词进行检索，最终选择关于心脏干细胞、缺氧诱导因子1、基因载体的37篇文献进行综述。
结果与结论：多项研究证实缺氧诱导因子1α可以在缺氧的环境中提高心脏干细胞的生存率。大量动物实验证实了心脏干细胞和缺氧诱导因子1α对梗死缺氧区域具有保护和修复作用。目前缺氧诱导因子1α基因转染心脏干细胞尚未有成功的报道，但并不影响研究者对相关领域的探索，相信在不久的未来，基因修饰心脏干细胞将会在临床得到广泛应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 诱导, 心脏干细胞, 缺氧诱导因子, 心肌梗死, 细胞移植, 基因载体, 基因转染

Abstract:

BACKGROUND: Cardiac stem cells transplanted to the myocardial infarction area can effectively improve ventricular remodeling and promote heart function. But the survival rate of transplanted cells is lower in the infracted area under hypoxic microenvironment. Hypoxia inducing factor 1 alpha under anoxic conditions can stably express, and meanwhile increase the activity and survival ability of myocardial cells.
OBJECTIVE: To elaborate the research progress in hypoxia inducing factor 1 alpha-transfected cardiac stem cells for treatment of myocardial infarction from the following aspects: cardiac stem cell characteristics, mechanism underlying myocardial protection of hypoxia inducing factor 1 alpha, selection of carriers and transplantation approach.
METHODS: A computer-based search of CNKI and PubMed was performed for articles related to cardiac stem cells and hypoxia inducing factor 1 alpha published from January 2000 to January 2015. The keywords were “cardiac stem cells, hypoxia inducible factor 1(HIF-1a), gene delivery” in Chinese and English, respectively, which appeared in the title and abstract. Finally, 37 relevant articles were enrolled in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Several studies have confirmed that hypoxia inducing factor 1 alpha can improve the survival rate of cardiac stem cells under anoxic conditions. Increasing evidences from animal experiments have shown that cardiac stem cells and hypoxia inducing factor 1 alpha exert protective and repairing effects on myocardial infarction. Currently, there is no successful report about hypoxia inducing factor 1 alpha gene transfection of cardiac stem cells, but relevant studies are proceeding. Gene modified cardiac stem cells are expected to be widely used in clinic.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Heart, Myocardial Infarction, Hypoxia-Inducible Factor 1, alpha Subunit, Stem Cell Transplantation

中图分类号:

R318

李沙，李树仁，张倩辉. 缺氧诱导因子1a基因转染心脏干细胞修复坏死心肌：应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3750-3754.

Li Sha, Li Shu-ren, Zhang Qian-hui. Hypoxia inducing factor 1 alpha-transfected cardiac stem cells in repair of necrotic myocardium [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3750-3754.

图/表（结果） 3

2.1 成体心肌干细胞的特点及修复机制
2.1.1 心肌干细胞的生物学特性与分布成年哺乳动物心脏内存在心肌干细胞巢，在心房和心尖部位分布较多，心肌干细胞除存在于心肌干细胞巢外，也有少数分散在心肌中，心脏受到损伤刺激后，能够迅速向损伤部位迁移、分化产生心肌细胞。心肌干细胞的主要生物学特性包括：①克隆能力。②有多能性和能够自我更新。③能够分化为成熟的心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞等心脏结构细胞。④可在损伤心肌局部激活、迁移^[2]。
2.1.2 心肌干细胞的表面标志成体心肌干细胞的细胞膜上能够表达一种或多种干细胞相关抗原，如干细胞因子受体(C-kit+)、P-糖蛋白(MDR+)和干细胞抗原1(Sca-1+)等多能干细胞表面标记物，同时谱系标志物阴性，且在一定条件下能够分化为各种心肌细胞的未分化细胞^[3]，组织来源十分广泛，具有很强的可塑性^[4]。
2.1.3 心肌干细胞的分类与功能心脏中的成体心肌干细胞主要分化为心肌细胞，也可分化为血管内皮细胞及平滑肌细胞。根据心肌干细胞的表面标志特征，可分为以下几种主要的细胞类型。
c-kit+细胞：c-kit+细胞是心肌组织中含量最多的干细胞类型。Beltrami等^[5]将c-kit+细胞植入大鼠心肌梗死部位10 d后发现，c-kit+细胞分化为成熟的心肌细胞，表达心肌特异性肌球蛋白重链(MHC)、心肌横纹蛋白等，梗死区血管密度增加，心功能改善。另外Rota等^[6]将c-kit+细胞于心肌内移植5周后行心脏超声检查，也发现心功能改善，左室射血分数升高，心肌梗死面积减少。2007年Bearzi等^[7]分离纯化出C-kit+心肌干细胞，并发现这些细胞具有自我更新，生成集落和向心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞分化的特性。干细胞因子/c-kit信号还可以通过激活MAPK系统介导心脏干细胞迁移^[8]。
Sca-1+细胞：是指细胞膜表面携带干细胞抗原1(Sca-1)的心肌前体细胞，可分化为有功能的心肌细胞^[9]。Matsuura等^[10]用免疫磁珠分选技术从小鼠中获得Sca-1+细胞，催产素诱导后约有1%转化为搏动性心肌细胞，并表达心肌特异蛋白Cx43、α-肌动蛋白、心肌肌钙蛋白等。将该细胞植入小鼠心肌梗死区，可减轻梗死后心室重塑，促进心肌再生及功能修复。人类不含Sca-1基因，目前人的心肌中这些直系同源的Sca-1细胞的组织来源尚未可知。
SP细胞：是一类心肌前体细胞，可分化为成熟心肌细胞。Hierlihy等首次发现在新生小鼠心肌中存在SP细胞，约占心脏细胞的1%。随后Oyama等发现，使用催产素等可将其诱导为功能性心肌细胞，改善心肌结构与功能。也有实验发现，冠状动脉结扎后小鼠心肌内SP细胞大量减少，7 d后回升至基线水平以上，参与心肌修复^[11]。
Isl1+细胞：是胚胎心脏发育中重要的原始干细胞，与新生心肌细胞共培养能分化成熟心肌细胞，也能分化为血管内皮、心内膜、平滑肌、传导系统、右室及左房细胞谱系^[12]。新生个体中Isl1+细胞存在普遍，但在成熟哺乳动物的心脏中存在较少，目前仅在右房发现，生理功能尚不清楚。
2.1.4 心肌干细胞修复受损心肌的机制多项动物研究发现移植后的心肌干细胞不仅能向肌源性血管分化，还可释放多种有益的旁分泌因子，促进心肌再生、诱导内皮细胞迁移及保护心肌细胞^[13-14]。
鉴于动物实验获得的可喜成果，心肌干细胞Ⅰ期临床试验也在陆续开展，其中较为引人关注的有SCIPIO研究^[15]和CADUCEUS研究^[16]，二者均证实心肌干细胞移植治疗心肌梗死是安全可行的。SCIPIO的研究结果显示：急性心肌梗死患者在接受经冠状动脉移植心肌干细胞后，心肌梗死面积减少、心功能得以改善。
2.2 缺氧诱导因子1保护心脏的作用机制急性心肌梗死区微环境是非常恶劣的缺血缺氧的环境，对心肌干细胞生存、功能以及分化都非常不利，近来研究发现，普遍存在于人和哺乳动物细胞内的缺氧诱导因子1α可在缺氧条件下稳定表达，同时增加心肌细胞的活性及存活能力。缺氧诱导因子1在心脏中的保护作用最初是由Cai提出^[17]。缺氧诱导因子1是具有转录活性的核蛋白，具有广泛的靶基因谱，能够控制下游100多种基因的表达^[18](图1)，包括血管内皮生长因子、葡萄糖转移酶1、酪氨酸激酶等，这些基因表达后参与血管生成，参与糖的代谢和细胞凋亡等过程，维持组织、细胞在缺氧条件下内环境的稳定^[19]。
2.2.1 心肌梗死后缺氧诱导因子1对血管新生的影响缺氧条件下，缺氧诱导因子1在血管生成作用当中起到核心调节因子的作用。缺氧诱导因子1能够控制下游多种基因的表达^[18]，包括血管内皮生长因子，其不但能促进血管生成，还能激活心肌内源性修复机制，减少梗死部位的炎症反应^[20]。在培养心肌细胞时，缺氧诱导因子1α基因表达形成的各种细胞因子可通过旁分泌机制增加心肌梗死区血管生成相关基因的表达。Xu等^[21]报道缺氧诱导因子1α可直接调控SENP-1转录，从而形成一个正反馈，作用于缺氧的血管内皮细胞，可增加血管内皮生长因子的表达和血管生成。在缺氧条件下，缺氧诱导因子1在内皮细胞中积聚，并与血管内皮生长因子基因启动子结合从而诱导后者的表达^[22]。

2.2.2 心肌梗死后缺氧诱导因子1对能量代谢影响缺氧诱导因子1能够调节葡萄糖有氧代谢和无氧酵解之间的平衡^[23]。目前已经证实，葡萄糖转运蛋白、己糖激酶1和2、6-磷酸果糖激酶-2等都受到缺氧诱导因子1的调控，其中己糖激酶2在细胞的糖代谢中占据至关重要的地位^[24]。在缺氧状态下，细胞的糖代谢由线粒体的有氧氧化转变为无氧糖酵解，并伴随有线粒体呼吸作用的减弱及细胞内乳酸的堆积，这些变化受到缺氧诱导因子1的调控，保持细胞内ATP的水平，从而改善心脏干细胞在心肌缺血及梗死区的存活能力。缺氧时，缺氧诱导因子1还通过激活丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)基因从而抑制细胞的新陈代谢^[25]，降低心肌耗氧量，提高心肌存活率。此外有实验证实，低氧可以上调HepG2细胞能量代谢相关基因表达，缺氧诱导因子1的转录调节作用可能是其重要环节。
2.2.3 心肌梗死后缺氧诱导因子1对心肌凋亡的影响在缺氧环境中，心肌细胞会发生凋亡。在对抗缺氧诱导的细胞凋亡中占据关键地位的基因(如bcl-2家族)，受到缺氧诱导因子1的调控。缺氧诱导因子1α基因表达形成的各种细胞因子可通过旁分泌机制增加心肌缺血区对抗细胞凋亡基因的表达。缺氧诱导因子1α对机体的调控主要发生在PI-3K/Akt依赖的缺氧诱导因子1α蛋白稳定性调控和MEK/MAPK介导的缺氧诱导因子1α反式激活功能调控两条信号途径中，这两条信号传导途径独立又协调地调控着缺氧诱导因子1α的转录活性[26]，其中PI-3K/Akt/HIF通路的激活促进抗凋亡因子同时抑制促凋亡因子的表达，降低细胞凋亡率，从而提高缺氧区细胞的增殖率。有报道，在缺氧导致的细胞凋亡过程中出现caspase-3的激活、促凋亡基因(如bax)表达上调以及抗凋亡基因(如bcl-2)表达下调，这些相关通路也受到缺氧诱导因子1的调控，从而缺氧诱导因子1发挥抗凋亡的作用^[27-29]。同一研究还发现在缺氧状态细胞膜钙内流增加，而缺氧诱导因子1α可以抑制这一现象^[29]。在细胞内钙超载时，导致线粒体膜电位的破坏和功能障碍，线粒体肿胀，功能失调，甚至引起细胞死亡。
2.3 基因修饰载体的选择基因修饰联合细胞移植被证明是治疗多种疾病的有效方法，基因治疗中载体的选择是影响目的基因能否发挥治疗作用的关键。常用的表达载体包括病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体的应用更为广泛。

2.3.1 病毒载体目前病毒载体的种类较为丰富，包括反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等(表1)。

2.3.2 非病毒载体对人体而言非病毒载体相对安全，没有载体容量限制，化学结构可控制，易于大量制备，在表达质粒、反义寡核苷酸或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中有着病毒载体不可替代的作用。然而，非病毒载体的转导效率低，目的基因只能实现瞬间表达，其运送系统的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。在非病毒转染方法中，电穿孔、微量电穿孔及核转染是目前最有效的转染方法。进年来，纳米微粒在基因转染中的作用也越来越受关注^[30]。其中piggyBac转座子是干细胞转染中最为活跃的载体[31]，已被用于构建小鼠及人类的诱导多能干细胞^[32]，是转染哺乳动物细胞较为适宜的载体。
2.4 移植途径的探索有效的干细胞移植途经应该是将足够数量的细胞移植至心脏靶区，并保证细胞较高的定植率及存活率。常用干细胞移植途径包括经静脉、经冠状动脉、心肌内注射和经冠状窦注射等^[33-34](表2)。

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